CN112899192B - 一种btex降解菌及其筛选方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种BTEX降解菌及其筛选方法和应用，所述降解菌为有益杆菌属，命名为Diaphorobacter sp.ED‑3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M 2021059，所述筛选方法包括取污染土壤样品于密闭血清瓶中，经驯化、分离和纯化后获得；ED‑3菌能在60h内完全降解100mg/L的乙苯，无毒性中间产物代谢积累，无二次污染物的产生；该菌同时能够降解苯、甲苯、邻二甲苯、间二甲苯和对二甲苯。该菌为非致病菌，降解效果稳定；该操作成本较低，对环境产生的负面影响小，具有很好的开发利用前景。

Description

一种BTEX降解菌及其筛选方法和应用
技术领域
本发明属于微生物处理降解技术领域，涉及一种BTEX降解菌及其筛选方法和应用。
背景技术
苯，甲苯，乙苯和二甲苯(Benzene,Toluene,Ethylbenzene,and Xylene,BTEX) 不仅作为化工原料在塑料、农药的合成中有广泛使用，也是原油和石油产品的重要组成成份，由于相关储罐及地下管道的泄漏经常会导致土壤和地下水被污染。 BTEX具有明显的“三致”效应，许多国家将其列为优先控制污染物。近年来BTEX 在农药、石化等污染土壤和地下水中频繁检出，且浓度高、易挥发，尤其开挖、运输和治理等异位修复过程中会产生二次污染，该类污染土壤与地下水的微生物原位修复备受关注。
生物治理技术经过发展，在环境治理上取得了长足的进步，开发了许多新技术，例如生物强化技术、生物刺激技术。生物强化技术产生于上世纪70年代中期，80 年代以来得以广泛的研究和应用。此技术旨在提高生物处理系统的处理能力，向该系统中投加从自然界中筛选的优势菌种或通过基因组合技术产生的高效菌种，以去除某一种或某一类有害物质，以强化生物量对某一特定环境或特殊污染物的反应。而实施生物强化的关键条件就是获得针对目标污染物的高效降解菌。
发明内容
本发明的目的就是为了提供一种BTEX降解菌及其筛选方法和应用，以克服上述技术存在对土壤及水体环境造成破坏，对低浓度乙苯污染物去除不够彻底，需要高成本，并且容易造成二次污染等问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一方面，本发明提出了一种BTEX降解菌，其为有益杆菌属，命名为Diaphorobactersp.ED-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO. M 2021059，保藏时间为2021年1月14日。
进一步的，其革兰氏染色呈阴性，菌株形态无荚膜、杆菌，且在Luria-Bertani 培养基上菌落形态规则，呈黄色、凸起、不透明和光滑。同时，对其进行了16S rDNA 测序，所测得的16S rDNA序列进行BLAST比对，比对结果显示，菌株ED-3的 16S rDNA的核苷酸序列与有益杆菌属(Diaphorobacter sp.)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性。
另一方面，本发明还提出了一种BTEX降解菌的筛选方法，包括以下步骤：
(1)将基础无机盐培养基、微量元素混合液和乙苯溶液混合，得到液体培养基；
(2)取来源于农药厂污染土壤的土壤样品置于一份液体培养基中，混合，得到含菌的第一混合液，培养后移取10％的第一混合液(此处为体积量)再转移至另一份液体培养基中，得到第二混合液，如此重复若干次，直至得到第n混合液，其中，n＝5-8；
(3)将所得第n混合液进行划线分离培养，即得到BTEX降解菌。
进一步的，步骤(1)中，所述的基础无机盐培养基中的无机盐成分至少包含：0.2g/L NH4Cl，7.95g/L NaCl，0.77g/L MgCl2·6H2O，1.05g/L MgSO4·7H2O，0.076 g/LCaCl2，0.22g/L KCl，0.01g/L NaHCO3，0.026g/L NaBr，0.25g/L K2HPO4。
进一步的，步骤(1)中，所述的微量元素混合液中的溶质成分至少包括：0.15 g/LZnSO4·7H2O，0.26g/L MnSO4·H2O，0.03g/L CoCl2·6H2O，4.5g/L FeSO4·7H2O， 0.02g/LNiCl2·6H2O，0.01g/L CuCl2，0.1g/L Na2MoO4·2H2O，0.06g/L H3BO3。
进一步的，步骤(1)中，乙苯溶液所用的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，其浓度优选为50g/L；
