CN109182139A - 一种水稻作物用固体菌剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生物菌肥菌剂领域，尤其涉及一种水稻作物用固体菌剂的制备方法，包括以下步骤：1）将肥料磨成细粉；2）将海藻酸钠与聚乙烯醇溶于水中充分溶解，在所得混合液中加入CaCO3；随后滴入交联剂中，固化形成凝胶球；3）将凝胶球用酸性溶液清洗，得到多孔凝胶材料；4）将N‑异丙基丙烯酰胺接枝于多孔凝胶材料表面；5）将摩西球囊霉菌菌液和所得多孔凝胶材料混合培养，得到固体凝胶菌剂。本发明以海藻酸钠/聚乙烯醇多孔凝胶材料为载体，多孔凝胶材料中的孔壁内包覆有肥料细粉，在孔壁的表面吸附有大量的摩西球囊霉菌，材料均为生物可降解材料，不会残留土壤中，绿色环保。

Description

一种水稻作物用固体菌剂的制备方法
技术领域
本发明涉及一种生物菌肥菌剂领域，尤其涉及一种水稻作物用固体菌剂的制备方法。
背景技术
水稻是世界上种植面积和总产量最大的作物之一，它的产量与世界粮食安全密切相关。全球有一半的人口以稻米为主食。水稻是典型的菌根作物，被丛植菌根侵染的水稻具有良好的水分、养分等状况，与未接种丛植菌根的水稻相比表现出较好的生长优势与抗性。因此，借助丛植菌根来提高水稻产量是一种具有应用前景的科学研究。菌根—菌根真菌与宿主植物形成的互惠共生体，是自然界最为普遍存在的共生形式之一，90％以上陆生植物都具有菌根。丛枝菌根真菌是分布最为广泛的菌根真菌丛枝菌根是严格共生的真菌，当其侵染宿主植株根系后，宿主植株会将光合作用产生的碳运输给丛枝菌根作为碳源，真菌会反馈给宿主水分与矿质营养等作为回报。所以菌根共生体的形成是能量与营养交流的过程，其中碳、氮的代谢起到了主要的作用。丛枝菌根不仅能增加宿主植株对磷、氮、硫以及微量元素，如铜和锌的吸收，而且能够增强宿主植株的抗逆性，如低温、干旱、盐碱等。在农业生产过程中，生物菌肥和化学肥料由于一次施肥无法满足作物不同生长阶段的需要，往往需要多次施肥，化学肥料的肥料利用率低下，对环境也会产生污染。而在现有技术中，对于将生物菌肥和化学肥料同时负载与一个载体中，且不相互影响的技术手段很难找寻，因此，研究出一种科学施肥的载体，增加肥料利用率，减少肥料的使用量和施肥次数，节省劳动力，减少对环境污染，提高农产品品质是肥料发展的一个重要趋势。
中国专利局于2012年7月4日公开了基于丛枝菌根真菌的复合型水稻专用生物肥料的制备及其应用的发明专利，授权公告号为CN102718599B，该发明为了解决目前水稻在不能被丛枝菌根真菌侵染，难以有效形成共生，致使水稻不能从丛枝菌根菌-作共生系统获得矿质营养的问题。采用了如下方法：定殖强化物的制备；丛枝菌根真菌菌剂的预处理；将处理好的丛枝菌根真菌菌剂、水稻壮秧剂和定殖强化物混匀。该发明使水稻在秧期能够建立高侵染率、性能稳定的丛枝菌根菌-作共生系统，持续为水稻提供矿质营养，改善水稻的生长状况，但该发明只是将菌剂与水稻壮秧剂和定殖强化物等混合，施肥时为了满足水稻对生物菌肥和化肥两者的需求，需要多次分别施肥，增加了施肥的次数，也增加了农业生产中人力与物力的消耗，并且，施肥后肥料浪费严重，利用率低下，增加了施肥成本，也对环境和人类健康构成了威胁，因此，研究出一种科学施肥的载体，增加肥料利用率，减少肥料的使用量和施肥次数，节省劳动力，减少对环境污染，提高农产品品质是肥料发展的一个重要趋势。
发明内容
为解决现有技术中农业生产过程中肥料使用量较高，施肥次数多，肥料及人力物力浪费严重，无法满足作物在不同生长时期需要不同肥料，且无法满足同时负载生物菌肥与化学肥料，且不相互影响的问题，提供了一种内层为置于多孔凝胶内，外层吸附有生物菌肥的固体菌剂。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种水稻作物用固体菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将肥料烘干，研磨成细粉；
