CN109182202A - 一种芽孢杆菌ht2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种芽孢杆菌HT2及其应用。该菌株已于2018年1月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018035。该菌能够利用芘作为唯一碳源并且很快地降解芘：该菌能在20d将初始浓度为10‑50mg/L的芘降解80％左右；对初始浓度为100和200mg/L的芘降解率分别为65％和45％左右。本发明还同时提供了不同影响因素对芘降解性能的测定。本发明所述芽孢杆菌HT2菌株降解性能稳定，降解底物范围较广，适用于PAHs污染土壤及水体的生物修复。

Description

一种芽孢杆菌HT2及其应用

技术领域

本发明属于生物修复技术领域，具体涉及一种芽孢杆菌HT2及其应用。

背景技术

多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydr℃arbons，PAHs)是环境中一类典型的持久性有机污染物，由两个及两个以上的苯环稠和而成。主要来自于森林大火、煤和石油的燃烧、冶炼和运输行业等，可以在环境中长期稳定的存在，并广泛分布于土壤、水体和大气中，因其具有强致癌性、致突变性和致畸性，对微生物和植物生长有强抑制作用的特性，美国环保局早在上世纪八十年代初便把16种未带分支的PAHs确定为环境检测中优先污染物，我国同样也早把PAHs列为环境中优先检测的污染物黑名单。

PAHs生物富集率高、致癌性强、环境风险高，对人类健康构成极大威胁。美国环境保护署公布的129种优先监测污染物中，PAHs就有16种。我国也将7种多环芳烃列入“中国环境优先控制污染物”黑名单。PAHs在环境中虽然是微量的，但分布广泛，人们可以通过呼吸、饮食等多种途径摄入，对人类健康产生极大危害。由于PAHs自身的疏水性及低水溶性，能很快沉积到环境中，并且随着苯环数量的增多，脂溶性增强，在环境中存在的时间延长，遗传毒性增高。

目前针对PAHs污染的修复治理方法主要有物理、化学和生物修复法。其中物理修复效率较高，但成本昂贵，对土壤扰动大，易造成二次污染，不宜大规模使用。化学修复技术中使用的化学试剂本身就具有很强的毒性，可能会造成更加严重的环境问题。而生物修复技术具有成本低、应用方法简单、无需大型设备、无二次污染、可实现污染物的彻底矿化去除，适于大范围污染土壤治理等优点。生物修复中的微生物修复在PAHs的迁移转化乃至最终从环境中消失的过程中占有重要的地位，是环境中去除多环芳烃最主要的途径，也是最有效、最廉价的方式。因此，PAHs的微生物降解已成为国内外污染环境修复的重要手段。

芘(Pyrene)是具有四个苯环的稠环芳烯，是检测多环芳烃污染的指示物之一。属于难降解有机污染物，在环境中广泛存在，可通过呼吸道、消化道、皮肤等途径进入人体，破坏人体的免疫系统。芘已经被列入具有致癌性的多环芳烃之列，其代谢物醌(Quinone)比芘毒性更大，具有致突变性。众多研究表明，以芘为唯一碳源从长期受石油或多环芳烃污染的土壤中均可筛选分离出芘降解菌。目前报道了许多可降解芘的菌株，包括：鞘氨醇单胞菌属、假单胞菌属、黄杆菌属、分枝杆菌属、红球菌属、戈登菌属、糖丝菌属、糙皮侧耳菌属、洋葱伯克霍尔德菌和黄孢原毛平革菌等。鉴于PAHs污染越来越严重的情况，筛选出能高效降解芘的菌株将更具有重要意义和实用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从焦化工厂采集PAHs污染土壤中分离得到的芽孢杆菌(Bacillus sp.)HT2，该菌株对芘具有高效的降解效果。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明从从山西北部某焦化工厂采集PAHs污染土壤，以芘为碳源进行长期驯化，通过多次筛选和分离纯化得到高效的、能降解芘的降解菌HT2。

本发明所述的芽孢杆菌HT2菌学特性描述如下：

该菌经活化以后，在固体培养基制成的平板上生长24h，能形成直径为0.5-2.0mm黄色、圆形、表面光滑、微微向上凸起的、透明、边缘整齐的菌落。

菌株HT2的分子生物学特性：利用PCR技术扩增该菌的16S rRNA基因并测序，得到如SEQ ID NO.1所示的DNA序列。该序列与GenBank中的已有序列进行比对，发现该菌与Bacillus属细菌关系最近，其中与Bacillus sp.FJAT-18017的同源性最高，达到99％。根据16S rDNA序列同源性和形态分析将该菌鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，因此将本发明的芘降解菌命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)HT2。

