CN110511881B - 一种能够降解十溴联苯醚的微杆菌及其驯化方法与应用 - Google Patents

一种能够降解十溴联苯醚的微杆菌及其驯化方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种能够降解十溴联苯醚的微杆菌及其驯化方法与应用。所述能够降解十溴联苯醚的微杆菌（microbacterium sp），于2019年4月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，编号为GDMCC No：60634。该驯化方法是一种采用梯度增加污染物的方法，在培养基中加入十溴联苯醚，十溴联苯醚浓度梯度为10 mg/L到100 mg/L，采用梯度增加污染物浓度的驯化方法进行驯化。本发明提供的微杆菌，对环境适应性强，对十溴联苯醚降解效果较好；使用此微杆菌降解污染物成本较低。本发明提供的微杆菌，对十溴联苯醚的降解率最高可达57.6%，实际应用价值高，可为解决十溴联苯醚污染治理问题提供参考。

Description

一种能够降解十溴联苯醚的微杆菌及其驯化方法与应用
技术领域
本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，特别涉及一种能够降解十溴联苯醚的微杆菌及其驯化方法与应用。
背景技术
十溴联苯醚(BDE-209)是一种常见的溴代阻燃剂，因其具有价格低廉、阻燃高效等优点被广泛用于纺织、家具、电子和室内装潢等。目前由于长期大量的使用，导致大量的十溴联苯醚直接或间接进入到空气、灰尘、水、沉积物、土壤、生物体等环境介质，甚至人体中均检测出了十溴联苯醚。有证据显示环境中的十溴联苯醚可以通过呼吸、饮食、意外摄入等多种途径进入人体，它干扰甲状腺激素的分泌，具有肝脏毒性和生殖毒性，导致新生哺乳动物神经的损害，尤其对怀孕妇女、胎儿和婴幼儿的健康影响更深。因此，无论从生态系统的健康，还是从人类的安全角度考虑，开展十溴联苯醚的降解和消除技术等研究，都是一项非常紧迫的任务。
目前，十溴联苯醚的去除主要采用物理化学、生物方法予以去除，其中物理化学方法因其较高的运行成本、容易造成二次污染等诸多问题，不能成为污染治理的首选技术。微生物法降解/转有机污染物具有环境友好性和低成本性，因而成为水体有机污染修复的最安全、经济、有效途径。从专利申请情况来看，目前专利包括，申请号为CN2201510264759.5，名称为赤杆菌及其在降解十溴联苯醚中的应用，申请公布号为CN104845911A，申请号为CN201010019235.7，名称为一种枯草芽孢杆菌及其在降解十溴联苯醚中的应用，申请公布号为CN101921716A，申请号为CN201010019236.1，名称为一种醋酸钙不动杆菌及其在降解十溴联苯醚中的应用，申请公布号为CN101899404A以及申请号为CN201010019264.2，名称为Lysinibacillus fusiformis DB-1菌及其在降解十溴联苯醚中的应用，申请公布号为CN101864374A。十溴联苯醚微生物降解在实际应用过程中往往效率不高，且十溴联苯醚的微生物降解由于缺乏有效降解菌种而受到限制，因此十溴联苯醚高效降解菌的筛选及应用具有一定的研究意义。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种能够降解十溴联苯醚的微杆菌及其驯化方法与应用。
本发明提供一种采用微杆菌降解十溴联苯醚的方法，是通过微杆菌对十溴联苯醚的快速高效降解，能够为其污染治理和生物修复提供技术方法。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的一种能够降解十溴联苯醚的微杆菌，命名为microbacterium sp，于2019年4月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60634。
本发明提供的一种驯化所述能够降解十溴联苯醚的微杆菌的方法，包括如下步骤：
(1)将十溴联苯醚污染土壤接种到无机盐培养基中，摇床振荡培养，得到富集培养的菌液；
(2)将步骤(1)所述富集培养的菌液接种于初始十溴联苯醚降解培养基中，摇床振荡培养，得到一次培养菌液；
(3)将步骤(2)所述一次培养菌液接种至二次十溴联苯醚降解培养基中，摇床振荡培养，得到二次培养菌液，以此类推，重复此步骤，得到n次培养菌液，n为正整数；
(4)将步骤(3)所述n次培养菌液分离纯化，得到单一菌株，即所述能够降解十溴联苯醚的微杆菌(microbacterium sp)。
进一步地，步骤(1)所述富集培养基，以体积为一升来计，每升富集培养基包含：3-4g牛肉膏、10-12g蛋白胨、5-5.5g NaCl以及1000mL蒸馏水；所述富集培养基的pH值为6.5-7.5。
进一步地，步骤(1)所述摇床振荡培养的转速为150-160rpm，摇床振荡培养的时间为30-36h，摇床振荡培养的温度为30-35摄氏度。
