CN102533578A - 多环芳烃降解微生物菌剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种多环芳烃降解微生物菌剂，其由浅黄分枝杆菌P6、微嗜酸寡营养单胞菌P56等2种菌株组成。本发明的菌剂具有降解土壤和污水多种多环芳烃的能力，具有修复多环芳烃污染土壤的显著效果，其在溶液中降解(芘和荧蒽)多环芳烃的能力为90％以上，具有很好的应用前景。

Description

多环芳烃降解微生物菌剂
技术领域
本发明属于微生物菌剂领域，具体地，涉及一种含有浅黄分枝杆菌和微嗜酸寡营养单胞菌的多环芳烃降解微生物菌剂。
背景技术
多环芳烃(PAHs)是指两个或两个以上苯环连在一起构成的烃类化合物，其中许多种类具有致癌、致畸、致突变作用，其毒性和致癌性随着苯环数目的增加而增加。环境中PAHs主要来源于人类活动，如石油冶炼、运输业、煤气制造等。由于石油及石油产品的大量使用，环境中多环芳烃有不断增多的趋势，而且分布广泛，在大气、水体、土壤、沉积物和食品中都可以检测到多种PAHs的存在。
环境中的多环芳烃主要是在微生物的降解作用下去除，随着多环芳烃环数的增加，其结构更加稳定，疏水性增强，从而使生物降解性降低，尤其是四环以上的PAH。因此，筛选出高效降解菌是多环芳烃污染土壤生物修复技术的一个关键。
目前国内外常用于多环芳烃降解是单一的纯化降解菌，是以PAH为唯一碳源从环境中分离纯化后得到的。由于在纯化过程中，失去了自然条件下与共协同共存菌株的作用，对环境适应能力和分解能力大大降低。
综上所述，利用多环芳烃降解微生物进行污染土壤的生物修复具有巨大的应用潜力。分枝杆菌是一个重要的具有四环及以上环PAHs较强降解能力的微生物类群，分枝杆菌降解PAHs的菌株筛选已有报道，但是分支杆菌的微生物菌剂及其对多环芳烃污染土壤的修复效果未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种多环芳烃降解微生物菌剂。
为了实现本发明的目的，本发明的多环芳烃降解微生物菌剂，其有效成分包括：浅黄分枝杆菌(Mycobacterium gilvum)P6和微嗜酸寡营养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)P56。
其中，本发明的浅黄分枝杆菌P6菌株，其分类命名为Mycobacterium gilvum，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCC4380，保藏日期2010年11月30日。
本发明的微嗜酸寡营养单胞菌P56菌株，其分类命名为Stenotrophomonas acidaminiphila，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCC4381，保藏日期2010年11月30日。
本发明的多环芳烃降解微生物菌剂，其包括如下体积比的组分：浅黄分枝杆菌P6：微嗜酸寡营养单胞菌P56＝1-2∶1。
所述菌剂同时可加入适量的无机盐成分，所述无机盐包括Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、NH4NO3、MgSO4.7H2O、FeCl3、CaCl2、MnSO4.2H2O、H3BO3、CoCl2.6H2O、CuCl2.2H2O、NiCl2.6H2O、Na2MoO4.2H2O和ZnCl2。
本发明的多环芳烃降解微生物菌剂在降解有机芳香化合物中的应用，其中所述的有机芳香化合物为多环芳烃，其包括芘、菲、荧蒽、芴、萘、蒽、苊。
本发明的浅黄分枝杆菌P6和微嗜酸寡营养单胞菌P56菌株分离自燕山石化炼油厂排污口污泥中。
本发明的浅黄分枝杆菌P6的形态学特征为：在Luria-Bertani固体培养中上30℃培养6天，形成肉可见的菌落，菌落为黄色，圆形，中间突起，光滑，边缘整齐，粘稠。革兰氏染色阳性，不产芽孢，短杆状。
