CN105018458A - 复合微生物菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合微生物菌剂及其制备方法与应用。该复合微生物菌剂包括芽孢杆菌、包埋载体和交联剂，芽孢杆菌通过交联剂固定于所述包埋载体中。制备方法包括：将芽孢杆菌接种至含菲的培养基中好氧培养，得到菌液；将菌液浓缩，加至包埋载体中，得到含菌液的混合液，然后将含菌液的混合液逐滴滴入至交联剂中，进行交联硬化形成芽孢杆菌凝胶菌球；然后进行好氧培养，得到复合微生物菌剂。本发明的复合微生物菌剂，能在含高浓度Pb²⁺的情况下快速高效降解废水中的高浓度菲；制备方法具有工艺简单、生产成本低等优点。

Description

复合微生物菌剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及微生物制剂及废水处理领域，尤其涉及一种复合微生物菌剂、制备方法及其在去除废水中的高浓度菲的应用。

背景技术

随着城市化进程和工农业生产的快速发展，多环芳烃的污染已成为一类较为严重的环境污染问题，引起了世界各国的共同关注。焦化、炼油、冶金、食品加工等多项工业生产活动均能造成碳氢化合物的不完全燃烧，产生多环芳烃，在大气、水体、土壤中广泛存在，造成环境污染。多环芳烃具有较好的稳定性，难以被生物利用，能长久地存在于环境中。多环芳烃的疏水性和脂溶性决定了其易在生物体内富集，并随食物链的延长而出现生物放大的特点。由于多环芳烃具有致畸、致癌、致突变的“三致”效应的特性，对人类健康造成了极大的威胁。多环芳烃能引起细胞组织的自由基组成的破坏，损伤细胞DNA、酶等大分子和核糖体、线粒体等细胞器；同时也能引起生物系统内部的内分泌紊乱，造成隔代影响、免疫毒性等。因此，被多环芳烃污染的环境必须得到治理。菲是一种简单的低分子量多环芳烃，其具有的“湾”区和“K”区结构，与多环芳烃的致癌性有着密切的关系。以菲为模式化物质来研究多环芳烃的降解，能为其他的多环芳烃的去除提供重要的参考资料。

目前处理多环芳烃方法主要包括吸附解析法、UV光解法、植物修复法和微生物降解法等。与其他方法相比，微生物降解法因具有高效、经济的特点而受到越来越多的关注。研究发现，细菌、真菌、藻类等多种微生物均具有较强的降解能力，而细菌在大多数环境中发挥主要作用。芽孢杆菌是一类广泛存在于环境中的细菌，其来源丰富，且分泌的酶系众多，能促使芳环裂解，因此芽孢杆菌能作为生物降解剂用于菲的去除。但菲难溶于水，在水体中不易被芽孢杆菌附着而使得降解时间延长。同时菲对于芽孢杆菌也具有毒害作用，长时间大量接触会使得芽孢杆菌的活性减小，降解能力减弱，限制了其在实际工程中的应用。

铅是环境中常与菲共存的一种重金属，采用微生物降解菲的过程中，铅能通过影响细菌的生理生化方面的变化从而影响对菲的处理效果。高浓度的铅存在时，不仅能通过阻碍细菌细胞分裂抑制其生长，使得细菌数量减少，从而使得降解菲的酶总量减少而降低菲的处理效果；也能通过影响细菌的抗氧化系统，使之产生多种活性氧自由基，改变抗氧化保护酶类的活性，从而改变细菌的生理活性，降低对菲的处理效果。

因此，如何在高浓度铅存在的环境下，实现对菲快速高效降解成为目前急需解决的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能快速高效降解废水中的高浓度菲的复合微生物菌剂及其制备方法，还提供了一种制备工艺简单、生产成本低的复合微生物菌剂的制备方法，还提供一种操作条件简单、易于实施、应用范围广、成本低、效率高的该复合微生物菌剂在去除废水中的高浓度菲的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种复合微生物菌剂，所述复合微生物菌剂包括芽孢杆菌Bacillus sp.P1、包埋载体和交联剂，所述芽孢杆菌Bacillus sp.P1通过所述交联剂固定于所述包埋载体中，所述包埋载体为包括聚乙烯醇和海藻酸钠的混合溶液，所述交联剂为包括硼酸和CaCl₂的混合溶液。