所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)HT2已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2018年1月15日；保藏编号：CCTCC NO:M 2018035。

在本发明的一些实施例中，本发明所述的芽孢杆菌HT2在修复环境污中的应用，所述的环境污染具体为多环芳烃及芳烃类污染环境。

在本发明的一些实施例中，本发明所述的芽孢杆菌HT2在多环芳烃及芳烃类化合物降解中的应用。

优选的，本发明所述的芽孢杆菌HT2在芘降解中的应用。

通过对比芽孢杆菌HT2对不同浓度芘的降解效果，在芘初始浓度分别为10、25、50、100和200mg/L的MSM培养液中培养20天后，菌株HT2对芘的降解率分别为80％、80.6％、80.9％、65％、45％左右。说明芽孢杆菌HT2是一种芘及耐受芘能力均很强的菌株，对多环芳烃适应性强。在多环芳烃污染环境的生物修复中具有很好的应用前景。

菌株HT2利用其他芳烃化合物的实验结果表明：芽孢杆菌HT2在苯酚、水杨酸、邻苯二酚、1-萘酚、芘中可以生长，能够利用一定浓度范围内的这些底物为唯一碳源和能源进行生长和繁殖。

本发明的有益效果为：

本发明针对焦化工厂采集PAHs污染土壤，以芘为碳源进行长期驯化，通过多次筛选和分离纯化得到芽孢杆菌HT2，该菌株在温度30-40℃范围内都对芘有较好的降解效果，在30℃对初始浓度为50mg L^-1的降解率为80％。在pH7-10范围内都有较好的降解效果，降解率在75％-80％之间。

附图说明

图1是菌株HT2在固体培养基上的菌落形态；

图2是菌株HT2的16S rRNA基因系统发育树；

图3(a)是不同浓度的芘对菌株HT2降解作用的影响；

图3(b)是不同温度对菌株HT2降解作用的影响；

图3(c)是菌株HT2是对其他芳烃类化合物的利用情况。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中涉及到的主要原辅材料、试剂：

配制5g/L芘储备溶液：称取0.25g芘粉末，以正己烷为溶剂，溶解在小烧杯中超声容解半小时左右，待底部无残留全部溶于正己烷后倒入50mL棕色容量瓶中并用正己烷定容至50ml，放入冰箱4℃保存使用。

芘无机盐培养液：在已经灭菌的三角瓶中加入适量的芘储备液，待正己烷溶剂挥发完毕后加入已经灭菌的无机盐培养液。

配置无机盐培养基(MSM)：①磷酸盐缓冲液：分别称取KH₂PO₄ 8.5g，K₂HPO₄·H₂O21.75g，Na₂HPO₄·12H₂O 33.4g，(NH₄)Cl 5.0g，蒸馏水1L；②MgSO₄水溶液：MgSO₄·7H₂O22.5g，蒸馏水1L；③CaCl₂水溶液：CaC1₂·2H₂O 36.4g，蒸馏水1L；③FeC1₃水溶液：FeC1₃·6H₂O 0.25g，蒸馏水1L；④微量元素溶液：MnSO₄·H₂O 39.9mg，ZnSO₄·H₂O 42.8mg，(NH₄)₆Mo₇0₂₄·4H₂O 34.7mg,蒸馏水1L；

取上述磷酸盐缓冲液5.0ml，MgSO₄水溶液3.0ml，CaCl₂水溶液1.0ml，FeCl₃水溶液1.0ml，微量元素溶液1.0ml，蒸馏水定容至1L(为了防止产生无机盐沉淀，在容量瓶中先加约800ml蒸馏水，再加入各种无机盐的基础培养基)。新鲜配置的无机盐培养基(MSM)自然pH值为6.8-7.0，加入2mol/L的NaOH调节pH值为7.2-7.4。使用前应在121℃高压蒸汽灭菌20min。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1芽孢杆菌HT2的分离与鉴定

1.1芽孢杆菌HT2的分离纯化

1)采集山西北部某焦化厂厂区内0-20cm深PAHs污染土样，除去树根、砾石和砖块等杂物后混匀，于4℃保存备用；

2)菌株初筛：取5g保存于冰箱中的新鲜土壤放入100mL，加入50mL灭菌MSM培养基，加入焦磷酸钠0.14g，加入20颗玻璃珠。振荡七天后，取上清液1mL加入含有芘浓度100mg/L的50mL MSM培养基中，加入10mL硅油，此步骤重复进行7次；