进一步地，步骤(1)所述污染土壤为广东贵屿镇(经度116°20'30.304”纬度23°19'50.746”)的电子垃圾污染土壤，所述污染土壤中的十溴联苯醚含量为2280-287000ng/g。
进一步地，步骤(2)所述初始十溴联苯醚降解培养基，以体积为一升来计，每升初始十溴联苯醚降解培养基包含：1-1.2g(NH4)2SO4，1.5-1.7g KH2PO4，3-3.2g K2HPO4，0.5-2mg十溴联苯醚，2mL微量元素溶液以及1000mL蒸馏水；所述初始十溴联苯醚降解培养基的pH值为6.5-7.5。
进一步地，所述微量元素溶液为微量元素化合物加入水中混合均匀得到的溶液；所述微量元素化合物包括MgSO4、ZnSO4、CuSO4、MnSO4、FeSO4·7H2O及CaCl2；在所述微量元素溶液中，MgSO4的浓度为4-4.2g/L，ZnSO4的浓度为4-4.2g/L，CuSO4的浓度为1-1.2g/L，MnSO4的浓度为1-1.2g/L，FeSO4·7H2O的浓度为1-1.2g/L及CaCl2的浓度为1-1.2g/L。
进一步地，步骤(2)、步骤(3)所述接种的接种量均为3-5ml/L。
进一步地，步骤(2)所述摇床振荡培养的转速为150-160rpm，摇床振荡培养的时间为5-7d，摇床振荡培养的温度为30-35摄氏度。
进一步地，步骤(3)所述二次十溴联苯醚降解培养基是在步骤(2)所述初始十溴联苯醚降解培养基的基础上，其他成分均不变，每转接一次菌种，培养基中的十溴联苯醚的浓度增加10mg/L；最后一次转接的培养基中，十溴联苯醚的浓度为100mg/L，其余成分均与所述初始十溴联苯醚降解培养基相同；步骤(3)所述n的取值为10。
本发明提供的能够降解十溴联苯醚的微杆菌可以应用于十溴联苯醚的去除(溴系阻燃剂污染水体生物修复领域)。
本发明提供的能够降解十溴联苯醚的微杆菌应用于降解十溴联苯醚的方法，包括以下步骤：
(1)将微杆菌接种到已灭菌的富集培养基中，然后放在摇床中振荡培养，得到富集培养的菌液；
(2)收集步骤(1)培养的菌种，然后接种于十溴联苯醚降解培养基(或溴系阻燃剂污染水体)中，摇床振荡培养处理；
(3)步骤(2)摇床振荡培养处理结束后，测定十溴联苯醚降解培养基(或溴系阻燃剂污染水体)中的十溴联苯醚含量，分析微杆菌降解十溴联苯醚的效果。
进一步地，步骤(1)所述富集培养基，以体积为一升来计，每升富集培养基包含：3-4g牛肉膏、10-12g蛋白胨、5-5.5g NaCl以及1000mL蒸馏水；所述富集培养基的pH值为6.5-7.5。
进一步地，步骤(1)所述放在摇床中振荡培养的转速为150-160rpm；放在摇床中振荡培养的时间为30-36h；放在摇床中振荡培养的温度为30-35摄氏度。
进一步地，步骤(2)所述收集培养的菌种包括：将富集培养的菌液离心取沉淀，用无菌生理水洗涤沉淀，然后加入生理盐水将沉淀重悬为菌悬液。
进一步地，步骤(2)所述接种的接种量为3-5mL/L。
进一步地，步骤(2)所述十溴联苯醚降解培养基，以体积为一升来计，每升十溴联苯醚降解培养基包含：1-1.2g(NH4)2SO4，1.5-1.7g KH2PO4，3-3.2g K2HPO4，0.5-2mg十溴联苯醚，2mL微量元素溶液以及1000mL蒸馏水；所述十溴联苯醚降解培养基的pH值为6.5-7.5。
进一步地，步骤(2)所述十溴联苯醚降解培养基也可以是其他含溴系阻燃剂的污染水体或土壤。
进一步地，所述微量元素溶液为微量元素化合物加入水中混合均匀得到的溶液；所述微量元素化合物包括MgSO4、ZnSO4、CuSO4、MnSO4、FeSO4·7H2O及CaCl2；在所述微量元素溶液中，MgSO4的浓度为4-4.2g/L，ZnSO4的浓度为4-4.2g/L，CuSO4的浓度为1-1.2g/L，MnSO4的浓度为1-1.2g/L，FeSO4·7H2O的浓度为1-1.2g/L及CaCl2的浓度为1-1.2g/L。
进一步地，步骤(2)所述摇床振荡培养处理的培养温度为20-40℃，摇床振荡培养处理的时间为1-7d，摇床振荡培养处理的转速为150-160rpm。
进一步地，步骤(3)所述测定十溴联苯醚含量的方式包括采用高效液相色谱仪测定。
本发明提供的能够降解十溴联苯醚的微杆菌在此条件下降解培养7d，十溴联苯醚的降解率达到52.7％。
所述能够降解十溴联苯醚的微杆菌可以从广东省微生物菌种保藏中心获取，其保藏号为GDMCC No：60634。
本发明提供的菌株驯化方法是一种采用梯度增加污染物的方法，在无机盐培养基中加入十溴联苯醚，优选地，配置十溴联苯醚浓度梯度从10mg/L到100mg/L的驯化培养基，采用梯度增加污染物浓度的驯化方法进行驯化。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明提供的能够降解十溴联苯醚的微杆菌，该菌对环境适应性强，对十溴联苯醚降解效果较好，使用此微杆菌降解污染物成本较低。