上述的复合微生物菌剂，优选的，所述包埋载体中，所述聚乙烯醇的浓度为6w/v％～12w/v％，进一步优选为10w/v％。

上述的复合微生物菌剂，优选的，所述包埋载体中，所述海藻酸钠的浓度为0.1w/v％～0.4w/v％；进一步优选为0.3w/v％。

上述的复合微生物菌剂，优选的，所述交联剂中，所述硼酸的浓度为1w/v％～5w/v％；进一步优选为4w/v％。

上述的复合微生物菌剂，优选的，所述交联剂中，所述CaCl₂的浓度为1w/v％～5w/v％；进一步优选为3w/v％。

上述的复合微生物菌剂，优选的，所述芽孢杆菌为芽孢杆菌Bacillus sp.P1，所述芽孢杆菌Bacillus sp.P1采用以下驯化方法驯化得到：

(1)将芽孢杆菌接入含菲的无机盐培养基中好氧培养；

(2)将好氧培养后的芽孢杆菌接入平板培养基中纯化；

(3)以步骤(1)～(2)为一个驯化周期进行重复驯化，每个周期中无机盐培养基中菲的浓度随周期增加呈梯度递增，其他培养条件相同，得到芽孢杆菌Bacillus sp.P1。

上述的复合微生物菌剂，优选的，所述步骤(3)中重复次数为6次。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

S1、将芽孢杆菌接种至含菲的培养基中好氧培养，得到菌液；

S2、将所述菌液浓缩，得浓缩菌液，将所述浓缩菌液加至包埋载体中，得到含菌液的混合液，然后将所述含菌液的混合液逐滴滴入至交联剂中，进行交联硬化形成芽孢杆菌凝胶菌球；

S3、将所述芽孢杆菌凝胶菌球进行好氧培养将所述芽孢杆菌凝胶菌球进行好氧培养，得到复合微生物菌剂。

上述的制备方法中，优选的，所述步骤S1中，所述含菲的培养基中，菲的浓度为100mg/L。

上述的制备方法中，优选的，所述好氧培养的工艺条件为：在30℃～37℃下以150rpm～200rpm转速恒温振荡培养2天～7天。进一步优选的，恒温振荡培养的时间为2天，培养温度为37℃，振荡的转速为200rpm。

上述的制备方法中，优选的，所述步骤S2中，所述包埋载体与所述菌液的体积比为50∶1～10∶1。进一步优选的，所述包埋载体与所述菌液的体积比为25∶1。

上述的制备方法中，优选的，所述含菌液的混合液与所述交联剂的体积比为1∶25。

上述的制备方法中，优选的，所述步骤S2中，所述菌液为浓缩菌液，所述浓缩菌液采用将菌液离心后去除上清液制备得到，去除的上清液量为所述菌液总量的80％～90％。进一步优选的，去除的上清液量为所述菌液总量的90％。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的复合微生物菌剂或上述的制备方法制备的复合微生物菌剂在降解废水中的菲的应用。

上述的应用中，优选的，包括以下步骤：

将所述复合微生物菌剂加入废水中，在温度为20～60℃、转速为100rpm～300rpm的条件下恒温振荡反应0～72h，完成对菲的去除。

上述的应用中，优选的，反应温度为30～37℃，反应时间为12～24h，每升废水中添加湿重量为50g～100g的所述复合微生物菌剂。进一步优选的，每升废水中添加湿重量为100g的所述复合微生物菌剂。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、本发明的复合微生物菌剂，能快速高效降解废水中的高浓度菲；同时在废水含高浓度Pb²⁺的情况下，也能快速高效降解菲，为环境中难降解污染物多环芳烃的治理提供了新的途径，同时也为重金属和有机物的复合污染修复提供了技术支持。

2、本发明的复合微生物菌剂，芽孢杆菌Bacillus sp.P1是前期从多环芳烃污染的土壤中筛选驯化而得到的，经固定后的芽孢杆菌Bacillus sp.P1在30h内对100mg/L菲的降解率即可达到98.1％，相比于现有技术中具有菲降解能力的芽孢杆菌，芽孢杆菌Bacillus sp.P1对废水中高浓度菲的降解具有更快更强的处理效果。

3、本发明采用聚乙烯醇-硼酸和海藻酸钠-CaCl₂混合作为芽孢杆菌Bacillus sp.P1固定化的包埋和交联物，经其固定后的芽孢杆菌Bacillus sp.P1对高浓度菲的降解效率在30h内能达到98.1％，证明其对芽孢杆菌Bacillus sp.P1的固定效果非常好。而且在高浓度Pb²⁺与菲共存时，经其固定后的Bacillus sp.P1对菲的去除率也比较高。包埋载体添加了海藻酸钠，主要原因是同聚乙烯醇相比，海藻酸钠是一种天然高分子凝胶，其传质性能较好，对细菌进行包埋时不会降低细菌细胞活性，因此二者共同作用会对固定化细菌处理有机物能起到更好效果。在海藻酸钠包埋固定化过程中，交联剂CaCl₂中的钙离子能与海藻酸根离子螯合形成海藻酸根凝胶，能将芽孢杆菌Bacillus sp.P1细胞固定，因此聚乙烯醇-硼酸及海藻酸钠-CaCl₂的组合能使得固定化细菌Bacillus sp.P1降解高浓度菲的降解效果更好。本发明无需再在包埋剂中添加其他物质就能取得很好的效果，简化了实验程序。而且用于凝胶制作的主要原料聚乙烯醇、海藻酸钠、硼酸、氯化钙都是常用的化工产品，来源广泛，经济实惠，是良好的微生物负载材料。