(2)将海藻酸钠与聚乙烯醇溶于去离子水中，放置5-7h至充分溶解，得到混合液；
(3)将摩西球囊霉菌菌株放入培养基中静置培养，得到菌液；
(4)搅拌状态下在所得混合液中加入菌液和CaCO3；
(5)将步骤(4)中所得溶液滴入交联剂溶液中，固化12-24h后形成凝胶球；
(6)将凝胶球取出，放入酸性溶液中清洗，随后用去离子水清洗，烘干后得到多孔凝胶材料；
(7)将N-异丙基丙烯酰胺接枝于多孔凝胶材料表面；
(8)将菌液和步骤(7)所得多孔凝胶材料混合培养，得到固体凝胶菌剂。
本发明的固体菌剂以海藻酸钠/聚乙烯醇多孔凝胶材料为载体，多孔凝胶材料中的孔壁内包覆有肥料细粉，在孔壁的表面吸附有大量的摩西球囊霉菌，在发明人进行发明创造时，发现肥料细粉也不可避免的暴露于孔壁表面，当海藻酸钠/聚乙烯醇多孔凝胶材料放于摩西球囊霉菌液中培养吸附时，肥料细粉会降低菌液中的摩西球囊霉菌的存活率，最终使得海藻酸钠/聚乙烯醇多孔凝胶材料中的有效菌数量降低，且摩西球囊霉菌吸附量也比较低，因此，发明人在海藻酸钠/聚乙烯醇多孔凝胶材料放于摩西球囊霉菌液中培养之前，将N-异丙基丙烯酰胺接枝于海藻酸钠/聚乙烯醇多孔凝胶材料的表面，此时海藻酸钠/聚乙烯醇多孔凝胶材料的表面就会长成一层聚(N-异丙基丙烯酰胺)薄膜，聚(N-异丙基丙烯酰胺)薄膜不但能隔离肥料细粉和摩西球囊霉菌，使肥料细粉不对摩西球囊霉菌产生任何影响，而且聚(N-异丙基丙烯酰胺)薄膜也能促进海藻酸钠/聚乙烯醇多孔凝胶材料对摩西球囊霉菌的吸附，此方法制得的固体菌剂效果更好。当本发明的固体菌剂应用于水稻作物生产活动时，将在稻田中加入固体菌剂，此时孔壁表面吸附的摩西球囊霉菌会侵染水稻根并与之形成共生关系，随后海藻酸钠/聚乙烯醇多孔凝胶材料逐渐降解，释放肥料，且缓慢降解释放肥料的过程也起到了肥料控释的作用，增加肥期，提高肥料的吸收利用率，并且海藻酸钠/聚乙烯醇多孔凝胶材料完全降解后，不会残留在土壤中，绿色环保。
作为优选，步骤(1)中肥料包括重量份硫酸铵10-35份、氯化钾15-30份、重过磷酸钙20-35份、硫酸镁5-10份、氯化铵10-15份。
各种肥料合理搭配，通过海藻酸钠/聚乙烯醇多孔凝胶材料的降解能实现对肥料的控释，满足水稻作物不同阶段对氮肥、钾肥、磷肥及微量元素的需求。
作为优选，所述步骤(2)中海藻酸钠与聚乙烯醇的质量比为1-5:1。
作为优选，所述步骤(4)中的CaCO3粒径为800-2500目。
CaCO3粒径用来调控海藻酸钠/聚乙烯醇多孔凝胶材料的孔径，800-2500目的CaCO3粒径使得多孔凝胶材料的孔径易吸附摩西球囊霉菌。
作为优选，所述步骤(5)中的交联剂为2-4wt％CaCl2饱和硼酸溶液。
海藻酸钠的交联剂为CaCl2，聚乙烯醇的交联剂为硼酸，因此使用2-4wt％CaCl2饱和硼酸溶液时，海藻酸钠与聚乙烯醇混合物更易凝胶。
作为优选，所述N-异丙基丙烯酰胺接枝包括以下步骤：
(1)将多孔凝胶材料进行等离子体处理；
(2)将处理后的多孔凝胶材料放于二甲苯和氨丙基三乙氧基硅烷上方1-3cm处，在氩气保护下140-160℃下回流5-9h，随后冷却，依次用乙醇和水清洗，烘干得到氨基化多孔凝胶材料；
(3)将氨基化多孔凝胶材料浸入含2-4wt％吡啶的二氯甲烷中，在0-2℃加入溴代异丁酰溴，反应2-5h，随后依次用丙酮和甲苯清洗，得到溴代多孔凝胶材料；
(4)将N-异丙基丙烯酰胺和五甲基二亚乙基三胺溶于蒸馏水和甲醇混合液中，抽真空后加入溴化亚铜，常温下反应10-18h，随后将多孔凝胶材料取出，用蒸馏水清洗，烘干，得到聚(N-异丙基丙烯酰胺)接枝的多孔凝胶材料。