(2)本发明提供的能够降解十溴联苯醚的微杆菌，对十溴联苯醚的降解率达到57.6％。
附图说明
图1为十溴联苯醚标准样品的HPLC图；
图2为十溴联苯醚的降解随时间的变化图。
具体实施方式
以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1
1、降解菌株的驯化筛选
(1)将十溴联苯醚污染土壤加入到20mL无机盐培养基(已灭菌)中，于温度为30℃、转速为160rpm的恒温摇床中培养，培养时间为4小时，然后取出后静置，得到上清液，取上清液作为接种液继续驯化。每升无机盐培养基包括：1g/L(NH4)2SO4，1.5g/L KH2PO4，3g/LK2HPO4，2mL/L微量元素溶液，1000mL蒸馏水，pH为7.0。
微量元素溶液为微量元素化合物加入水中混合均匀得到溶液；在微量元素溶液中，各物质的浓度为：MgSO4的浓度为4.2g/L，ZnSO4的浓度为4.2g/L，CuSO4的浓度为1.2g/L，MnSO4的浓度为1.2g/L，FeSO4·7H2O的浓度为1.2g/L及CaCl2的浓度为1.2g/L；下同。
(2)将步骤(1)所述接种液接种于100mL初始十溴联苯醚降解培养基中，摇床振荡培养(30℃，时间为7d，转速为160rpm)，得到一次培养菌液；接种量为4ml/L。所述初始十溴联苯醚降解培养基，以体积为一升来计，每升初始十溴联苯醚降解培养基包含：1.1g(NH4) 2SO4，1.6g KH2PO4，3.1g K2HPO4，1mg十溴联苯醚，2mL微量元素溶液以及1000mL蒸馏水；所述初始十溴联苯醚降解培养基的pH值为7.0。
(3)将步骤(2)所述一次培养菌液接种至二次十溴联苯醚降解培养基中(接种量为4ml/L)，摇床振荡培养(30℃，时间为7d，转速为160rpm)，得到二次培养菌液，二次十溴联苯醚降解培养基是在步骤(2)所述初始十溴联苯醚降解培养基的基础上，将十溴联苯醚的浓度增加至10mg/L，其余成分均不变，以此类推，重复此步骤，得到10次培养菌液(每7天转接1次，每次转接的同时提高10mg/L的十溴联苯醚的浓度，直到十溴联苯醚的浓度达到100mg/L)；
(4)采用稀释梯度法、平板涂布法对菌株进行分离纯化，挑选生长较快、形态不同的菌落，得到单一菌株，即所述能够降解十溴联苯醚的微杆菌(microbacterium sp)；将其接种到固体斜面培养基上，保存于4℃冰箱中，待后续进行降解实验。固体斜面培养基的成分(以体积为一升计)为：3g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5g/L NaCl，琼脂22g/L，蒸馏水1000mL，pH为6.5。
2、降解菌株的鉴定
(1)菌体及菌落形态特征
该菌株为革兰氏阴性菌，观察外部形态，菌落湿润光滑、边缘整齐、表面为凹陷的不透明圆形菌落。
(2)16S rDNA序列
通过16S rDNA序列测定和分析比较，该序列与Microbacterium的16S rDNA序列的同源达到99.9％，该菌株确定为微杆菌，其16S rDNA序列如序列表1所示，命名为microbacterium sp，其16S rDNA序列(共1395bp)已提交到genebank，登录号为MK369741。
实施例2微杆菌对十溴联苯醚的降解分析(效果验证)
将微杆菌(microbacterium sp)接种到装有已灭菌的500mL富集培养基的1000mL三角瓶中，置于恒温摇床内，温度为30℃、转速为160rpm，培养36h得到富集培养的菌液；所述富集培养基(以体积为一升来计)包含：3g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5g/L NaCl，蒸馏水1000mL，pH为7.0。
将富集培养的菌液(20mL)置于50mL灭菌离心管中，以8000g的转速离心7min后，收集菌体并用无菌生理盐水反复洗涤并离心3次，最后加入生理盐水配置成一定浓度(OD600＝0.6)的菌悬液，将1mL配置好的菌悬液加入到19mL灭菌后的降解培养基(十溴联苯醚降解培养基)中进行降解实验，放入培养箱中培养，培养温度为30℃、转速为160rpm，培养5d后，样品(培养后的十溴联苯醚降解培养基)经过HPLC(高效液相色谱法)测定，分析菌体对十溴联苯醚的降解效果。实施例2为了更好测得本发明提供的微杆菌(microbacterium sp)对十溴联苯醚的降解相关参数，采用了含十溴联苯醚的培养基模拟含十溴联苯醚的污染物。
所述降解培养基(以体积为一升来计)包括：1g/L(NH4)2SO4，1.5g/L KH2PO4，3g/LK2HPO4，1mg/L十溴联苯醚，2mL/L微量元素溶液，1000mL蒸馏水，pH为7.0。微量元素溶液为微量元素化合物加入水中混合均匀得到溶液，其中在微量元素溶液中，各物质的浓度为：4g/LMgSO4，4g/L ZnSO4，1g/L CuSO4，1g/L MnSO4，1g/L FeSO4·7H2O，1g/L CaCl2。