无机盐培养基、微量元素溶液、乙苯溶液的添加体积比为106:103:2。
进一步的，这里从农药厂获得的土壤样品和液体培养基的用量可以根据实际要求进行调节。例如，步骤(2)中，制得第一混合液时，土壤样品与液体培养基的添加量之比可以为(3-6)g：30mL。同样的，从第一混合液中转移至第二混合液的量与第一混合液体积比可以是1:30至1:10，本发明不局限于此。
进一步的，步骤(2)的整个驯化过程中，所用工具可以根据实际情况具体选择，这里筛选所用的瓶子为150mL钳口血清瓶，用铝盖加垫片密封，其中所加液体为20-30mL，当然，本发明不局限于此。
进一步的，步骤(2)中，驯化条件可以根据实际情况具体选择。比如，这里适用的摇床转速可以是180r/min，培养过程在密闭条件下进行，温度为28℃，每次培养的时间为2-3d。
进一步的，步骤(3)中，稀释涂布分离培养过程具体为：取1mL第n次转接降解菌液，加入到9mL灭菌液体无机盐培养基中混匀即10-1，依次逐级梯度稀释至10-2，10-3，10-4，10-5，并在含苯系物的Luria-Bertani培养基平板上涂布，每个梯度3个平行，再用接种环挑取单菌落在Luria-Bertani培养基平板上线分离，如此重复2-3次，将获得的单菌接种到降解体系中验证降解能力，若观察到该菌能够利用苯系物为唯一碳源生长且苯系物浓度降低，即为BTEX降解菌。
再另一方面，本发明还提出了一种BTEX降解菌在降解乙苯中的应用。
本发明提供的BTEX降解菌是Diaphorobacter sp.ED-3，16S rDNA序列 GenBank登录号为MW453096，保藏编号为CCTCC No：M 2021059。所述筛选方法包括：从农药厂周边污染土壤样品中，经驯化、分离和纯化后得到。本发明通过从农药厂周围提取污染土壤，并从中筛选出BTEX降解菌ED-3，该菌不仅能高效降解乙苯，对苯、甲苯、二甲苯也有较好的降解效果。通过上述BTEX降解菌ED-3 对水中的苯系物进行降解，能达到去除污染物的目的，并且中间产物被彻底降解。该操作成本较低，对环境产生的负面影响小，具有很好的开发利用前景。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
图1为本发明提供的在150mL血清瓶中菌株降解乙苯的过程培养基随时间变浑浊的图片。
图2为本发明提供的一种BTEX降解菌株ED-3的菌落形态图。
图3为本发明提供的一种BTEX降解菌株ED-3的扫描电镜图。
图4为本发明中提供的一种BTEX降解菌株ED-3的降解特性图。
图5为本发明中提供的一种苯降解菌株ED-3降解苯的生长曲线与降解曲线图。
图6为本发明中提供的一种BTEX降解菌株ED-3降解苯过程的HPLC色谱图。
图7为本发明中提供的一种BTEX降解菌株ED-3的系统发育树。
图8为本发明中提供的一种BTEX降解菌株ED-3的降解底物图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
特别的，在本文中所披露范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
以下各实施例中，如无特别说明的原料或处理技术，即表明其均为本领域的常规市售原料或常规处理技术。
一方面，本发明提出了一种BTEX降解菌，其为棒状杆菌，菌株代码为ED-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M 2021059，保藏时间为2021年1月14日。
进一步的，其革兰氏染色呈阴性，菌株形态无荚膜、杆菌，且在Luria-Bertani 培养基上菌落形态规则，呈黄色、凸起、不透明和光滑。同时，对其进行了16S rDNA 测序，所测得的16S rDNA序列进行BLAST比对，比对结果显示，菌株ED-3的 16S rDNA的核苷酸序列与有益杆菌属(Diaphorobacter sp.)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性。
另一方面，本发明还提出了一种BTEX降解菌的筛选方法，包括以下步骤：
(1)将基础无机盐培养基、微量元素混合液和乙苯溶液混合，得到液体培养基；
(2)取来源于农药厂污染土壤的土壤样品置于一份液体培养基中，混合，得到含菌的第一混合液，培养后移取10％的第一混合液(此处为体积量)再转移至另一份液体培养基中，得到第二混合液，如此重复若干次，直至得到第n混合液，其中，n＝5-8；
(3)将所得第n混合液进行划线分离培养，即得到BTEX降解菌。
进一步的，步骤(1)中，所述的基础无机盐培养基中的无机盐成分至少包含：0.2g/L NH4Cl，7.95g/L NaCl，0.77g/L MgCl2·6H2O，1.05g/L MgSO4·7H2O，0.076 g/L CaCl2，0.22g/L KCl，0.01g/L NaHCO3，0.026g/L NaBr，0.25g/L K2HPO4。
