CN103667119B - 用于降解乙硫醇的菌株及其培养方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于降解乙硫醇的菌株及其培养方法和应用，该菌株命名为假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2，保藏号为CGMCC NO.7898，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日期：2013年07月08日。本发明提供的用于降解乙硫醇的菌株为好氧型革兰氏染色阴性菌，可利用乙硫醇作为唯一碳源和能源进行生长，并将其彻底矿化成CO2和H2O。在纯培养条件下，该菌株于25～30℃、pH=6～8条件下均能降解乙硫醇。该菌株具有良好的底物适应能力和底物宽泛性，也可降解丙硫醇、甲醇。该菌株为生物法处理含硫恶臭类有机废气的工业应用奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及微生物菌株领域，具体涉及一种用于降解乙硫醇的菌株及其培养方法和应用。
背景技术
当前，石油化工行业常见的恶臭类含硫有机物如甲硫醇、乙硫醇、甲硫醚、丙硫醇、二甲二硫醚等污染物具有嗅阈值低、毒性大等特点，对人体健康和周围环境的影响日益显著。然而，迄今国内外关于硫醇、硫醚等含硫有机物的污染治理鲜有述及。作为石油化工行业最典型的恶臭污染物，含硫恶臭有机污染物的高效去除，已成为有机废气治理领域的一大难点。
乙硫醇（Ethyl mercaptan）作为一种典型含硫恶臭有机物，具有挥发性大（饱和蒸汽压529mmHg，25℃）、刺激性强、嗅阈值极低（0.00014ppm）以及毒性大等特点，常作为原料或中间体用于塑料、杀虫剂和抗氧化剂的工业生产，用于医药合成和天然气/煤气漏气指示剂。同H2S类似，长期接触一定浓度的乙硫醇，可导致人体神经中枢系统及呼吸系统发生病变，甚至是呼吸衰竭致死。
对硫醇、硫醚等恶臭性有机废气，生物净化法是近年发展起来的新技术，具有投资和运行费用低、操作简单、无二次污染等优点。目前，生物填料塔工艺已成为日本、欧美等发达国家脱臭的主流技术之一；我国生物法处理恶臭气体的研究工作起步于上世纪90年代，现已具有一定的研究基础。作为影响生物处理装置除臭效率的关键因素，能够高效降解硫醇、硫醚等含硫有机污染物的特定微生物菌株的筛选分离仍是当前研究领域的技术空白。
授权公告号为CN 101234280B（申请号为200710031286.X）的中国发明专利公开了一种恶臭废气的吸收-生物处理方法，以喷淋吸收塔和生物滴滤装置作为关键处理技术，进行含硫化氢、硫醇类、二甲基硫醚以及二甲基二硫醚等气态恶臭污染物的去除，可实现达标排放；然而，该发明主要进行了工艺研究，并未对相关特定的恶臭类有机物降解菌株及降解特性进行分离鉴定、分析。
2012年，华中师范大学陈亮(硕士学位论文：乙硫醇快速脱臭菌的筛选及其培养基的优化)等以20ppm乙硫醇为目标污染物，进行了相关快速脱臭菌的筛选及降解能力分析，最大去除率低于50%；该研究虽获得了若干株芽孢杆菌属菌株，但是其降解能力较差，在实际工业过程中应用价值不大。
因此，筛选分离并利用定向驯化方法获得可降解乙硫醇的高效降解菌株，并分析其降解特性，从而为利用生物处理技术进行含硫醇恶臭类有机废气的治理提供一定的基础数据，具有一定工业应用前景。
发明内容
本发明提供了一种用于降解乙硫醇的菌株，该菌株可有效降解乙硫醇。
一种用于降解乙硫醇的菌株，命名为假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2，保藏号为CGMCC NO.7898。
该菌株的具体保藏如下：
名称：假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC；
保藏单位的地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
保藏日期：2013年07月08日；
保藏编号：CGMCC NO.7898。
假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2属于Pseudomonas属，菌落呈大圆状，乳白色，边缘光滑整齐，直径1.0mm左右；菌体细胞呈短杆状，1.0μm左右，端生鞭毛，无夹膜，无芽孢；为好氧型革兰氏阴性菌。
本发明还提供了一种用于降解乙硫醇的菌株的培养方法，从医药化工企业提取活性污泥，该污泥样品经长期通入气态污染物（乙硫醇）进行曝气定向驯化后，将菌液涂布于固态培养基平板上分离单菌落，置于无机盐培养基添加目标污染物（乙硫醇）进行分离纯化，重复筛选分离若干次后得到一株具有高效降解特性的目标菌株。
一种用于降解乙硫醇的菌株的培养方法，包括以下步骤：
1）取制药厂污水排放口的活性污泥，通入乙硫醇进行曝气驯化，稳定后将活性污泥、无机盐培养基和乙硫醇加入到培养瓶中，在摇床内培养，得到微生物群落；
2）利用R2A固体培养基结合稀释涂布法和划线法进行目标菌株的纯化分离，得到用于降解乙硫醇的菌株。
制药厂为位于浙江省新昌县的浙江医药股份有限公司新昌制药厂。
所述的活性污泥、无机盐培养基和乙硫醇的体积比为1：30～70：0.005～0.05。
进一步，所述的活性污泥、无机盐培养基和乙硫醇的体积比为1：50：0.01～0.02。
以无机盐培养基1L计，所述的无机盐培养基由如下重量的组分配制而成：
以R2A固体培养基1L计，所述的R2A固体培养基由如下重量的组分组成：
利用R2A固体培养基结合稀释涂布法和划线法进行目标菌株的纯化分离，即将步骤1）得到的微生物群落用无菌去离子水按10倍稀释法进行系列稀释，取10-4到10-8稀释倍数的菌液涂布于R2A固体培养基的平板，倒置于恒温培养箱，30℃培养2～3天，挑取单菌落于含无机盐培养基的培养瓶内，加入乙硫醇考察其降解效果，再将具有高效降解效果菌液进行再次纯化，如此重复若干周期后（3～5次），根据平板上菌落的生长情况、表观特性的差异判断，获得一株降解效果良好的纯菌株，即用于降解乙硫醇的菌株。