3)采用稀释涂布法将驯化后的混合培养液接种于富集培养基上，挑选生长快速且良好的单一菌落，经过多次划线直到获得纯菌株；

4)菌株复筛：将分离出的菌种分别加入含有芘浓度100mg/L的20mLMSM培养基中，于30℃的恒温生化培养箱中培养数天。

1.2菌株的鉴定

1.2.1形态学鉴定

该菌经活化以后，在固体培养基制成的平板上生长24h后，能形成直径为0.5-2.0mm黄色、圆形、表面光滑、微微向上凸起的、透明、边缘整齐的菌落。菌种菌落形态如图1所示。

1.2.1分子鉴定

利用PCR技术扩增该菌的16S rRNA基因并测序，具体过程为：

利用通用引物进行PCR扩增，正向引物为F27：5’-AGTTTGATCMTGGC TCAG-3’；反向引物为R1492:5’-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3’。PCR扩增反应的体系：10×buffer(with Mg²⁺)2.5μl，dNTP(各2.5mmol/l)1μl，正向引物(10μmol/l)0.5μl，反向引物(10μmol/l)0.5μl，Taq酶0.2μl，DNA组模板0.5μl，加去离子水至25μl。PCR扩增反应条件：94℃条件下预变性4min，94℃条件下变性45s，55℃的条件下退火45s，72℃的条件下延伸1min，这个过程循环30次，72℃的条件下延伸10min，PCR反应结束后于4℃条件下保存。

扩增所需基因后用1％的琼脂糖并加入核酸染色剂GelRed配制成凝胶块，在凝胶块中加入PCR产物和包含各种长度片段的DNA标记物(maker)并放置于电泳仪内，电泳仪内装入TBE(Tris硼酸)缓冲液，使电泳仪在150V，100mA条件下工作20min后取出，放置于300nm的紫外灯下进行观察以确定PCR产物扩增反应成功。然后将扩增成功的PCR产物送往华大基因科技有限公司测序，测序引物与扩增引物相同。通过将PCR产物进行基因测序得到的一个长为1400bp的H T2 16s rRNA基因序列，其序列如SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

该序列与GenBank中的已有序列进行比对，发现该菌与Bacillus属细菌关系最近，其中与Bacillus sp.FJAT-18017的同源性最高，达到99％(表1)。根据NCBI比对结果，选择相似性最高的模式菌株作为参比菌株，用MEGA6.0软件的邻接法(Neighbor-joining)构建系统发育树(图2)。根据16S rDNA序列同源性和形态分析将该菌鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，因此将本发明的芘降解菌命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)HT2。

表1为HT2芘降解菌株16S rRNA对比分析表

基于以上特征，所述菌种其分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)HT2，已于2018年1月15日保存在湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018035。

实施例2菌株HT2对不同浓度芘的降解作用

为了更好的研究菌株在不同芘的初始浓度下的降解效果影响规律，本实验设定了5种芘初始浓度，分别为10、25、50、100、200mg/L。具体过程是按10％(V/V)的比例将菌悬液接种至含有不同芘初始浓度的MSM培养基中，放在摇床中避光振荡培养20天后在芘浓度分别为10、25、50、100和200mg/L的MSM培养液中，菌株HT2对芘的降解率分别为80％、80.6％、80.9％、65％、45％见图3(a)。由图可知，菌株HT2对初始浓度为10-50mg/L的芘降解效率最高，达到了80％以上，随着芘浓度的增加，芘的剩余量也增加，这可能是由于有毒有害的中间代谢产物在高浓度芘降解过程中累积，对微生物的生长及对芘的利用产生了一定的抑制作用。另外，由图3(a)可以看出，菌株HT2对芘具有很强的耐受能力和稳定的降解能力，也就是说该菌对受PAHs污染的点或区域(如焦化废水、炼油废水受污染地环境等)的生物修复过程中具有较高的应用价值。

实施例3不同温度下菌株HT2对降解芘的影响效果

把菌株分别置于20℃、25℃、30℃、36℃、40℃下避光培养，20d后测定摇瓶中菲的残余量，测定结果见图3(b)。如图3(b)所示，在20、25℃时，菌株对芘的降解率仅为25％-30％，在30-40℃范围内，菌株对芘的降解效果显著升高，30℃时降解率最高，达到了80％，可以看出菌株最适宜的降解温度为30℃。另外，菌株在40℃时的降解率也达到了65％左右，说明该菌株可以在较高温度下，也能降解芘，能够耐受高温。30-40℃区间范围内随着温度的升高，降解率降低，这可能由于高温对微生物体内的酶活性产生影响，从而抑制微生物的生长。