本发明的浅黄分枝杆菌P6的生理生化特征为：该菌能以0～2％NaCl生长，接触酶为阳性，发酵乳糖、木糖、蔗糖、葡萄糖，不利用淀粉。根据16S rRNA碱基序列分析，与美国标准菌种保藏中心的编号为ATCC-43909的相似率为99％。
本发明的微嗜酸寡营养单胞菌P56的形态学特征为：在Luria-Bertani固体培养中上30℃培养6天，形成肉可见的菌落，起初为乳白色，随着菌龄增加颜色加深，最后为黄色，菌落圆形，中间突起，光滑，边缘整齐，粘稠。革兰氏染色阴性，不产芽孢。
本发明的微嗜酸寡营养单胞菌P56的生理生化特征为：该菌能发酵乳葡萄糖、蔗糖、甘露醇，水解淀粉，接触酶阳性。根据16S rRNA碱基序列分析，与美国标准菌种保藏中心的编号为ATCC-21910的相似率为99％。
本发明的浅黄分枝杆菌P6和微嗜酸寡营养单胞菌P56菌株的培养方法，包括如下步骤：
1)配制无机盐固体培养基，其中无机盐培养基的组成为：Na2HPO4.12H2O 8.8g，KH2PO43.0g，NH4NO31.0g，MgSO4.7H2O0.246g，FeCl30.05g，CaCl20.02g，微量元素溶液，2.5ml，蒸馏水1000ml。微量元素溶液的组成为：MnSO4.2H2O 0.06g，H3BO30.03g，CoCl2.6H2O 0.04g，CuCl2.2H2O 0.01g，NiCl2.6H2O 0.02g，Na2MoO4.2H2O 0.03g，ZnCl20.05g(pH7)，蒸馏水1000ml。
2)将培养基高温蒸气(121℃，30min)灭菌后，倒于灭菌的平板上，待培养基凝固后，加入0.5ml浓度为5g/L的芘的丙酮溶液，转动培养皿使丙酮溶液分布均匀，将培养皿在超净台中放置过夜，待丙酮挥发。
3)分别将菌P6和菌P56通过划线的方法接种于上述平板上，将平板倒置于30℃培养箱培养7天待菌落长出。
本发明的含有浅黄分枝杆菌P6和微嗜酸寡营养单胞菌P56的菌剂在降解有机芳香化合物中的应用，包括如下步骤：
1)配制LB固体培养基，LB培养基的组成为：酵母粉：5g，蛋白胨：10g，NaCl：5g，蒸馏水：1000ml，琼脂粉：15g，pH：7.2-7.4。
2)将菌P6和菌P56分别接种于LB平板培养基中，培养1～6天，待长出菌落后，将菌种刮于含玻璃珠的无菌水中，将菌打散形成菌液，调节菌液的浓度为OD600＝1，按浅黄分枝杆菌P6和微嗜酸寡营养单胞菌P56活菌数比为1-2∶1取P6和P56的菌液共0.5ml菌液接入装有20mL无机盐液体培养基(Na2HPO4.12H2O 8.8g，KH2PO43.0g，NH4NO31.0g，MgSO4.7H2O 0.246g，FeCl30.05g，CaCl20.02g，微量元素溶液，2.5ml，蒸馏水1000ml。微量元素溶液的组成为：MnSO4.2H2O0.06g，H3BO30.03g，CoCl2.6H2O 0.04g，CuCl2.2H2O 0.01g，NiCl2.6H2O0.02g，Na2MoO4.2H2O 0.03g，ZnCl20.05g，pH7，蒸馏水1000ml)的血清瓶中，血清瓶中预先加入5g/L芘的丙酮溶液0.1ml，并将丙酮挥发掉，培养基中荧蒽的最终浓度为50mg/L，30℃避光摇床培养，第2、4、7和10天取样，测定培养液中剩余的多环芳烃和菌体的生长量(培养液浊度)。
本发明的微生物菌剂由降解多种四环以上PAHs的安全的浅黄分枝杆菌P6、微嗜酸寡营养单胞菌P56等2个菌种组成。具有溶解土壤和污水中多种多环芳烃的能力，具有修复多环芳烃污染土壤的显著效果。
本发明的多环芳烃高效降解微生物菌剂对芘和荧蒽均能快速高效降解，在低浓度(20～35mg/L)时7天内即可降解85％以上的芘和荧蒽。高浓度(130～170mg/L)时，14天内可降解约90％以上的芘和荧蒽，芘和荧蒽同时存在且在高浓度下没有对菌的生长和降解产生抑制作用，因此该微生物菌剂具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明较佳实施例多环芳烃降解微生物菌剂降解芘的效果。