进一步的，步骤(1)中，所述的微量元素混合液中的溶质成分至少包括：0.15 g/LZnSO4·7H2O，0.26g/L MnSO4·H2O，0.03g/L CoCl2·6H2O，4.5g/L FeSO4·7H2O， 0.02g/LNiCl2·6H2O，0.01g/L CuCl2，0.1g/L Na2MoO4·2H2O，0.06g/L H3BO3。
进一步的，步骤(1)中，乙苯溶液所用的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，其浓度优选为50g/L；
无机盐培养基、微量元素溶液、乙苯溶液的添加体积比为106:103:2。
进一步的，这里从农药厂获得的土壤样品和液体培养基的用量可以根据实际要求进行调节。例如，步骤(2)中，制得第一混合液时，土壤样品与液体培养基的添加量之比可以为(3-6)g：30mL。同样的，从第一混合液中转移至第二混合液的量与第一混合液体积比可以是1:30至1:10，本发明不局限于此。
进一步的，步骤(2)的整个驯化过程中，所用工具可以根据实际情况具体选择，这里筛选所用的瓶子为150mL钳口血清瓶，用铝盖加垫片密封，其中所加液体为20-30mL，当然，本发明不局限于此。
进一步的，步骤(2)中，驯化条件可以根据实际情况具体选择。比如，这里适用的摇床转速可以是180r/min，培养过程在密闭条件下进行，温度为28℃，每次培养的时间为2-3d。
进一步的，步骤(3)中，稀释涂布分离培养过程具体为：取1mL第n次转接降解菌液，加入到9mL灭菌液体无机盐培养基中混匀即10-1，依次逐级梯度稀释至10-2，10-3，10-4，10-5，并在含苯系物的Luria-Bertani培养基平板上涂布，每个梯度3个平行，再用接种环挑取单菌落在Luria-Bertani培养基平板上线分离，如此重复2-3次，将获得的单菌接种到降解体系中验证降解能力，若观察到该菌能够利用苯系物为唯一碳源生长且苯系物浓度降低，即为BTEX降解菌
再另一方面，本发明还提出了一种BTEX降解菌在降解乙苯中的应用。
本发明提供的BTEX降解菌是Diaphorobacter sp.ED-3，16S rDNA序列 GenBank登录号为MW453096，保藏编号为CCTCC No：M 2021059。所述筛选方法包括：从农药厂周边污染土壤样品中，经驯化、分离和纯化后得到。本发明通过从农药厂周围提取污染土壤，并从中筛选出BTEX降解菌ED-3，该菌不仅能高效降解乙苯，对苯、甲苯、二甲苯也有较好的降解效果。通过上述BTEX降解菌ED-3 对水中的苯系物进行降解，能达到去除污染物的目的，并且中间产物被彻底降解。该操作成本较低，对环境产生的负面影响小，具有很好的开发利用前景。
下面结合具体实施例来对上述实施方式进行更详细的说明。
实施例1：
菌株的获得
从安徽某农药厂采取污染土壤装于棕色瓶中运回实验室，将土壤添加于培养基中制得混合物，通过筛选、驯化获得一株高效BTEX降解菌，对该菌株进行苯系物降解验证，发现该菌株能高效降解苯、甲苯、乙苯和二甲苯，并且该菌株具有稳定的传代特性。
该菌株革兰氏染色呈阴性，菌株形态无荚膜、杆菌。在Luria-Bertani培养基平板上菌落形态规则，黄色，凸起，不透明的和光滑。
对其进行了16S rDNA测序，所测得的16S rDNA序列进行BLAST比对，比对结果显示，菌株ED-3的16S rDNA的核苷酸序列与有益杆菌属(Diaphorobacter sp.)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性。
该菌株已于2021年1月保藏于中国典型培养物保藏中心，菌株代码：ED-3，保藏编号为CCTCC NO：M 2021059。
菌株的具体获得过程如下：
(1)将基础无机盐培养基、微量元素混合液和苯溶液混合，得到液体培养基；
(2)取来源于农药厂污染土壤的土壤样品置于一份液体培养基中，混合，得到含菌的第一混合液，培养后移取10％的第一混合液再转移至另一份液体培养基中，得到第二混合液，如此重复若干次，直至得到第五混合液；
(3)将所得第五混合液进行划线分离培养，即得到BTEX降解菌。
步骤(1)中，所述的基础无机盐培养基中的无机盐成分包含：0.2g/L NH4Cl，7.95g/L NaCl，0.77g/L MgCl2·6H2O，1.05g/L MgSO4·7H2O，0.076g/L CaCl2，0.22 g/LKCl，0.01g/L NaHCO3，0.026g/L NaBr，0.25g/L K2HPO4。