十溴联苯醚的浓度采用HPLC进行测定，分析条件如下：
色谱柱：C18(250mm×4.6mm，岛津)；
流动相：体积比为95％甲醇：5％超纯水；
流速：1mL/min；
柱温箱：30℃；
检测器：SPD-20A；
波长：226nm；
进样量：20μL。
配置十溴联苯醚浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2的标准溶液，绘制十溴联苯醚浓度-峰面积标准曲线，十溴联苯醚标准样品的HPLC图如图1所示。以接种灭活的微杆菌为对照组(对照组除了接种的菌种是被灭活的，其余操作及相关参数均与实验组相同)，培养5d后，测得对照组的降解培养基的十溴联苯醚浓度为0.976mg/L，而通过上述测试得出实验组十溴联苯醚浓度为0.413mg/L，通过对照组和实验组(实验组为实施例2提供的方法)的比较可以得出，实验组降解效率为57.6％，结果如图2所示。
实施例3
实施例3同实施例2，只是降解实验中，降解培养基pH为7.0，培养条件为：温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃和40℃，摇床转速为160rpm，培养时间为7d。最终测得微杆菌对十溴联苯醚的降解率为27.5％、40.6％、57.6％、55.1％和49.8％。实施例3的降解效果与实施例2相似，可参照图2。
实施例4
实施例4同实施例2，只是降解实验中，培养温度为30℃，培养条件为：pH分别为3、4、5、6、7、8、9、10，摇床转速为160rpm，培养时间为7d。最终测得微杆菌对十溴联苯醚的降解率为15.3％、27.7％、35.5％、47.9％、57.6％、46.1％、40.3％和32.2％。实施例4的降解效果与实施例2相似，可参照图2。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种能够降解十溴联苯醚的微杆菌及其驯化方法与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1395
<212> DNA
<213> 微杆菌(microbacterium sp)
<400> 1
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ttaagttccc cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacgggga 900
cccgcacaag cggcggagca tgcggattaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttaccaagg 960
cttgacatac acgagaacgg gccagaaatg gtcaactctt tggacactcg tgaacaggtg 1020
gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1080
accctcgttc tatgttgcca gcacgtaatg gtgggaactc atgggatact gccggggtca 1140
actcggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgtctt gggcttcacg 1200
catgctacaa tggccggtac aatgggctgc gataccgtaa ggtggagcga atcccaaaaa 1260
gccggtccca gttcggattg aggtctgcaa ctcgacctca tgaagtcgga gtcgctagta 1320
atcgcagatc agcaacgctg cggtgaatac gttcccgggt cttgtacaca ccgcccgtca 1380
attcattgaa agtct 1395

Claims (3)

1.一种能够降解十溴联苯醚的微杆菌(microbacterium sp.)，其特征在于，于2019年4月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60634。
2.权利要求1所述能够降解十溴联苯醚的微杆菌应用于十溴联苯醚的去除。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将微杆菌(microbacterium sp.)接种到已灭菌的富集培养基中，摇床振荡培养，得到富集培养的菌液；
(2)收集步骤(1)所述富集培养的菌液，然后接种于含十溴联苯醚的污染物中，摇床振荡培养；
(3)摇床振荡培养处理结束后，测定含十溴联苯醚的污染物中的十溴联苯醚含量，分析微杆菌(microbacterium sp.)对十溴联苯醚的降解效果。
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