CN103409349B - 长野雷夫松氏菌及其对十溴联苯醚的降解方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种长野雷夫松氏菌及其对十溴联苯醚的降解方法，其保藏编号为：CGMCC NO.7872；其降解十溴联苯醚的方法为将长野雷夫松氏菌接种于十溴联苯醚降解培养基，在pH6.8～7.2、30℃条件下摇床培养120h，摇床的转动频率150rpm。本发明的长野雷夫松氏菌对十溴联苯醚的降解效率高，达到90.08%。

Description

长野雷夫松氏菌及其对十溴联苯醚的降解方法

技术领域

本发明属于有机污染物的微生物及其降解领域，特别涉及一种长野雷夫松氏菌及其对十溴联苯醚的降解方法。

背景技术

多溴联苯醚（PBDEs）作为一种重要的溴系阻燃剂，常作为阻燃添加剂加入树脂、聚苯乙烯和聚氨醋泡沫等高分子合成材料中，广泛地应用在电子、电器、化工、交通、建材、纺织品、石油等领域中。作为一类环境中（土壤、水、沉积物和大气）广泛存在的全球性有机污染物，由于其具有环境持久性，远距离传输，生物可累积性及对生物体具有毒害效应等特性，对其环境问题的研究已成为当前环境科学的一大热点，尤其是对于使用范围最广的十溴联苯醚（Deca-BDE）的研究，越来越受到人们的关注。

目前，对多溴联苯醚降解方法的研究大多都集中在零价铁还原法、光降解法和微生物降解法，从降解效果、二次污染、处理成本、适用性范围等多方面考虑，微生物降解法无疑是最佳的选择。多溴联苯醚的微生物降解方法主要包括厌氧降解和好氧降解两种。厌氧降解主要是通过还原脱溴，使其转化为低溴代同系物，但反应时间长，较易降解高溴代同系物，且不能保证完全降解；好氧降解反应时间短，微生物种类多，能降解低溴代同系物，且降解程度较高。从降解效果、工艺成本、条件控制等多方面综合比较，多溴联苯醚的好氧微生物降解方法体现出了一定的优越性，且已经被广泛应用。但在实际应用中，好氧微生物降解高溴代联苯醚的效率往往不高，所以多溴联苯醚好氧降解菌的筛选及应用仍具有一定的研究意义。

由于微生物对环境的适应性强，且污染过程经历一段自然驯化期，因而可以通过驯化从自然环境中筛选到可降解某种污染物的微生物降解菌株。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种长野雷夫松氏菌（Leifsonia shinshuensis）及其对十溴联苯醚的降解方法，该长野雷夫松氏菌是从上海松江松东污水处理厂的活性污泥中筛选出来的，通过长野雷夫松氏菌对十溴联苯醚的降解，为其污染治理和应用提供技术方法。

本发明的一种长野雷夫松氏菌，其保藏编号为：CGMCC NO.7872。

所述长野雷夫松氏菌是从上海松江松东污水处理厂的活性污泥中筛选出来的，此菌株属于微杆菌科（Microbacteriaceae），该菌株的驯化采用梯度增加污染物浓度的驯化方法进行驯化培养，在无机盐培养基MSM(2.65g/L KH₂PO₄、4.26g/L Na₂HPO₄·12H₂O、0.2g/LMgSO₄·7H₂O、0.02g/LCaCl₂、0.014FeSO₄·7H₂O、0.5g/L NH₄Cl，蒸馏水1000mL，pH=6.8～7.2)中加入Deca-BDE-二甲亚砜溶液，配制Deca-BDE浓度为10、15、20、30、40、60、80、100mg/L的驯化培养基。该菌落为圆形，边缘整齐，黄色，光滑，湿润，凸起；菌体呈微杆状，革兰氏染色阳性，菌体周围有粘液层包裹。

本发明的长野雷夫松氏菌应用于降解十溴联苯醚。

上述的降解方法为将长野雷夫松氏菌接种于十溴联苯醚解培养基摇床培养。

所述的十溴联苯醚降解培养基DM(Degradation Medium)是2.65g/L KH₂PO₄、4.26g/LNa₂HPO₄·12H₂O、0.2g/L MgSO₄·7H₂O、0.02g/LCaCl₂、0.014FeSO₄·7H₂O、0.5g/L NH₄Cl、100mg/L Deca-BDE，蒸馏水1000mL，pH6.8～7.2。