图2为本发明较佳实施例多环芳烃降解微生物菌剂降解芘和荧蒽混合物的效果，阴性对照CK不接菌。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例多环芳烃降解微生物菌剂的制备
本发明的浅黄分枝杆菌(Mycobacterium gilvum)P6和微嗜酸寡营养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)P56菌株分离自燕山石化炼油厂排污口污泥中。
筛选过程为：
在灭菌的三角瓶中添加芘的丙酮溶液，待丙酮挥发后，再加入灭菌的无机盐培养基，接入污泥，30℃摇床培养30天，待培养液变为棕色后，接入新的培养基中进行传代培养。连续传五代后，将培养液进行稀释，涂于无机盐加芘的固体平板上，待菌落长出后，将有透明圆的菌落挑出，并纯化。纯化后的菌落测定对芘的降解性能，选择降解率高的菌株，从而得到了菌株P6和P56。其中无机盐培养基的组成为Na2HPO4.12H2O 8.8g，KH2PO43.0g，NH4NO31.0g，MgSO4.7H2O0.246g，FeCl30.05g，CaCl20.02g，微量元素溶液，2.5ml，蒸馏水1000ml。微量元素溶液的组成为：MnSO4.2H2O 0.06g，H3BO30.03g，CoCl2.6H2O 0.04g，CuCl2.2H2O 0.01g，NiCl2.6H2O 0.02g，Na2MoO4.2H2O 0.03g，ZnCl20.05g(pH7)，蒸馏水1000ml。
本发明的浅黄分枝杆菌P6和微嗜酸寡营养单胞菌P56菌株的培养方法，包括如下步骤：
1)配制无机盐固体培养基，其中无机盐培养基的组成为：Na2HPO4.12H2O 8.8g，KH2PO43.0g，NH4NO31.0g，MgSO4.7H2O0.246g，FeCl30.05g，CaCl20.02g，微量元素溶液，2.5ml，蒸馏水1000ml。微量元素溶液的组成为：MnSO4.2H2O 0.06g，H3BO30.03g，CoCl2.6H2O 0.04g，CuCl2.2H2O 0.01g，NiCl2.6H2O  0.02g，Na2MoO4.2H2O 0.03g，ZnCl20.05g(pH7)，蒸馏水1000ml。
2)将培养基高温蒸气(121℃，30min)灭菌后，倒于灭菌的平板上，待培养基凝固后，加入0.5ml浓度为5g/L的芘的丙酮溶液，转动培养皿使丙酮溶液分布均匀，将培养皿在超净台中放置过夜，待丙酮挥发。
3)分别将菌P6和菌P56通过划线的方法接种于上述平板上，将平板倒置于30℃培养箱培养7天待菌落长出。
含有浅黄分枝杆菌P6和微嗜酸寡营养单胞菌P56的多环芳烃降解微生物菌剂的制备：包括1)配制LB固体培养基，LB培养基的组成为：酵母粉：5g，蛋白胨：10g，NaCl：5g，蒸馏水：1000ml，琼脂粉：15g，pH：7.2-7.4。
2)将菌P6和菌P56分别接种于LB平板培养基中，培养1～6天，待长出菌落后，将菌种刮于含玻璃珠的无菌水中，将菌打散形成菌液，调节菌液的浓度为OD600＝1，按浅黄分枝杆菌P6和微嗜酸寡营养单胞菌P56活菌数比为1-2∶1取P6和P56的菌液共0.5ml菌液接入20mL无机盐液体培养基(Na2HPO4.12H2O 8.8g，KH2PO43.0g，NH4NO31.0g，MgSO4.7H2O 0.246g，FeCl30.05g，CaCl20.02g，微量元素溶液，2.5ml，蒸馏水1000ml。微量元素溶液的组成为：MnSO4.2H2O 0.06g，H3BOX0.03g，CoCl2.6H2O 0.04g，CuCl2.2H2O 0.01g，NiCl2.6H2O 0.02g，Na2MoO4.2H2O 0.03g，ZnCl20.05g，pH7，蒸馏水1000ml)中即得。
实验例1本发明微生物菌剂降解多环芳烃-芘(Pyr)的实验