多孔凝胶材料进行等离子体处理，使其表面富含羟基，随后，本发明人在发明创作时发现若将多孔凝胶材料进浸没于二甲苯和氨丙基三乙氧基硅烷溶液中时，氨丙基三乙氧基硅烷易在溶液中交联，会在多孔凝胶材料表面形成大量的交联颗粒，影响后续接枝，因此，本方案将处理后的多孔凝胶材料放于二甲苯和氨丙基三乙氧基硅烷上方，在140-160℃下采用蒸汽回流法处理多孔凝胶材料表面，得到氨基化功能表面，随后，加入引发剂溴代异丁酰溴，在0-2℃下与氨基反应，从而将引发剂接枝于多孔凝胶材料表面，得到溴代多孔凝胶材料，随后加入N-异丙基丙烯酰胺和五甲基二亚乙基三胺的混合溶液，并加入溴化亚铜，在真空保护下，常温反应10-18h，得到聚(N-异丙基丙烯酰胺)接枝的多孔凝胶材料。
作为优选，所述多孔凝胶材料表面聚(N-异丙基丙烯酰胺)的厚度为20-45nm。
当多孔凝胶材料表面聚(N-异丙基丙烯酰胺)的厚度为20-45nm时，摩西球囊霉菌更易吸附。
作为优选，所述二甲苯和氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为8-12:1。
作为优选，所述二氯甲烷和溴代异丁酰溴的体积比为30-50:1。
作为优选，所述N-异丙基丙烯酰胺和溴化亚铜的质量比为40-70:1。
本发明的有益效果在于：(1)以海藻酸钠/聚乙烯醇多孔凝胶材料为载体，多孔凝胶材料中的孔壁内包覆有肥料细粉，在孔壁的表面吸附有大量的摩西球囊霉菌，使用时先释放孔壁表面摩西球囊霉菌，随后肥料细粉随着海藻酸钠/聚乙烯醇凝胶的降解而实现控释；(2)聚(N-异丙基丙烯酰胺)的接枝不但能隔离肥料细粉和摩西球囊霉菌，使肥料细粉不对摩西球囊霉菌产生任何影响，而且聚(N-异丙基丙烯酰胺)薄膜也能促进海藻酸钠/聚乙烯醇多孔凝胶材料对摩西球囊霉菌的吸附；(3)使用的材料均为生物可降解材料，不会残留土壤中，绿色环保。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明方案进行更加清楚、完整地描述，显然所描述实施例仅为本发明一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1：水稻作物用固体菌剂的制备步骤如下：
(1)将重量份硫酸铵35份、氯化钾20份、重过磷酸钙30份、硫酸镁5份、氯化铵10份的肥料烘干，研磨成细粉；
(2)将40g海藻酸钠与25g聚乙烯醇溶于去离子水中，放置5h至充分溶解，得到混合液；
(3)将摩西球囊霉菌菌株放入培养基中静置培养7天，得到菌液；
(4)搅拌状态下在所得混合液中加入12g摩西球囊霉菌菌液和7g的1800目CaCO3；
(5)将步骤(4)中所得溶液滴入2wt％CaCl2饱和硼酸溶液中，固化14h后形成凝胶球；
(6)将凝胶球取出，放入0.1mol/L盐酸溶液中清洗，随后用去离子水清洗，烘干后得到多孔凝胶材料；
(7)将N-异丙基丙烯酰胺接枝于多孔凝胶材料表面，步骤为：a)将30g多孔凝胶材料进行等离子体处理30s；b)将处理后的多孔凝胶材料放于12ml二甲苯和1.5ml氨丙基三乙氧基硅烷上方2cm处，在氩气保护下140-160℃下回流5h，随后冷却，依次用乙醇和水清洗，烘干得到氨基化多孔凝胶材料；c)将氨基化多孔凝胶材料浸入含3g的2-4wt％吡啶的20ml二氯甲烷中，在0℃加入500μl溴代异丁酰溴，反应2-5h，随后依次用丙酮和甲苯清洗，得到溴代多孔凝胶材料；d)将5gN-异丙基丙烯酰胺和560μl五甲基二亚乙基三胺溶于蒸馏水和甲醇混合液中，抽真空后加入0.12g溴化亚铜，常温下反应10h，随后将多孔凝胶材料取出，用蒸馏水清洗，烘干，得到聚(N-异丙基丙烯酰胺)接枝厚度为20nm左右的多孔凝胶材料。
(8)将菌液和步骤(7)所得多孔凝胶材料50℃下混合培养3天，去除烘干，得到固体凝胶菌剂。
实施例2：水稻作物用固体菌剂的制备步骤如下：