本发明用于降解乙硫醇的菌株可用于处理含乙硫醇的有机废气，能将其彻底矿化，实现乙硫醇的高效降解。
本发明所述的假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2降解乙硫醇在25～35℃，pH=4～8条件下进行，优选在25～30℃，pH=6～7.5条件下进行；假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2可利用乙硫醇作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，并将其完全矿化成CO2和H2O。
在纯培养条件下，该假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2可在48h左右将无机盐培养基中不同初始浓度(0～30mg/L)的乙硫醇彻底降解矿化。
假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2可利用乙硫醇、丙硫醇及甲醇等作为碳源和能源进行生长、并将其彻底矿化，具有良好的底物宽泛性。
本发明的有益效果主要体现在：
本发明用于降解乙硫醇的菌株，命名为假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2，保藏号为CGMCC NO.7898，该菌株为好氧型革兰氏染色阴性菌，能够以乙硫醇为唯一碳源和能源进行生长并完全降解不同初始浓度底物，能够对乙硫醇高效降解；该菌株还能降解丙硫醇、甲醇等其他挥发性有机物；本发明为生物法处理含硫醇等恶臭类有机废气的工业应用奠定了基础。
现有技术中，迄今尚未有Pseudomonas属菌株降解乙硫醇的专利报道。
附图说明
图1为假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2的透射电镜照片；
图2为假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2的16s rRNA基因片段系统发育关系；
图3为不同温度下假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2降解乙硫醇的特性；
图4为不同pH值下假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2降解乙硫醇的特性；
图5为不同初始浓度假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2降解乙硫醇的特性；
图6为假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2降解乙硫醇、丙硫醇及甲醇的特性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不限于此：
实施例1：菌株的分离与鉴定：
1.菌株的驯化选育
将取自制药厂（2012年9月、位于浙江省新昌县的浙江医药股份有限公司新昌制药厂）污水排放口的活性污泥，向活性污泥通入目标污染物（乙硫醇）进行曝气驯化稳定后（至少1个月），并在恒温摇床内利用300mL培养瓶，添加1mL活性污泥、50mL无机盐培养基和10～20μL目标污染物后，富集若干周期（3～5次），获得可降解目标污染物的微生物群落；利用R2A固体培养基（10倍稀释涂布法、划线法）进行可降解菌株的纯化分离，即将微生物群落用无菌去离子水按10倍稀释法进行系列稀释，取10-4到10-8稀释倍数的菌液涂布于R2A固体培养基的平板，倒置于恒温培养箱，30℃培养2～3天，挑取单菌落于含无机盐培养基的培养瓶内，加入目标污染物（乙硫醇）考察其降解效果，再将具有高效降解效果菌液进行再次纯化，如此重复若干周期后（3～5次），根据平板上菌落的生长情况、表观特性的差异判断，获得一株降解效果良好的纯菌株，即用于降解乙硫醇的菌株。该菌株命名为假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2。该菌株的短期保藏，接入R2A固体培养基（斜面培养基），于冰箱4℃保藏。长期保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2013年07月08日，保藏编号：CGMCC NO.7898。
2.培养条件
以无机盐培养基1L计，所述的无机盐培养基由如下重量的组分配制而成：
1.5g NH4Cl，0.2g MgCl2，4.5g Na2HPO4，1.0g KH2PO4、1mL微量元素母液（微量元素母液中各组分如下：10g/L FeCl2·4H2O、0.02g/L CuCl2、0.014g/L H3BO3、0.1g/L MnCl2·4H2O、0.1g/L ZnCl2、0.02g/L Na2MoO4·2H2O、0.02g/L CoCl2·6H2O以及余量的去离子水）以及余量的去离子水。
以R2A固体培养基1L计，所述的R2A固体培养基由如下重量的组分组成：
0.5g酵母粉、0.5g胰蛋白胨、0.5g酪蛋白氨基酸、0.5g葡萄糖、0.5g可溶性淀粉、0.3g K2HPO4、0.05g MgSO4·7H2O、0.3g丙酮酸钠、15.0g琼脂以及余量的去离子水；搅拌溶解，调pH到7.2后，121℃灭菌15min。
培养条件：适宜生长pH范围为6.0～7.5；适宜生长温度为25～30℃。
3.菌株形态及分子生物学鉴定
该菌属于Pseudomonas属，菌落呈大圆状，乳白色，边缘光滑整齐，直径1.0mm左右；如图1所示，菌体细胞呈短杆状，1.0μm左右，端生鞭毛，无夹膜，无芽孢；为好氧型革兰氏阴性菌；