实施例4不同pH值对菌株HT2降解芘的影响

调节MSM液体培养基为不同pH值(5-10)，设置芘浓度为50mg/L，测定培养20d后摇瓶中芘的剩余量。pH值对菌株降解芘效果的影响见图3(c)。在图3(c)中，菌株HT2在pH在7-10的范围内时降解效果都较好，降解率在75％-80％之间。说明碱性条件可促进菌株对芘的降解。这可能是由于碱性培养基中OH-正好可以中和芘降解过程产生的酸性物质所释放出来的H+，使微生物酶催化的反应向着芘降解的方向进行。

实施例5对其他芳香烃化合物的利用情况

本实验取适量芘的正己烷溶液，加入灭菌三角瓶中，待正己烷挥发完，加40ml MSM培养基，其他芳烃类化合物苯酚、水杨酸、邻苯二酚、1-萘酚直接加到MSM培养基中，终浓度在25-1000mg/L(浓度见表2)之间，加入HT2菌液，培养7天，然后采用平板稀释活菌计数法测定微生物数量。从表2中可以看出菌株HT2在不同浓度范围内的苯酚、水杨酸、邻苯二酚、1-萘酚、芘中可以生长，也就是说它们能够利用一定浓度范围内的这些底物为唯一碳源和能源进行生长和繁殖。由此推测出，芘能够对这几种芳烃类化合物进行降解。

表2 菌株HT2降解底物的多样性

表中，++：表示生长好，培养2天后菌密度是初始菌密度的4倍以上；+：表示可以生长，培养2天后后菌密度是初始菌密度的1-4倍；ND：没有做此浓度的试验。通过以上实验可知，菌株HT2对10-200mg/L浓度范围内的芘都有一定的降解能力。该降解菌菌株降解适宜环境温度在30-40℃范围内，在30℃时降解率可以达到80％；菌株HT2在pH为7时，对芘的降解效果最高，降解率为80％左右。能够利用一定浓度的苯酚、水杨酸、邻苯二酚和1-萘酚。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 中北大学

<120> 一种芽孢杆菌HT2及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1400

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌(Bacillus sp.)

<400> 1

gtcgagcggg gttttaaaag cttgctttta aaactttagc ggcggacggg tgagtaacac 60

gtgggcaacc tgcctgtaag actgggataa caccgggaaa ccggtgctaa taccggataa 120

atcctttctg acacatgtcg ggaagctgaa agacggtttc ggctgtcact tacagatggg 180

cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta atggctcacc aaggcaacga ttgcgtagcc 240

gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg 300

cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagcga 360

agaaggcctt cgggtcgtaa agctctgttg tcagggaaga acaagtaccg gagtaactgc 420

cggtaccttg acggtacctg accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt 480

aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagcgcgcg caggcggtcc 540

tttaagtctg atgtgaaagc ccacggctca accgtccagg gtcattggaa actgggggac 600

ttgagtgcag aagaggagag cgcaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg 660

agaacaccag tggcgaaggc ggctctctgg tctgtaactg acgctgaggc gcgaaagcgt 720

ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg 780

ttagggggtt tccgcccctt agtgctgcag caaacgcatt aagcactccg cctggggagt 840

acggccgcaa ggctgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg 900

tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcctc tgacaactct 960

ggagacagag cgttcccctt gggggacaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct 1020

cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgtgc ttagttgcca 1080

gcattcagtt gggcactcta gggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga 1140

cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gatggtacaa 1200

agggcagcga agccgcgagt gaagccaatc ccataaaacc attctcagtt cggattgcag 1260

gctgcaactc gcctgcatga agccggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt 1320

gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg 1380

aagttcggtg gggtaaccac 1400

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agtttgatcm tggctcag 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (7)

1.一种芽孢杆菌HT2，其特征在于，该菌株已于2018年1月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018035。

2.根据权利要求1所述的一种芽孢杆菌HT2，其特征在于，所述的芽孢杆菌HT2的16SrRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的一种芽孢杆菌HT2，其特征在于，所述的芽孢杆菌HT2经活化以后，在固体培养基制成的平板上生长24h，能形成直径为0.5-2.0mm黄色、圆形、表面光滑、微微向上凸起的、透明、边缘整齐的菌落。

4.权利要求1所述的芽孢杆菌HT2在环境污修复中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的环境污染指多环芳烃及芳烃类污染环境。

6.权利要求1所述的芽孢杆菌HT2在多环芳烃及芳烃类化合物降解中的应用。

7.权利要求1所述的芽孢杆菌HT2在芘降解中的应用。