(1)将重量份硫酸铵20份、氯化钾30份、重过磷酸钙35份、硫酸镁5份、氯化铵10份的肥料烘干，研磨成细粉；
(2)将50g海藻酸钠与30g聚乙烯醇溶于去离子水中，放置6h至充分溶解，得到混合液；
(3)将摩西球囊霉菌菌株放入培养基中静置培养6天，得到菌液；
(4)搅拌状态下在所得混合液中加入15g摩西球囊霉菌菌液和10g的800目CaCO3；
(5)将步骤(4)中所得溶液滴入3wt％CaCl2饱和硼酸溶液中，固化18h后形成凝胶球；
(6)将凝胶球取出，放入0.1mol/L盐酸溶液中清洗，随后用去离子水清洗，烘干后得到多孔凝胶材料；
(7)将N-异丙基丙烯酰胺接枝于多孔凝胶材料表面，步骤为：a)将40g多孔凝胶材料进行等离子体处理30s；b)将处理后的多孔凝胶材料放于20ml二甲苯和2.3ml氨丙基三乙氧基硅烷上方2cm处，在氩气保护下140-160℃下回流7h，随后冷却，依次用乙醇和水清洗，烘干得到氨基化多孔凝胶材料；c)将氨基化多孔凝胶材料浸入含5g的2-4wt％吡啶的35ml二氯甲烷中，在2℃加入875μl溴代异丁酰溴，反应2-5h，随后依次用丙酮和甲苯清洗，得到溴代多孔凝胶材料；d)将7gN-异丙基丙烯酰胺和700μl五甲基二亚乙基三胺溶于蒸馏水和甲醇混合液中，抽真空后加入0.14g溴化亚铜，常温下反应18h，随后将多孔凝胶材料取出，用蒸馏水清洗，烘干，得到聚(N-异丙基丙烯酰胺)接枝厚度为45nm左右的多孔凝胶材料。
(8)将菌液和步骤(7)所得多孔凝胶材料50℃下混合培养3天，去除烘干，得到固体凝胶菌剂。
实施例3：水稻作物用固体菌剂的制备步骤如下：
(1)将重量份硫酸铵15份、氯化钾30份、重过磷酸钙30份、硫酸镁10份、氯化铵15份的肥料烘干，研磨成细粉；
(2)将70g海藻酸钠与20g聚乙烯醇溶于去离子水中，放置5h至充分溶解，得到混合液；
(3)将摩西球囊霉菌菌株放入培养基中静置培养7天，得到菌液；
(4)搅拌状态下在所得混合液中加入20g摩西球囊霉菌菌液和15g的2500目CaCO3；
(5)将步骤(4)中所得溶液滴入4wt％CaCl2饱和硼酸溶液中，固化19h后形成凝胶球；
(6)将凝胶球取出，放入0.1mol/L盐酸溶液中清洗，随后用去离子水清洗，烘干后得到多孔凝胶材料；
(7)将N-异丙基丙烯酰胺接枝于多孔凝胶材料表面，步骤为：a)将50g多孔凝胶材料进行等离子体处理30s；b)将处理后的多孔凝胶材料放于30ml二甲苯和2.7ml氨丙基三乙氧基硅烷上方3cm处，在氩气保护下140-160℃下回流9h，随后冷却，依次用乙醇和水清洗，烘干得到氨基化多孔凝胶材料；c)将氨基化多孔凝胶材料浸入含7g的2-4wt％吡啶的45ml二氯甲烷中，在0℃加入900μl溴代异丁酰溴，反应2-5h，随后依次用丙酮和甲苯清洗，得到溴代多孔凝胶材料；d)将10gN-异丙基丙烯酰胺和800μl五甲基二亚乙基三胺溶于蒸馏水和甲醇混合液中，抽真空后加入0.15g溴化亚铜，常温下反应15h，随后将多孔凝胶材料取出，用蒸馏水清洗，烘干，得到聚(N-异丙基丙烯酰胺)接枝厚度为30nm左右的多孔凝胶材料。
(8)将菌液和步骤(7)所得多孔凝胶材料50℃下混合培养3天，去除烘干，得到固体凝胶菌剂。
表1：各实施例摩西球囊霉菌吸附量。
对比例1：与实施例1的区别在于，在制备固体菌剂时，未使用聚(N-异丙基丙烯酰胺)进行接枝，其余均与实施例1相同。
对比例2：与实施例1的区别在于，在制备固体菌剂时，接枝反应时间为5h，聚(N-异丙基丙烯酰胺)厚度为5nm左右，其余均与实施例1相同。
对比例3：与实施例1的区别在于，在制备固体菌剂时，接枝反应时间为15h，聚(N-异丙基丙烯酰胺)厚度为40nm左右，其余均与实施例1相同。
对比例4：与实施例1的区别在于，在制备固体菌剂时，接枝反应时间为30h，聚(N-异丙基丙烯酰胺)厚度为70nm左右，其余均与实施例1相同。