4、本发明的复合微生物菌剂的制备方法，制备工艺简单、生产成本低。

5、本发明的复合微生物菌剂在降解废水中的菲的应用，可直接将复合微生物菌剂加入反应器中进行反应，整个处理工艺成本较低，操作简单且容易实施。

附图说明

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

图1为本发明实施例2的复合微生物菌剂的制备方法示意图。

图2为本发明实施例2的复合微生物菌剂的电镜扫描图。

图3为本发明实施例2中步骤(1)制备的菌液和步骤(3)制备的复合微生物菌剂在0～30h内对菲降解的对照图。

图4为本发明实施例3中步骤(1)制备的菌液和步骤(3)制备的复合微生物菌剂在废水中存在高浓度Pb²⁺的情况下对菲降解的对照图。

具体实施方式

以下将结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但并不因此而限制本发明的保护范围。

实施例

以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。

实施例1：

本实施例的芽孢杆菌Bacillus sp.P1是通过以下方法筛选得到：

(1)将芽孢杆菌(芽孢杆菌为常规芽孢杆菌)按5v/v％的接种量接入含菲的无机盐培养基(无机盐培养基的成分为：MnSO₄ 0.0447mg/L，ZnSO₄ 0.0686mg/L，(NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O0.0347mg/L，K₂HPO₄ 129.15mg/L，Na₂HPO₄ 167mg/L，KH₂PO₄ 43.5mg/L，NH₄Cl 25mg/L，MgSO₄ 13.8mg/L，CaCl₂ 36.4mg/L，FeCl₃ 0.42mg/L)中好氧培养7d(150rpm，30℃)得到菌液。

(2)取步骤(1)中的菌液滴到到平板培养基中(平板培养基为牛肉膏蛋白胨培养基)纯化3天。

(3)以步骤(1)～(2)为一个驯化周期，共驯化6个周期，每个周期中无机盐培养基中菲的浓度见表1，其他培养条件与第一个驯化周期的培养条件相同。得到经驯化后的芽孢杆菌，命名为芽孢杆菌Bacillus sp.P1。

分别将未驯化的芽孢杆菌、经过1、2、3、4、5、6周期驯化后的芽孢杆菌投入待处理废水中(待处理废水中菲浓度100mg/L)，考察驯化后的芽孢杆菌对菲的降解效率，具体结果参见表1。

表1 驯化前后的芽孢杆菌对菲的降解效果对比表

驯化周期	0	1	2	3	4	5	6
								菲浓度(mg/L)	0	10	20	30	40	50	60
菲降解率(％)	38.72％	43.56％	58.93％	73.88％	88.06％	91.85％	93.91％

从表1中可知：经驯化后，芽孢杆菌Bacillus sp.P1对多环芳烃的降解效果明显高于未驯化的芽孢杆菌；同时随着含菲的无机盐培养基中菲浓度的升高，驯化后的芽孢杆菌对菲的降解效率也逐渐升高，这是由于菲对芽孢杆菌有毒害作用，设置梯度菲浓度的废水，可以让芽孢杆菌逐渐适应菲的浓度，不至于使菌被毒害不能生长，同时可以使驯化后的菌对菲具有更强、更稳定的降解性能。

实施例2：

一种复合微生物菌剂，该复合微生物菌剂包括芽孢杆菌Bacillus sp.P1(KP888558)、包埋载体和交联剂，芽孢杆菌Bacillus sp.P1通过交联剂固定于包埋载体中形成凝胶菌球(即复合微生物菌剂)，包埋载体为聚乙烯醇和海藻酸钠的混合溶液，交联剂为硼酸和CaCl₂的混合溶液。其中，芽孢杆菌Bacillus sp.P1(KP888558)采用实施例1的芽孢杆菌Bacillus sp.P1。

