CN103756928B - 用于降解对二甲苯的菌株及其培养方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于降解对二甲苯的菌株及其培养方法和应用，菌株命名为潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号:CGMCC NO.7897，保藏日期：2013年07月08日。本发明提供的用于降解对二甲苯的菌株为好氧型革兰氏染色阴性菌，可利用对二甲苯作为唯一碳源和能源进行生长，并将其彻底矿化成CO2和H2O。在纯培养条件下，该菌株于25～35℃、pH=4～8条件下均能降解对二甲苯。该菌株具有良好的底物适应能力和底物宽泛性，可同时降解对二甲苯、甲苯。该菌株为生物法处理有机废气的工业应用奠定了基础。

Description

用于降解对二甲苯的菌株及其培养方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物菌株领域，具体涉及一种用于降解对二甲苯的菌株及其培养方法和应用。
背景技术
当前，精细化工行业产生的大气量低浓度的有机废气所引起的环境问题及潜在健康问题正日益受到关注。精细化工行业产生的挥发性有机物(VOCs)，因其种类繁多，分布广，毒性大，具有污染面广、气量大、浓度低等特点，同时污染所引发的问题复杂，已被视为继粉尘以后的第二大类量大面广的大气污染物。根据行业内的推算，目前全国总的工业VOCs年排放量应该在2000万吨以上，达到甚至超过了全国NOx的排放水平，而且随着国民经济的发展呈现出不断增长的趋势。根据美国环保总局（EPA）的2008年统计数据，美国的VOCs年排放水平已超过1378万吨。工业排放的VOCs大多具有一定的环境毒性，如：有毒、有恶臭、产生光化学烟雾，破坏臭氧层、引发温室效应及酸雨等；部分甚至有“三致”作用，直接危害人体健康。
二甲苯（Xylene）作为一种常用的精细化工原料及有机溶剂，主要来自于石油化工行业的石油提炼过程；其中，约45%的混合二甲苯用于对二甲苯（P-xylene）的生产，其他用途还包括作为有机溶剂使用（5.2%）、生产邻二甲苯（7.7%）、生产间二甲苯（2.0%）及混合汽油（39%）等。对二甲苯是一种重要的有机化工原料，主要用于生产精对苯二甲酸（PTA）或对苯二甲酸二甲酯（DMT），PTA或DMT再和乙二醇反应生成聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET），即聚酯，进一步加工纺丝生产涤纶纤维，轮胎工业用聚酯帘布以及聚酯瓶、聚酯膜、塑料合金及其它工业元件等；除此之外，对二甲苯在医药化工行业也有用途。对二甲苯作为一种常见的挥发性有机物（饱和蒸汽压8.84mmHg，25℃），对二甲苯具有较高的毒性和潜在致癌、致突变作用，同时也是美国EPA《清洁空气修正案（1990）》中规定的189种优先控制的有毒空气污染物之一。近年来，因对二甲苯项目产生的环境问题而引发群体性事件在我国也时有发生。在对二甲苯的生产使用过程中产生的大量含对二甲苯有机废气，会对周围人民群众的身体健康和生态环境产生不可忽视的影响；因而，含对二甲苯有机废气控制技术的研究开发迫在眉睫。
生物法由于具有处理效果好、投资及运行费用低、反应条件温和（常温，常压）、无二次污染、易于管理操作等优点，尤其在处理大流量、低浓度的有机废气时更显其经济性和优越性，因而受到了越来越多的重视，当前在我国也得到一定程度的工业应用。针对特定挥发性有机物（如苯系物、氯代烃及恶臭类）的高效微生物菌株的选育对于有机废气生物处理装置的处理效果及长期稳定运行至关重要；而专门针对对二甲苯降解菌株的筛选分离在当前国内有机废气治理领域仍属于起步阶段。
当前国内外研究中，针对含对二甲苯有机废气进行高效降解菌株分离鉴定的报道并不多见。2010年，Amelia-Elena Rotaru(FEMS MicrobiologyEcology,2010,71:460-468)等从自来水厌氧环境的脱氮菌群中分离出可同时利用对二甲苯作为唯一碳源和电子供体的微生物菌群；2012年，武汉科技大学魏鑫(化工环保，2012,6:498-501)等从某石化废水活性污泥中分离出一株可利用对二甲苯作为唯一碳源的假单胞菌，用于石化废水和焦化废水的治理；然而，以上研究并未对相关菌株的培养条件、分离纯化方法进行优化分析，同时也未涉及含对二甲苯有机废气的处理。
因此，筛选分离并利用定向驯化方法获得可降解对二甲苯的高效降解菌株，并分析其降解特性，从而为利用生物处理技术进行精细化工行业含对二甲苯有机废气的治理提供一定的基础数据，具有一定工业应用前景。
发明内容
本发明提供了一种用于降解对二甲苯的菌株，该菌株可有效降解对二甲苯。
一种用于降解对二甲苯的菌株，命名为潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1，保藏号为CGMCC NO.7897。
该菌株的具体保藏如下：
名称：潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC；