所述的降解条件为pH6.8～7.2，温度为30℃，摇床的转动频率为150rpm。

所述的十溴联苯醚降解培养基中添加碳源葡萄糖。

培养物经高效液相色谱测定，可分析该菌株对十溴联苯醚的降解效果；在添加了外加碳源葡萄糖后，提高了该菌对十溴联苯醚的降解效率，获得降解十溴联苯醚的条件。

本发明的长野雷夫松氏菌的建议分类命名为Leifsonia shinshuensis，其保藏编号为CGMCC No:7872,保藏日期为2013年7月3日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

有益效果：

本发明的长野雷夫松氏菌在pH6.8～7.2，30℃，摇床的转动频率150rpm，在添加了外加碳源葡萄糖的降解培养基中发酵5天，对Deca-BDE的降解效率达到90.08%。

附图说明

图1长野雷夫松氏菌所属种群系统树；

图2纯色谱级四氢呋喃溶剂的高效液相色谱图；

图3Deca-BDE-四氢呋喃溶液作为标准样品的高效液相色谱图；

图4降解培养基（DM）作为对照样品的高效液相色谱图；

图5降解培养基（DM）中长野雷夫松氏菌对Deca-BDE降解的高效液相色谱图；

图6添加了外加碳源葡萄糖的降解培养基中长野雷夫松氏菌对Deca-BDE降解的高效液相色谱图。

图7未添加外加碳源和添加了外加碳源的降解培养基中长野雷夫松氏菌对Deca-BDE的降解曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

长野雷夫松氏菌的分离鉴定

1、菌株的分离

(1)采集上海松江松东污水处理厂的活性污泥，置于一个长31.2cm，宽22.0cm，高22.5cm的玻璃驯化装置，在不加营养物质，没有进水出水交换的基础上用空压机不间断曝气3天。然后进行换水，排出装置中大约10L的泥水混合物，加入营养液并进行不间断曝气。在培养了10天后在加入营养液的同时开始加入Deca-BDE-二甲亚砜溶液，保持装置中Deca-BDE浓度在1ppm左右，并按照SBR工艺（进水、曝气、静置、排水和闲置）进行驯化培养，隔天换水，培养驯化一个月。培养液的配制：0.6g/L葡萄糖、0.8g/L无水乙酸钠、0.3g/L酵母粉、0.283g/L NH₄Cl、0.07g/L K₂HPO₄·3H₂O、0.022g/L KH₂PO₄。配制成大约10升左右的营养液。

(2)将驯化后的水样沉淀30分钟后，在无菌条件下用移液枪移取上清液1mL于装有100mL富集培养基的250mL灭菌锥形瓶中，放在摇床上培养。摇床转速为150r/min，温度为30℃。富集培养基EM(Enrichment Medium)的主要成分为：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/LNaCl，蒸馏水1000mL，pH6.8～7.2。

(3)在无菌条件下移取富集培养基的混浊菌液1mL于装有100mL驯化培养基的250mL灭菌锥形瓶中，放入摇床中（锥形瓶用遮光纸包裹，避免光照对实验的影响），利用Deca-BDE作为碳源进行以7天为一个周期的逐渐增加污染物浓度的驯化方法进行驯化培养。摇床转速为150r/min，温度为30℃，培养时间为两个月。在无机盐培养基MSM(2.65g/LKH₂PO₄、4.26g/L Na₂HPO₄·12H₂O、0.2g/L MgSO₄·7H₂O、0.02g/LCaCl₂、0.014FeSO₄·7H₂O、0.5g/L NH₄Cl，蒸馏水1000mL，pH=6.8～7.2)中加入Deca-BDE-二甲亚砜溶液，配制Deca-BDE浓度为10、15、20、30、40、60、80、100mg/L的驯化培养基。