将该菌株的测得16S rRNA基因序列与GenBank中的已知基因序列进行同源性比对，发现它与Pseudomonas属的多个菌株序列相似性都达到98%以上。选取若干菌株的基因序列利用Mega5.0软件将这些相应序列与该菌序列进行同源性比较，建立系统进化树（如图2），并上传基因序列至Genbank，获取基因序列号（KF233595）；通过构建系统发育关系，确定该菌株与Pseudomonas putida的亲缘关系最近，相似度大于99%；因此，将该菌株归属为Pseudomonas属，并命名为假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2。
实施例2：假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2的降解特性
1.不同温度条件（25～35℃）下的假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2降解特性：
以乙硫醇作为假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2的唯一碳源，接种3mL对数期菌悬液（OD600nm=0.115）于100mL无机盐培养基（初始pH=6.7）并置于630mL密封培养瓶内（各温度条件下分别设计2个平行样和1个空白对照组），加入乙硫醇使体系内初始浓度为13.5mg/L，分别置于25、30、35℃，150r/min恒温摇床内连续培养，间隔一定时间取样分析（结果如图3）。本实施例说明，在乙硫醇初始浓度为13.5mg/L时，温度为25℃时的降解特性明显优于25℃和35℃时；其中，35℃最不利于假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2的降解，即25～30℃是其最适生长温度；结果表明，在不同温度环境中假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2均能不同程度的降解乙硫醇。
2.不同pH条件（4～8）下假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2的降解特性：
用1mol/L NaOH水溶液或1mol/L HCl调节630mL密封培养瓶（各条件下设计2个平行样和1个空白对照组）内的100mL无机盐培养基的pH分别为4、5、6、6.5、7、7.5、8；在初始乙硫醇浓度为13.5mg/L的条件下，加入3mL对数期菌悬液（OD600nm=0.123），分别置于25℃、150r/min恒温摇床内连续培养，间隔一定时间取样分析（结果如图4）。结果表明，在pH值为6～7.5时，在乙硫醇的逐步降解过程中，其降解特性明显优于其他pH值；pH值的过高或过低（小于5或大于8），都会影响该菌株的降解过程（底物降解不完全），即pH值为6～7.5是其最适降解范围；在不同pH环境中假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2均能不同程度的降解乙硫醇，为其在不同pH环境中的应用提供了保证。
3.不同初始浓度下假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2的降解特性：
以乙硫醇作为假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2的唯一碳源，接种3mL对数期菌悬液（OD600nm=0.109）于100mL无机盐培养基（初始pH=6.5）并置于630mL密封培养瓶内（各初始浓度下分别设计2个平行样和1个空白对照组），加入乙硫醇使体系内初始浓度分别为6.71mg/L、13.55mg/L、27.1mg/L，分别置于25℃、150r/min恒温摇床内连续培养，间隔一定时间取样分析（结果如图5）。结果表明，该菌株假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2可分别在48h左右降解不同初始浓度的乙硫醇，并且具有高效稳定的降解能力。
4.假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2降解乙硫醇、丙硫醇及甲醇的特性：
以乙硫醇、丙硫醇及甲醇分别作为假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2的唯一碳源和能源，并于630mL密封培养瓶内（设计2个平行样和1个空白对照组）考察其降解特性，接种3mL对数期菌悬液（OD600nm=0.119）至100mL无机盐培养基（初始pH=6.5）内，分别加入乙硫醇、丙硫醇及甲醇，使其初始浓度分别为13.55mg/L、13.56mg/L及12.57mg/L，分别置于25℃、150r/min恒温摇床内连续培养，间隔一定时间取样分析（结果如图6）。结果表明，该菌株假单胞菌（Pseudomonas sp.）WL2在24h内即可降解一定量的目标底物，然而在后期12h内（36h内）将乙硫醇、丙硫醇及甲醇几乎完全降解，说明该菌株具有良好的底物宽泛性。
Claims (3)
1.一种用于降解乙硫醇的菌株，其特征在于，命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)WL2，保藏号为CGMCC NO.7898。
2.如权利要求1所述的用于降解乙硫醇的菌株在处理含乙硫醇的有机废气中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，降解乙硫醇在25～35℃，pH＝4～8条件下进行。
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