保藏单位的地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
保藏日期：2013年07月08日；
保藏编号：CGMCC NO.7897。
潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1属于Pandoraea属；菌落呈小圆状，较透明，边缘光滑整齐，直径0.2mm左右；菌体细胞呈长杆状，2.0μm左右，端生鞭毛，有夹膜，无芽孢；为好氧型革兰氏阴性菌。
本发明还提供了一种用于降解对二甲苯的菌株的培养方法，从医药化工企业提取活性污泥，该污泥样品经长期通入气态污染物（对二甲苯）进行曝气定向驯化后，将菌液涂布于固态培养基平板上分离单菌落，置于无机盐培养基添加目标污染物（对二甲苯）进行分离纯化，重复筛选分离得到一株具有高效降解特性的目标菌株。
一种用于降解对二甲苯的菌株的培养方法，包括以下步骤：
1）取制药厂污水排放口的活性污泥，通入对二甲苯进行曝气驯化，稳定后将活性污泥、无机盐培养基和对二甲苯加入到培养瓶中，在摇床内培养，得到微生物群落；
2）利用R2A固体培养基结合稀释涂布法和划线法进行目标菌株的纯化分离，得到用于降解对二甲苯的菌株。
制药厂为浙江省东阳市浙江普洛康裕生物制药有限公司。
所述的活性污泥、无机盐培养基和对二甲苯的体积比为1：30～70：0.005～0.05。
进一步，所述的活性污泥、无机盐培养基和对二甲苯的体积比为1：50：0.01～0.02。
以无机盐培养基1L计，所述的无机盐培养基由如下重量的组分组成：
以R2A固体培养基1L计，所述的R2A固体培养基由如下重量的组分组成：
利用R2A固体培养基结合稀释涂布法和划线法进行目标菌株的纯化分离，即将步骤1）得到的微生物群落用R2A固体培养基用无菌去离子水按10倍稀释法进行系列稀释，取10-4到10-8稀释倍数的菌液涂布于R2A固体培养基的平板，倒置于恒温培养箱，30℃培养2～3天，挑取单菌落于含无机盐培养基的培养瓶内，加入对二甲苯考察其降解效果，再将具有高效降解效果菌液进行再次纯化，如此重复若干周期后（3～5次），根据平板上菌落的生长情况、表观特性的差异判断，获得一株降解效果良好的纯菌株，即用于降解对二甲苯的菌株。
本发明用于降解对二甲苯的菌株可用于处理含对二甲苯的有机废气。具体为将本发明用于降解对二甲苯的菌株接种至生物滴滤装置内进行含对二甲苯的有机废气处理，经挂膜驯化至稳定阶段即可，获得了良好的对二甲苯去除效果。
本发明用于降解对二甲苯的菌株降解对二甲苯在25～35℃，pH=4～8条件下进行，优选在在30～35℃，pH=6～7条件下进行，可在90h内将无机盐培养基中不同初始浓度（0～70mg/L，以培养瓶的体积计算）的对二甲苯彻底降解矿化，具有较强的底物适应能力；该菌株还有良好的底物宽泛性，可同时将对二甲苯、甲苯等苯系物作为碳源和能源加以利用并彻底矿化成H2O和CO2。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明用于降解对二甲苯的菌株，命名为潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1，保藏号为CGMCC NO.7897，该菌株为好氧型革兰氏染色阴性菌，具有对二甲苯的高效降解能力，能够以对二甲苯为碳源和能源进行生长并完全降解不同初始浓度底物；该菌株能以共代谢方式同时降解对二甲苯和甲苯；本发明为生物法处理含对二甲苯的有机废气的工业应用奠定了基础。
在现有技术中，迄今国内外尚未有Pandoraea属菌株降解对二甲苯的报道。
附图说明
图1为潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1的透射电镜照片；
图2为潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1的16s rRNA基因片段系统发育关系；
图3为不同温度下潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1降解对二甲苯的特性；
图4为不同pH值下潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1降解对二甲苯的特性；
图5为不同初始浓度潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1降解对二甲苯的特性；
图6为潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1同时降解对二甲苯、甲苯的特性；
图7为潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1接种至生物滴滤装置处理含对二甲苯的模拟有机废气。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不限于此：
实施例1：菌株的分离与鉴定：
1.菌株的驯化选育：