一种上述本实施例的复合微生物菌剂的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：

S1、按浓度为5w/v％将25g芽孢杆菌Bacillus sp.P1(KP888558)接种到盛有500mL，含菲浓度为100mg/L的灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基的锥形瓶中，置于温度为37℃，转速为200rpm的恒温振荡培养箱中，好氧培养2天，得到菌液BSP1。

S2、将菌液BSP1在洁净工作台中分装至若干离心管中，在转速为6000rpm的离心机上离心10min，离心后去除450mL上清液，剩余的50mL高浓度菌液保存待用。往灭菌后的500mL聚乙烯醇(w/v，10％)和海藻酸钠(w/v，0.3％)混合溶液中添加保存待用的高浓度菌液20mL，搅拌均匀得到含菌液的混合液，用注射器将含菌液的混合液逐滴滴入12.5L硼酸(w/v，4％)和CaCl₂(w/v，3％)的混合溶液中(即包埋载体与交联剂的体积比为1∶25)，然后在150rpm的往复振荡器中交联8h，使混合溶液硬化形成芽孢杆菌凝胶菌球。

S3、将步骤S2所得芽孢杆菌凝胶菌球用超纯水清洗，再移至装有牛肉膏蛋白胨的培养基中，在温度为37℃，转速为200rpm的恒温振荡培养箱中，好氧培养2天后取出，用超纯水清洗多次，得到复合微生物菌剂，图2为本实施例的复合微生物菌剂的电镜扫描图，由图可知，细菌菌丝密集，细菌长势较好。

实施例3：

一种实施例2的复合微生物菌剂在降解废水中的高浓度菲的应用，具体的应用方法包括以下步骤：

在三组(组1、组2和组3)锥形瓶中分别加入5g/L的菲丙酮1mL，待丙酮挥发至干后加入50mL无机盐培养基(无机盐培养基的成分为：MnSO₄ 0.0447mg/L，ZnSO₄ 0.0686mg/L，(NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O 0.0347mg/L，K₂HPO₄ 129.15mg/L，Na₂HPO₄ 167mg/L，KH₂PO₄ 43.5mg/L，NH₄Cl 25mg/L，MgSO₄ 13.8mg/L，CaCl₂ 36.4mg/L，FeCl₃ 0.42mg/L)。

灭菌后，在组1中加入实施例2步骤1中制备得到的菌液BSP15mL；在组2中加入实施例1的复合微生物菌剂，按湿重计5g；组3为不加菌的空白对照组。将三组锥形瓶分别置于转速为200rpm，温度为37℃的恒温振荡箱中，分别在设定的时间间隔(2h，4h，6h，18h，30h)对三组反应液取样，样品用正己烷萃取，254nm下用紫外-可见分光光度计测定菲的含量。测定结果见图3。

由图3可知，复合微生物菌剂中，由于芽孢杆菌Bacillus sp.P1(KP888558)经聚乙烯醇和海藻酸钠固定，该复合微生物菌剂对菲的降解速度较菌液BSP1(芽孢杆菌Bacillus sp.P1(KP888558)未被固定)对的降解速度更快。该复合微生物菌剂在处理2h后对菲的降解效率即已升至86.8％，而菌液BSP1对菲的降解效率只有62.5％。同时，该复合微生物菌剂对菲的降解效率也较菌液BSP1对菲的降解效率大幅提高，在30h后，该复合微生物菌剂对菲的降解效率达到98.1％，远大于菌液BSP1对菲的降解效率89.3％。这是因为固定化前，Bacillussp.P1(KP888558)较为分散，菲的吸附表面积较小。而固定化以后，Bacillus sp.P1(KP888558)菌体表面有较多孔隙，其比表面积变大，从而增加了菌体表面PHE的吸附位点，使得菲易团聚在负载的Bacillus sp.P1周围，从而对菲的降解速度和效率加快。由此可知，本发明的复合微生物菌剂能快速且高效地降解环境中的有机污染物菲。

实施例4：

一种实施例2的复合微生物菌剂在降解废水中的高浓度菲的应用，该废水中同时存在高浓度Pb²⁺和高浓度菲，具体的应用方法包括以下步骤：

在三组锥形瓶(组1、组2和组3，每组含6个锥形瓶)中分别加入1mL浓度为5g/L的菲丙酮，待丙酮挥发至干后，每组按表2所示配比配制6份含高浓度Pb²⁺和高浓度菲的废水(表2中无机盐培养基的成分为：MnSO₄ 0.0447mg/L，ZnSO₄ 0.0686mg/L，(NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O 0.0347mg/L，K₂HPO₄ 129.15mg/L，Na₂HPO₄ 167mg/L，KH₂PO₄ 43.5mg/L，NH₄Cl 25mg/L，MgSO₄ 13.8mg/L，CaCl₂ 36.4mg/L，FeCl₃ 0.42mg/L)，使得每个锥形瓶中的废水总体积均为50mL。灭菌后，在组1的6份废水中加入实施例2的菌液BSP15mL，在组2的6份废水中加入实施例1的复合微生物菌剂湿重计5g。组3的6份废水为不加菌的空白对照组。将三组锥形瓶置于转速为200rpm，温度为37℃的恒温振荡箱中反应24h，反应完成后用正己烷萃取，254nm下用紫外-可见分光光度计测定菲的含量。测定结果见图4。

