CN104004684A - 一株多环芳烃降解菌s8-t8-L9及其应用 - Google Patents

一株多环芳烃降解菌s8-t8-L9及其应用 Download PDF

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一株多环芳烃降解菌s8-t8-L9及其应用，涉及环境污染物生物处理。所述一株多环芳烃降解菌(Bacillus sp.)s8-t8-L9，登记入册编号为CGMCC No.9032。可在降解各种有机化合物中应用。所述有机化合物为多环芳烃类化合物，所述多环芳烃类化合物包括但不限于萘，菲，芘等化合物。该菌含有与多环芳烃相关的基因。这些基因在该菌降解多环芳烃时发挥重要作用。该菌能够利用混合PAHs，萘，菲，芘等多环芳烃以及柴油作为唯一能源和碳源生长繁殖，该菌20天能将无机盐培养基中的混合PAHs，萘，菲，芘，柴油降解57.94％，58.46％，52.14％，23.14％，47.54％。

Description

一株多环芳烃降解菌s8-t8-L9及其应用
技术领域
本发明涉及环境污染物生物处理，尤其是涉及一株多环芳烃降解菌s8-t8-L9及其应用。
背景技术
多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs)是分子中含有两个以上苯环的碳氢化合物，包括萘、蒽、菲、芘和苯并芘等在内的150余种。它们化学结构十分稳定，不易挥发(蒸气压：0.0015×10-9～0.0051mm Hg,25℃)，难溶于水(0.00014～2.1mg/L,25℃)，熔沸点高(>100℃)(Sato H,Aoki Y.Mutagenesis by environmental pollutants and bio-monitoring ofenvironmental mutagens[J].Curr Drug Metab.2002,3(3):311-319；Phillips DH.Fifty years ofbenzo(a)pyrene[J].Nature.1983,303(5917):468-472；Sternberg SS.The carcinogenesis,mutagenesis and teratogenesis of insecticides.Review of studies in animals and man[J].Pharmacology&Therapeutics.1979,6(1):147-166.)。高环多环芳烃(四个环以上)具有“三致”用，即：“致畸”、“致癌”和“致突变”作用。美国环境保护局列出地优先治理污染物黑名单中就包括16种PAHs，其中7种是可能的致癌物质，而苯并芘是第一个被发现的环境化学致癌物(Autrup H,Harris CC,Trump BF et al.Metabolism of benzo(a)pyrene and identification of themajor benzo(a)pyrene-DNA adducts in cultured human colon[J].Cancer Res.1978,38(11Pt1):3689-3696.)。
海洋中PAHs的主要行为有挥发、与沉积物互作和生物积累。挥发过程取决于PAHs的蒸气压和溶解度等特征，蒸气压越低挥发率越低，发生挥发作用的PAHs主要是两环的，四环以上的PAHs的挥发作用是很小的；由于PAHs的憎水性使得它易于分配进入富含有机物的沉积物和颗粒物，这给微生物对PAHs降解造成了困难；生物积累其实也是一个PAHs在水和有机物之间平衡分配过程，由于它的高脂溶性，所以易被水生生物吸收(林颖,蔡容华.芳香族化合物生物降解的研究进展[J].福建轻纺.2006,(002):6-10.)。在上世纪80年代就发现，将乌贼暴露于原油90d后，发现其组织中的主要PAHs与原油中相同，而萘的富集倍数高达150倍。1997年，俄罗斯油轮在日本海发生油的泄漏事故，在该漏油事件发生后的第1个月，该环境中一种鱼体内的PAHs迅速上升，但到第2个月该鱼体内PAHs浓度又恢复到原来的浓度。
微生物降解是海洋环境(尤其是沉积物环境)中PAHs去除的最主要途径，微生物降解分好氧降解和厌氧降解(Dua M,Singh,A.,Sethunathan,N.,Johri,A.K..Biotechnology andbioremediation:successes and limitations[J].ApplMicrobiolBiotechnol.2002,59(2-3):143-152.)。多数好氧降解限速步骤是第一步双加氧酶对苯环氧化生成二氢二醇，然后通过断裂加氧酶的作用使双羟基化的PAHs开环，生成中间产物儿茶酚或儿茶酸，再开环生成乙醛和琥珀酸进入三羧酸循环。白腐菌或木质素降解菌降解PAHs的第一步是通过过氧化氢或虫漆酶催化生成喹啉，而后苯环开裂生成羧酸。目前从海洋环境中分离到的好氧PAHs降解菌主要集中在以下菌属:Sphingomonas、Novosphingobium、Cyclocasticus、Neptunomonas、Pseudomonas、Marinobacter、Halomonas。
发明内容
本发明的目的是提供一株多环芳烃降解菌(Bacillus sp.)s8-t8-L9。
本发明的另一个目的是提供一株多环芳烃降解菌(Bacillus sp.)s8-t8-L9在降解各种有机化合物中的应用。