步骤(1)中，所述的微量元素混合液中的溶质成分包括：0.15g/L ZnSO4·7H2O，0.26g/L MnSO4·H2O，0.03g/L CoCl2·6H2O，4.5g/L FeSO4·7H2O，0.02g/L NiCl2·6H2O，0.01g/L CuCl2，0.1g/L Na2MoO4·2H2O，0.06g/L H3BO3。
步骤(1)中，所述的乙苯溶液(50g/L)所用的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。
步骤(1)中所述的无机盐培养基，微量元素溶液，乙苯溶液添加体积比为106:103:2。
步骤(2)中，制得第一混合液时，土壤样品与液体培养基的添加量之比为(3-6)g：30mL。
步骤(2)的整个驯化过程中，所用工具为150mL钳口血清瓶，用铝盖加垫片密封，其中所加液体一般为20-30mL。
步骤(2)中，驯化条件可以是180r/min，培养过程在密闭条件下进行，温度为28℃，每次培养的时间为2-3d左右。
步骤(3)中，稀释涂布分离培养过程具体为：取1mL第n次转接降解菌液，加入到9mL灭菌液体无机盐培养基中混匀即10-1，依次逐级梯度稀释至10-2，10-3， 10-4，10-5，并在含苯系物的Luria-Bertani培养基平板上涂布，每个梯度3个平行，再用接种环挑取单菌落在Luria-Bertani培养基平板上线分离，如此重复2-3次，将获得的单菌接种到降解体系中验证降解能力，若观察到该菌能够利用苯系物为唯一碳源生长且苯系物浓度降低，即为BTEX降解菌，菌落形态如图2所示，形态规则，黄色，微凸起，不透明的和光滑。ED-3菌的主要形态如图3所示，ED-3菌呈棒状、无鞭毛。图4展示了ED-3与有益杆菌属其它菌的亲缘关系，ED-3与LS-1 在发育树的同一支，表明其有较近的亲缘关系。
实施例2：
菌株降解特性的研究
将20mL含有乙苯的无机盐培养基置于150mL血清瓶中，ED-3于 Luria-Bertani培养基扩大培养后，8000r/min离心5min，并用1％无机盐培养基重悬，洗去酵母粉等碳源，重复2次后总体积不变，在600nm波长条件下测定吸光值，保证降解体系中初始吸光值为0.1。为防止乙苯挥发加盖密封，于28℃，180rpm，避光条件下振荡培养，分别改变乙苯浓度、pH值、酵母粉浓度、温度，48h时后取样(酵母粉的影响研究在36h取样)，测定乙苯的残留浓度。
降解特性结果如图4所示，ED-3能够耐受300mg/L的乙苯，并在48h内完降解100mg/L乙苯，ED-3在pH 6-9范围内都能很好的生长并且降解100mg/L的乙苯，少量酵母粉的添加能够促进乙苯的降解，并且在15℃低温条件下亦能降解乙苯。
实施例3：
菌株对水体中苯系物的降解研究
将20mL含有50mg/L苯系物(苯、甲苯、乙苯、邻二甲苯、间/对二甲苯) 的无机盐培养基置于150mL血清瓶中，ED-3于Luria-Bertani培养基扩大培养后， 8000r/min离心5min，并用1％无机盐培养基重悬，洗去酵母粉等碳源，重复2次后总体积不变，在600nm波长条件下测定吸光值，保证降解体系中初始吸光值为 0.1。为防止苯系物挥发加盖密封，于28℃，180rpm，避光条件下振荡培养，定时取样，测定苯系物的残留浓度。
图8显示ED-3能够降解所有的BTEX类物质，对苯、甲苯、乙苯有较好的去除效果，苯在92h内被完全消耗掉，甲苯和乙苯在56h内被完全消耗，二甲苯在 92h内有48％的去除率。
实施例4：
菌株对水体中高浓度乙苯的降解及其中间产物变化的研究
取ED-3菌株在以含乙苯100mg/L的Luria-Bertani培养基培养基中生长过夜。通过将洗涤过的细胞重悬于不含碳源的无机盐培养基中，并将悬浮液在28℃下搅拌后添加至20mL降解无机盐培养基中，培养基中含乙苯100mg/L，初始在600nm 波长条件下吸光值为0.1。视情况1-2h间隔取样分别测定乙苯残留浓度与产物分布情况，离心除去细胞，并用等体积的乙酸乙酯萃取上清液三次。合并的萃取物用无水硫酸钠干燥，并通过氮气流蒸发至干。然后将浓缩的样品重新溶解在乙腈中，通过孔径为0.22μm的耐溶剂过滤器过滤。并使用带有Eclipse XDB-C18(5μm， 4.6×250mm)的岛津HPLC-20A进行分析。流动相由CH3OH/0.1％乙酸组成，流速为1mL/min。
图5显示前20h内，菌株存在一个迟滞期，从第20h起进入对数生长期，乙苯被快速降解，同时中间产物快速生成(如图6所示)，中间产物在第30h有最大的累积量，到第60h，乙苯已经被降解完全，且中间产物的量亦在减少，说明ED-3 能彻底降解乙苯，无二次污染物的生成。图1显示了不同时间下培养基中变浑浊的现象，这主要是因为微生物利用乙苯生长和繁殖造成的。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 一种BTEX降解菌及其筛选方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1400