将取自制药厂（2011年3月、浙江省东阳市浙江普洛康裕生物制药有限公司）污水排放口的活性污泥通入目标污染物（对二甲苯）进行曝气驯化稳定后（至少1个月），并在恒温摇床内利用300mL培养瓶，添加1mL活性污泥、50mL无机盐培养基和10～20μL目标污染物（对二甲苯）后，富集若干周期（3～5次），获得可降解目标污染物（对二甲苯）的微生物群落；利用R2A固体培养基（10倍稀释涂布法、划线法）进行可降解菌株的纯化分离，即将微生物群落用无菌去离子水按10倍稀释法进行系列稀释，取10-4到10-8稀释倍数的菌液涂布于R2A固体培养基的平板，倒置于恒温培养箱，30℃培养2～3天，挑取单菌落于含无机盐培养基的培养瓶内，加入目标污染物（对二甲苯）考察其降解效果，再将具有高效降解效果菌液进行再次纯化，如此重复若干周期后（3～5次），根据平板上菌落的生长情况、表观特性的差异判断，获得一株降解效果良好的纯菌株，即用于降解对二甲苯的菌株。该菌株命名为潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1。该菌株的短期保藏，接入R2A固体培养基（斜面培养基），于冰箱4℃保藏。长期保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2013年07月08日，保藏编号：CGMCC NO.7897。。
2.培养条件：
以无机盐培养基1L计，无机盐培养由如下重量的组分组成：
2.5g(NH4)2SO4、0.1g MgCl2·6H2O、0.01g EDTA、0.002g ZnSO4·7H2O、0.001g CaCl2·2H2O、0.005g FeSO4·7H2O、0.0002g Na2MoO4·2H2O、0.0002gCuSO4·5H2O、0.0004g CoCl2·6H2O、0.001g MnCl2·4H2O、1.6g K2HPO4、0.8g NaH2PO4·2H2O以及余量的去离子水。
以R2A固体培养基1L计，所述的R2A固体培养基由如下重量的组分组成：
0.5g酵母粉、0.5g胰蛋白胨、0.5g酪蛋白氨基酸、0.5g葡萄糖、0.5g可溶性淀粉、0.3g K2HPO4、0.05g MgSO4·7H2O、0.3g丙酮酸钠、15.0g琼脂以及余量的去离子水；搅拌溶解，调pH到7.2后，121℃灭菌15min。
培养条件：适宜生长pH范围为6.0～7.5；适宜生长温度为25～35℃。
3.菌株形态及分子生物学鉴定：
该菌属于Pandoraea属，菌落呈小圆状，较透明，边缘光滑整齐，直径0.2mm左右；如图1所示，菌体细胞呈长杆状，2.0μm左右，端生鞭毛，有夹膜，无芽孢；为好氧型革兰氏阴性菌。
得到的用于降解对二甲苯的菌株测得其16S rRNA基因序列与GenBank中的已知基因序列进行同源性比对，发现它与Pandoraea属的多个菌株序列相似性都达到98%以上。选取若干菌株的基因序列利用Mega5.0软件将这些相应序列与该菌序列进行同源性比较，建立系统进化树（如图2），并上传基因序列至Genbank，获取基因序列号（KF233594）；通过构建系统发育关系，确定该菌株与Pandoraea pnomenusa的亲缘关系最近，相似度大于99%；因此，将该菌株归属为Pandoraea属，并命名为潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1。
实施例2：潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1的降解特性
1.不同温度条件（25～35℃）下的潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1的降解特性：
以对二甲苯作为潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1的唯一碳源，接种3mL对数期菌悬液（OD600nm=0.235）于100mL无机盐培养基（初始pH=6.5）并置于630mL密封培养瓶内（各温度条件下分别设计2个平行样和1个空白对照组），加入对二甲苯使体系内初始浓度为41.0mg/L，分别置于25、30、35℃，150r/min恒温摇床内连续培养，间隔一定时间取样分析（结果如图3）。本实施例说明，在较高的对二甲苯初始浓度（41.0mg/L）时，温度为35℃时的降解特性明显优于25℃和30℃时；其中，25℃最不利于潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1的降解，即30～35℃是其最适生长温度；结果表明，在不同温度环境中潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1均能不同程度的降解对二甲苯。
2.不同pH条件（4～8）下的潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1的降解特性：