所述一株多环芳烃降解菌(Bacillus sp.)s8-t8-L9，已于2014年04月09日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，登记入册编号为CGMCC No.9032。多环芳烃降解菌(Bacillus sp.)s8-t8-L9来源于南大西洋的海底表层沉积物，经人工富集培养、分离纯化得到。该菌为革兰氏染色阳性的芽孢属(Bacillus sp.)的菌株s8-t8-L9，生物学特性为触酶阳性，氧化酶阳性，非发酵型，专性需氧，菌体形态为呈圆形，乳白色不透明，边缘规则，表面光滑凸起，无晕环，直径3～4mm。该菌的最适生长条件为：pH＝6.5～8.5，温度28～30℃。
所述一株多环芳烃降解菌(Bacillus sp.)s8-t8-L9可在降解各种有机化合物中应用。
所述有机化合物为多环芳烃类化合物，所述多环芳烃类化合物包括但不限于萘，菲，芘等化合物。
对所述多环芳烃降解菌(Bacillus sp.)s8-t8-L9进行基因组测序发现，该菌含有与多环芳烃相关的基因。这些基因在该菌降解多环芳烃时发挥重要作用。
实验证明，该菌能够利用混合PAHs，萘，菲，芘等多环芳烃以及柴油作为唯一能源和碳源生长繁殖，该菌20天能将无机盐培养基中的混合PAHs，萘，菲，芘，柴油降解57.94％，58.46％，52.14％，23.14％，47.54％。
附图说明
图1为s8-t8-L9在各种碳源中的降解率。
具体实施方式
实施例一：Bacillus sp.s8-t8-L9的分离与降解混合多环芳烃的性能
现场采集南大西洋的海底表层沉积物，采用100mL海水培养基加入萘、菲、芘混合多环芳烃在25℃180r/min条件下进行富集培养。两周后，在固体培养基(M2)中稀释涂布平板，得到多株纯菌，纯菌经过接种至液体培养基中验证其降解石油烃的能力，最后得到一株多环芳烃烃的高效降解菌s8-t8-L9，该菌经16S rDNA鉴定为芽孢菌属(Bacillussp.)。固体培养基(M2)的成分：乙酸钠5g/L,柠檬酸钠0.05g/L，普通肉汤培养基0.5g/L，蛋白胨0.1g/L，酵母粉0.1g/L，苹果酸0.05g/L，葡萄糖1g/L，蔗糖0.5g/L，硝酸铵1g/L，氯化铵0.2g/L，酒石酸钠0.05g/L，可溶性淀粉0.5g/L，琼脂粉15g/L，加海水至1L,调pH7.5，115℃高压蒸汽灭菌30min后补加1％体积已灭菌的KH2PO4溶液(10g/L,pH6.7)及0.1％体积0.22μm滤膜除菌的FeSO4(0.4g/L)。
将Bacillussp.s8-t8-L9接种至含萘、菲、芘混合多环芳烃的海水培养基中，在180r/min、25℃摇床中培养20天后，测定该菌对于混合多环芳烃的降解能力，经过测定得到，该菌对含萘、菲、芘混合多环芳烃的降解率为57.94％(图1)。
实施例二：Bacillus sp.s8-t8-L9单多环芳烃的降解性能测定
将Bacillus sp.s8-t8-L9接种至不同碳源(萘，菲，芘，柴油)的人工海水培养基(MMC)中，同时设置底空白对照(只加底物不加菌)，在180r/min、28℃摇床中培养20天后观察菌株的生长状况，并测定该菌对各底物的降解率。结果表明该菌株能够利用萘，菲，芘，柴油生长，降解率分别为58.46％、52.14％、23.14％、47.54％(见图1)。
人工海水培养基(MMC)：NaCl24g/L，MgSO4·7H2O7g/L，NH4NO31g/L，KCl0.7g/L，KH2PO42g/L，Na2HPO43g/L，pH7.4。灭菌后补加适量微量元素混合液，微量元素经0.22μM滤膜过滤除菌。
MMC微量元素混合液：CaCl2,2mg/L；FeCl3·6H2O,50mg/L；CuSO4,0.5mg/L；MnCl2·4H2O,0.5mg/L；ZnSO4·7H2O,10mg/L。
实施例三：Bacillus sp.s8-t8-L9相关芳香烃降解基因的应用
将Bacillus sp.s8-t8-L9进行基因组测序，从基因组中寻找与石油烃和芳香烃降解相关的基因，发现了与芳香烃降解相关的基因(表1)。
表1Bacillus sp.s8-t8-L9基因组中与石油烃和芳香烃降解相关基因
所述基因能在该菌对于芳香烃的降解起到重要作用。

Claims (6)

1.一株多环芳烃降解菌(Bacillus sp.)s8-t8-L9，于2014年04月09日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，登记入册编号为CGMCC No.9032。
2.如权利要求1所述一株多环芳烃降解菌(Bacillus sp.)s8-t8-L9在降解各种有机化合物中的应用。
3.如权利要求2所述应用，其特征在于所述有机化合物为多环芳烃类化合物。
4.如权利要求3所述应用，其特征在于所述多环芳烃类化合物包括但不限于萘，菲，芘等化合物。
5.如权利要求1所述一株多环芳烃降解菌(Bacillus sp.)s8-t8-L9，其特征在于其具有与多环芳烃降解相关的单加氧酶、P450基因；
表1Bacillus sp.s8-t8-L9基因组中与石油烃和芳香烃降解相关基因
所述基因见表1。
6.如权利要求5所述一株多环芳烃降解菌(Bacillus sp.)s8-t8-L9，其特征在于所述基因在降解芳香烃中应用。
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