<212> DNA
<213> Diaphorobacter sp.
<400> 1
atgcagtcga acggtaacag gtcttcggat gctgacgagt ggcgaacggg tgagtaatac 60
atcggaacgt gcccgatcgt gggggataac gaggcgaaag ctttgctaat accgcatacg 120
atctacggat gaaagcgggg gatcttcgga cctcgcgcgg acggagcggc cgatggcaga 180
ttaggtagtt ggtgggataa aagcttacca agccgacgat ctgtagctgg tctgagagga 240
tgatcagcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga 300
attttggaca atgggcgaaa gcctgatcca gccatgccgc gtgcaggatg aaggccttcg 360
ggttgtaaac tgcttttgta cggaacgaaa agcctctttc taataaagag gggtcatgac 420
ggtaccgtaa gaataagcac cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggt 480
gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgtgcgca ggcggttttg taagacagag 540
gtgaaatccc cgggctcaac ctgggaactg cctttgtgac tgcaaggctg gagtgcggca 600
gagggggatg gaattccgcg tgtagcagtg aaatgcgtag atatgcggag gaacaccgat 660
ggcgaaggca atcccctggg cctgcactga cgctcatgca cgaaagcgtg gggagcaaac 720
aggattagat accctggtag tccacgccct aaacgatgtc aactggttgt tgggtcttca 780
ctgactcagt aacgaagcta acgcgtgaag ttgaccgcct ggggagtacg gccgcaaggt 840
tgaaactcaa aggaattgac ggggacccgc acaagcggtg gatgatgtgg tttaattcga 900
tgcaacgcga aaaaccttac ccacctttga catggcagga agtttccaga gatggattcg 960
tgcccgaaag ggaacctgca cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1020
tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgccatt agttgctacg aaagggcact 1080
ctaatgggac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaag tcctcatggc 1140
ccttataggt ggggctacac acgtcataca atggctggta cagagggttg ccaacccgcg 1200
agggggagct aatcccataa agccagtcgt agtccggatc gcagtctgca actcgactgc 1260
gtgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagaatgtcg cggtgaatac gttcccgggt 1320
cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gcgggttctg ccagaagtag gtagcctaac 1380
cgtaaggagg gcgctaccac 1400

Claims (2)

1.一种BTEX降解菌，其特征在于，其为有益杆菌属(Diaphorobacter sp.)，菌株代码为ED-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M 2021059，保藏时间为2021年1月14日。
2.如权利要求1所述的一种BTEX降解菌在降解乙苯中的应用。
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