用1mol/L NaOH水溶液或1mol/L HCl调节630mL密封培养瓶（各条件下设计2个平行样和1个空白对照组）内的100mL无机盐培养基的pH分别为4、5、6、6.5、7、8；在初始对二甲苯浓度为41.0mg/L的条件下，加入3mL对数期菌悬液（OD600nm=0.170），分别置于35℃、150r/min恒温摇床内连续培养，间隔一定时间取样分析（结果如图4）。结果表明，在pH值为6～7时，在对二甲苯的逐步降解过程中，其降解特性明显优于其他pH值；pH值的过高或过低（小于4或大于8），都会影响该菌株的降解过程（底物降解不完全），即pH值为6～7是其最适降解范围；在不同pH环境中潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1均能不同程度的降解对二甲苯，为其在不同pH环境中的应用提供了保证。
3.不同初始浓度下的潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1的降解特性：
以对二甲苯作为潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1的唯一碳源，接种3mL对数期菌悬液（OD600nm=0.082）于100mL无机盐培养基（初始pH=6.5）并置于630mL密封培养瓶内（各初始浓度下分别设计2个平行样和1个空白对照组），加入对二甲苯使体系内初始浓度分别为6.9mg/L、13.7mg/L、27.6mg/L、41.0mg/L、54.7mg/L、67.8mg/L，分别置于35℃、150r/min恒温摇床内连续培养，间隔一定时间取样分析（结果如图5）。结果表明，潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1可分别在14～90h降解不同初始浓度的对二甲苯，并且具有高效稳定的降解能力。
4.潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1同时降解对二甲苯、甲苯：
以对二甲苯、甲苯同时作为潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1作为碳源同一630mL密封培养瓶内（设计2个平行样和1个空白对照组）考察其降解特性，接种3mL对数期菌悬液（OD600nm=0.149）至100mL无机盐培养基（初始pH=6.5）内，加入对二甲苯和甲苯，使其初始浓度分别为13.89mg/L、14.03mg/L，分别置于35℃、150r/min恒温摇床内连续培养，间隔一定时间取样分析（结果如图6）。结果表明，潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1在24h内主要降解体系内的对二甲苯，而甲苯降解量较少，然而在后期12h内甲苯主要被降解，在36h内将对二甲苯、甲苯几乎完全降解，说明该菌株具有良好的底物宽泛性。
实施例3：潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1接种至生物滴滤装置处理含对二甲苯模拟有机废气
采用申请号为201210019232.2中国专利申请公开的生物滴滤装置和方法，将潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1接种至生物滴滤装置内进行含对二甲苯有机废气的处理，经挂膜驯化至稳定阶段，即以对二甲苯为目标污染物配制模拟有机废气，将潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1菌悬液接种至生物滴滤装置经过挂膜驯化至稳定运行，进行含对二甲苯模拟有机废气处理（结果如图7）。结果表明，该生物滴滤装置经过14天左右的挂膜驯化过程，达到稳定运行阶段。在挂膜驯化前期（1～10天），进气浓度保持在200～800mg/m3范围内，对二甲苯的去除效率不稳定（50%～80%）；进入到挂膜驯化阶段后期，维持其进气浓度在800～1000mg/m3范围内，去除效率由70%逐渐上升至90%左右，并保持稳定高效的对二甲苯去除效果；后期稳定阶段（18～24天）也考察不同停留时间（20s、40s、60s、80s、100s，相应进气量分别为1.98m3/h，0.99m3/h，0.66m3/h，0.50m3/h，0.40m3/h）的对二甲苯去除效果。以上数据充分说明，接种潘朵拉菌（Pandoraea sp.）WL1的生物滴滤装置经过约14天的短期挂膜驯化即可达到稳定运行，并且获得了良好的含对二甲苯模拟有机废气去除效果，具有良好的工业应用前景。

Claims (4)

1.一种用于降解对二甲苯的菌株，其特征在于，命名为潘朵拉菌(Pandoraea sp.)WL1，保藏号为CGMCC NO.7897。
2.如权利要求1所述的用于降解对二甲苯的菌株在处理含对二甲苯有机废气中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，将权利要求1所述的用于降解对二甲苯的菌株接种至生物滴滤装置内进行含对二甲苯的有机废气处理，经挂膜驯化至稳定阶段即可。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，降解对二甲苯在25～35℃、pH＝4～8条件下进行。
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