(4)取驯化两个月后最后一个周期的驯化培养基1mL，按10倍稀释法，用无菌水将菌液作10^-1～10^-7梯度稀释。每种稀释浓度分别取0.1mL菌液均匀涂布于固体培养基上，将培养皿倒置于30℃培养箱中培养。固体培养基的主要成分为：2.65g/L KH₂PO₄、4.26g/LNa₂HPO₄·12H₂O、0.2g/L MgSO₄·7H₂O、0.02g/LCaCl₂、0.014FeSO₄·7H₂O、0.5g/L NH₄Cl、100mg/L Deca-BDE、20g/L琼脂，蒸馏水1000mL，pH6.8～7.2。

(5)待长出独立菌落后，观察各菌落形态，挑取形态清晰的单一菌落，编号，在分离培养基上划线分离，将培养皿倒置于30℃培养箱中培养48h，再观察结果。反复5～7次，并在电子显微镜下观察，确保是纯的单一菌株后，将其命名为GH10，并将其接种到固体斜面培养基上，4℃下保存于冰箱中，待后续进行降解试验。分离培养基SM(Separate Medium)的主要成分为：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/LNaCl、100mg/L Deca-BDE、20g/L琼脂，蒸馏水1000mL，pH6.8～7.2。固体斜面培养基和分离培养基的成分相同。

2、菌株的鉴定

(1)菌体及菌落形态特征

GH10菌株个体为微杆状，革兰氏染色阳性，菌体周围有粘液层包裹；其菌落为圆形，边缘整齐，黄色，光滑，湿润，凸起。

(2)通过对GH10菌株的16S rDNA序列测定和分析比较，该序列与Leifsoniashinshuensis的16S rDNA序列的同源性达到99%，确定该菌株为长野雷夫松氏菌（Leifsoniashinshuensis），其16S rDNA序列如下：

GGGCGGGGGTGCCTTACACATGCAGTCGAACGATGAACCTGGAGCTTGCTCTAGGGA

ATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCTTGACTCTGGGATAAC

CTCCGGAAACGGAAGCTAATACCGGATATGACGCACGGAGGCATCTCCTGTGCGTGG

AAAGAACTTCGGTCAAGGATGGACTCGCGGCCTATCAGGTAGTTGGTGAGGTAACGG

CCCACCAAGCCTACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGAC

TGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGG

CGAAAGCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCT

CTTTTAGTAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAAAAGCACCGGCTAAC

TACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGG

CGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTCTGTCGCGTCTGCTGTGAAAACCCGAGGCTCAACCT

CGGGCTTGCAGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGCGGTAGGGGAGAATGGAATTCCT

GGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGTTCT

CTGGGCCGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATA

CCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGCGCTAGATGTGGGGACCATTCCACGGTT

TCCGTGTCGCAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTA

AAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTC

GATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACGAGAACGGGCCAGAAAT

GGTCAACTCTTTGGACACTCGTGAACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTC

GTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTATGTTGCCAGCG

CGTAATGGCGGGAACTCATAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGA

TGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGT

ACAAAGGGCTGCAATACCGTAAGGTGGAGCGAATCCCAAAAAGCCGGTCTCAGTTC

GGATTGAGGTCTGCAACTCGACCTCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCA

GCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGA

AAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCTTGTGGAGGGAGCCGTCGAAGG

TGGGATTC

实施例2

GH10菌株对十溴联苯醚的降解分析

在无菌条件下，将GH10菌株接种到装有50mL富集培养基的250mL灭菌锥形瓶中，置于恒温摇床内，30℃，150rpm，培养48h。富集培养基EM(Enrichment Medium)的主要成分为：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/LNaCl，蒸馏水1000mL，pH6.8～7.2。

取富集培养的菌液于10mL灭菌离心管中，在以6000r/min的转速离心10min。之后用无菌生理盐水反复洗涤并离心2～3次，配成一定浓度的菌悬液，按10%的量接种于十溴联苯醚降解培养基中进行降解实验（锥形瓶用遮光纸包裹，避免光照对实验的影响），样品经高效液相色谱测定，分析该菌对Deca-BDE的降解效果。十溴联苯醚降解培养基DM(Degradation Medium)的主要成分为：2.65g/L KH₂PO₄、4.26g/L Na₂HPO₄·12H₂O、0.2g/L MgSO₄·7H₂O、0.02g/LCaCl₂、0.014FeSO₄·7H₂O、0.5g/L NH₄Cl、100mg/L Deca-BDE，蒸馏水1000mL，pH6.8～7.2。