按浅黄分枝杆菌P6和微嗜酸寡营养单胞菌P56活菌数比为1-2∶1取P6和P56的菌液共0.5ml菌液接入装有20mL无机盐液体培养基(Na2HPO4.12H2O 8.8g，KH2PO43.0g，NH4NO31.0g，MgSO4.7H2O0.246g，FeCl30.05g，CaCl20.02g，微量元素溶液，2.5ml，蒸馏水1000ml。微量元素溶液的组成为：MnSO4.2H2O 0.06g，H3BO30.03g，CoCl2.6H2O 0.04g，CuCl2.2H2O 0.01g，NiCl2.6H2O  0.02g，Na2MoO4.2H2O 0.03g，ZnCl20.05g，pH7，蒸馏水1000ml)的血清瓶中，血清瓶中预先加入5g/L芘的丙酮溶液0.1ml，并将丙酮挥发掉，培养基中荧蒽的最终浓度为50mg/L，30℃避光摇床培养，第2、4、7和10天取样，测定培养液中剩余的多环芳烃和菌体的生长量(培养液浊度)。
结果如图1所示，该菌剂接入培养基后基本没有延迟期，培养液中的芘7天内由32mg/L降低到5.6mg/L，与之相对应的是菌体的生长量在第七天也达到了最大，由此可以看出芘浓度的降低伴随着菌体的增长，由于培养液中没有其他碳源，因此菌体生长的碳源的生长来自于芘，即菌剂PM可以快速降解芘，同时利用降解时产生的能量和碳源用于自身的生长、繁殖。
实验例2本发明微生物菌剂降解多环芳烃-芘(Pyr)和荧蒽(Flu)混合物的实验
改变血清瓶中多环芳烃的浓度，在其中加入5g/L荧蒽的丙酮溶液0.1ml；同时再加入5g/L芘的丙酮溶液0.1ml，并将丙酮挥发掉，使培养基中同时含有芘和荧蒽，它们的最终浓度分别为100mg/L，接入降解菌系后30℃避光摇床培养，第7天和14天取样，测定培养液中剩余的多环芳烃。阴性对照CK为无机盐培养基中只添加芘或荧蒽，不接菌。
结果如图2所示，荧蒽的加入没有影响菌系对芘的降解，14天后芘的去除率达到了90％以上。同时荧蒽也得到快速降解，7天后的去除率也达到90％以上，其降解趋势与芘的相同，因此该可以同时利用芘和荧蒽作为碳源和能源进行代谢和生长。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.浅黄分枝杆菌(Mycobacterium gilvum)P6，其保藏号为CGMCC4380。
2.微嗜酸寡营养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)P56，其保藏号为CGMCC4381。
3.一种多环芳烃降解微生物菌剂，其包括：
浅黄分枝杆菌(Mycobacterium gilvum)P6，保藏号CGMCC4380；
微嗜酸寡营养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)P56，保藏号CGMCC4381。
4.如权利要求3所述的菌剂，其中浅黄分枝杆菌P6和微嗜酸寡营养单胞菌P56活菌数比为1-2∶1。
5.如权利要求4所述的菌剂，其特征在于，还进一步添加适量的Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、NH4NO3、MgSO4.7H2O、FeCl3、CaCl2、MnSO4.2H2O、H3BO3、CoCl2.6H2O、CuCl2.2H2O、NiCl2.6H2O、Na2MoO4.2H2O和ZnCl2。
6.权利要求3-5任一所述的菌剂在降解有机芳香化合物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的有机芳香化合物为多环芳烃。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的多环芳烃为芘、菲、荧蒽、芴、萘、蒽或苊及其衍生物。
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