表2：不同接枝厚度摩西球囊霉菌吸附量。
由表2可知，当不接枝聚(N-异丙基丙烯酰胺)或者接枝厚度超过20-45nm范围时，摩西球囊霉菌吸附密度会显著下降，因此当聚(N-异丙基丙烯酰胺)接枝厚度为20-45nm范围内时，多孔凝胶材料对摩西球囊霉菌吸附效果最好。

Claims (10)

1.一种水稻作物用固体菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将肥料烘干，研磨成细粉；
（2）将海藻酸钠与聚乙烯醇溶于去离子水中，放置5-7h至充分溶解，得到混合液；
（3）将摩西球囊霉菌菌株放入培养基中静置培养，得到菌液；
（4）搅拌状态下在所得混合液中加入菌液和CaCO3；
（5）将步骤（4）中所得溶液滴入交联剂溶液中，固化12-24h后形成凝胶球；
（6）将凝胶球取出，放入酸性溶液中清洗，随后用去离子水清洗，烘干后得到多孔凝胶材料；
（7）将N-异丙基丙烯酰胺接枝于多孔凝胶材料表面；
（7）将摩西球囊霉菌株放入培养基中静置培养，得到菌液；
（8）将菌液和步骤（7）所得多孔凝胶材料混合培养，得到固体凝胶菌剂。
2.根据权利要求1所述的一种水稻用固体菌剂制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中肥料包括重量份硫酸铵10-35份、氯化钾15-30份、重过磷酸钙20-35份、硫酸镁5-10份、氯化铵10-15份。
3.根据权利要求1或2所述的一种水稻作物用固体菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中海藻酸钠与聚乙烯醇的质量比为1-5:1。
4.根据权利要求1所述的一种水稻作物用固体菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中的CaCO3粒径为800-2500目。
5.根据权利要求1所述的一种水稻作物用固体菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中的交联剂为2-4wt%CaCl2饱和硼酸溶液。
6.根据权利要求1所述的一种水稻作物用固体菌剂的制备方法，其特征在于，所述N-异丙基丙烯酰胺接枝包括以下步骤：
（1）将多孔凝胶材料进行等离子体处理；
（2）将处理后的多孔凝胶材料放于二甲苯和氨丙基三乙氧基硅烷上方1-3cm处，在氩气保护下140-160℃下回流5-9h，随后冷却，依次用乙醇和水清洗，烘干得到氨基化多孔凝胶材料；
（3）将氨基化多孔凝胶材料浸入含2-4wt%吡啶的二氯甲烷中，在0-2℃加入溴代异丁酰溴，反应2-5h，随后依次用丙酮和甲苯清洗，得到溴代多孔凝胶材料；
（4）将N-异丙基丙烯酰胺和五甲基二亚乙基三胺溶于蒸馏水和甲醇混合液中，抽真空后加入溴化亚铜，常温下反应10-18h，随后将多孔凝胶材料取出，用蒸馏水清洗，烘干，得到聚（N-异丙基丙烯酰胺）接枝的多孔凝胶材料。
7.根据权利要求6所述的一种水稻作物用固体菌剂的制备方法，其特征在于，所述多孔凝胶材料表面聚（N-异丙基丙烯酰胺）的厚度为20-45nm。
8.根据权利要求7所述的一种水稻作物用固体菌剂的制备方法，其特征在于，所述二甲苯和氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为8-12:1。
9.根据权利要求8所述的一种水稻作物用固体菌剂的制备方法，其特征在于，所述二氯甲烷和溴代异丁酰溴的体积比为30-50:1。
10.根据权利要求9所述的一种水稻作物用固体菌剂的制备方法，其特征在于，所述N-异丙基丙烯酰胺和溴化亚铜的质量比为40-70:1。
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