液相色谱条件：

①色谱柱：ODS C₁₈（5um，250mm×4.6mm）

②流动相比例：乙腈/水（95：5）

③柱温：30℃

④流速：1.2mL/min

⑤进样方式：手动进样

⑥进样量：20uL

⑦检测波长：260nm

先用Deca-BDE-四氢呋喃溶液作为标准样品，并以纯色谱级四氢呋喃溶剂为对照，测得样品中的Deca-BDE在25min左右处出现波峰（如图2，图3）。确定了Deca-BDE标准样品的出峰时间，就可以进一步分析Deca-BDE的降解效果。同时，配制Deca-BDE浓度为0、10、20、40、60、80、100mg/L的Deca-BDE-四氢呋喃标准溶液，绘制Deca-BDE浓度-峰面积标准曲线，此标准曲线为：y=15866x-6052.3，R²=0.9996。通过在降解培养基（DM）中未接种GH10菌作为对照和接种GH10菌样品的高效液相色谱图比较（如图4，图5），可以得到Deca-BDE的初始浓度为48.90mg/L,最终浓度为19.93mg/L，降解效率为59.24%。

实施例3

外加碳源对十溴联苯醚降解效率的影响

（1）在无菌条件下，将GH10菌接入富集培养基EM内，置于摇床内30℃，150rpm，富集培养48h。

（2）取富集培养的菌液于10mL灭菌离心管中，在以6000r/min的转速离心10min。之后用无菌生理盐水反复洗涤并离心2～3次，配成一定浓度的菌悬液。

（3）配制三份50ml的降解培养基DM，其中一份添加2g/L葡萄糖做外加碳源，置于250mL锥形瓶中（锥形瓶用遮光纸包裹，避免光照对实验的影响）。一瓶不接种留作空白，另两瓶分别接种5mL菌悬液，摇床30℃，150rpm培养。

（4）在无菌操作条件下，取降解5d后菌液5ml，并对样品进行前处理，经高效液相色谱测定，分析外加碳源对该菌降解Deca-BDE效果的影响。样品前处理过程如下：

①将菌液置于分液漏斗内，分三次加入二氯甲烷/正己烷混合液（体积比为1：1）。第一、二次加入2mL，第三次加入1mL。每次加入后充分振荡，静置片刻。待上下分层稳定后，取出有机相层。

②合并上述三次所取的有机相，过无水硫酸钠柱并收集。

③所得的有机相用氮吹仪吹至尽干，再定容至1mL，用HPLC测之前，用0.45um有机滤头过滤。

液相色谱条件与实施例2中的液相色谱条件相同。

经测定，得到了添加了外加碳源葡萄糖的降解培养基中GH10菌对Deca-BDE降解的高效液相色谱图（如图6），通过分析，得到GH10菌降解十溴联苯醚的条件：在pH6.8～7.2，30℃，摇床的转动频率150rpm，添加了外加碳源葡萄糖的降解培养基中发酵5天，GH10菌对Deca-BDE的降解效率达到90.08%。

Claims (3)

1.一种长野雷夫松氏菌应用于降解十溴联苯醚的方法，其特征在于：所述长野雷夫松氏菌的保藏编号为：CGMCC NO.7872；其中降解方法为将长野雷夫松氏菌接种于十溴联苯醚降解培养基摇床培养。

2.根据权利要求1所述的一种长野雷夫松氏菌应用于降解十溴联苯醚的方法，其特征在于：所述的降解条件为pH值6.8～7.2，温度为30℃，摇床的转动频率为150rpm。

3.根据权利要求1所述的一种长野雷夫松氏菌应用于降解十溴联苯醚的方法，其特征在于：所述的十溴联苯醚降解培养基中添加碳源葡萄糖。