表2：每组锥形瓶中无机盐培养基和PbCl₂溶液的添加配比

	1#	2#	3#	4#	5#	6#
							无机盐培养基(mL)	50	47.5	45	42.5	40	35
1g/L PbCl2溶液(mL)	0	2.5	5	7.5	10	15

由图4可知，菌液BSP1(芽孢杆菌Bacillus sp.P1(KP888558)未被固定)对菲的降解率随Pb²⁺浓度的变化呈现出先增大后减小的趋势。低浓度的Pb²⁺(低于50mg/L)促进了芽孢杆菌Bacillus sp.P1(KP888558)对菲的降解，而高浓度的Pb²⁺(50～300mg/L)则抑制了芽孢杆菌Bacillus sp.P1(KP888558)对菲的降解，且抑制作用随Pb²⁺浓度的升高而增强。复合微生物菌剂中，芽孢杆菌Bacillus sp.P1(KP888558)经聚乙烯醇和海藻酸钠固定化后，对菲的降解效率依然呈现先增大后减小的趋势，但是，对菲降解率较固定前有较大提高。同时，减小了Pb²⁺浓度的变化对菲降解的影响。这是因为经固定化的Bacillus sp.P1(KP888558)表面有较多孔隙，更容易与菲结合而使之降解；同时凝胶膜衣也起到对Bacillus sp.P1(KP888558)的保护作用，保护了其对Pb²⁺的耐受能力。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (10)

1.一种复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂包括芽孢杆菌、包埋载体和交联剂，所述芽孢杆菌通过所述交联剂固定于所述包埋载体中，所述包埋载体为包括聚乙烯醇和海藻酸钠的混合溶液，所述交联剂为包括硼酸和CaCl₂的混合溶液。

2.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述包埋载体中，所述聚乙烯醇的浓度为6w/v％～12w/v％，所述海藻酸钠的浓度为0.1w/v％～0.4w/v％；所述交联剂中，所述硼酸的浓度为1w/v％～5w/v％，所述CaCl₂的浓度为1w/v％～5w/v％。

3.根据权利要求1或2所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述芽孢杆菌为芽孢杆菌Bacillus sp.P1，所述芽孢杆菌Bacillus sp.P1采用以下驯化方法驯化得到：

(1)将芽孢杆菌接入含菲的无机盐培养基中好氧培养；

(2)将好氧培养后的芽孢杆菌接入平板培养基中纯化；

(3)以步骤(1)～(2)为一个驯化周期进行重复驯化，每个周期中无机盐培养基中菲的浓度随周期增加呈梯度递增，其他培养条件相同，得到芽孢杆菌Bacillus sp.P1。

4.一种如权利要求1～3任一项所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将芽孢杆菌接种至含菲的培养基中好氧培养，得到菌液；

S2、将所述菌液加至包埋载体中，得到含菌液的混合液，然后将所述含菌液的混合液逐滴滴入至交联剂中，进行交联硬化形成芽孢杆菌凝胶菌球；

S3、将所述芽孢杆菌凝胶菌球进行好氧培养，得到复合微生物菌剂。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述含菲的培养基中，菲的浓度为100mg/L，所述好氧培养的工艺条件为：在30℃～37℃下以150rpm～200rpm转速恒温振荡培养2天～7天。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述包埋载体与所述菌液的体积比为50∶1～10∶1，所述包埋载体与所述交联剂的体积比为1∶25。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述菌液为浓缩菌液，所述浓缩菌液采用将菌液离心后去除上清液制备得到，去除的上清液量为所述菌液总量的80％～90％。

8.一种如权利要求1～3任一项所述的复合微生物菌剂或如权利要求4～7任一项所述的制备方法制备的复合微生物菌剂在降解废水中的菲的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用方法包括以下步骤：

将所述复合微生物菌剂加入废水中，在温度为20℃～60℃、转速为100rpm～300rpm的条件下恒温振荡反应0h～72h，完成对菲的去除。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，反应温度为30℃～37℃，反应时间为12h～24h，每升废水中添加湿重量为50g～100g的所述复合微生物菌剂。