CN103421700A - 一株Diaphorobacter菌在焦化废水除酚中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了从焦化废水中筛选分离得到的一株苯酚降解细菌Diaphorobacter sp.菌株P2。16S rDNA序列相似性分析表明P2菌株与已知Diaphorobacter 16S rDNA序列同源性为99％。Diaphorobacter P2可降解高达1000mg/L的苯酚；复合重金属对P2菌株降酚效率的影响大小依次为：Zn2+＞Mn2+＞Pb2+，pb2+对Diaphorobacter P2降酚效率没有显著影响；在焦化废水与蒸馏水分别以1∶2和1∶1体积比配制的废水中接种P2，酚类物质可在4天内被完全降解。本发明为焦化废水酚污染的生物处理和开发生物修复菌剂提供材料和理论依据。
Description
技术领域：
本发明涉及一株降解苯酚的菌株Diaphorobacter P2，该菌株可耐重金属Mn、Zn和Pb等，具有降解吡啶和邻甲酚的能力，特别涉及到焦化废水酚类有机污染物的生物处理。
背景技术：
苯酚是重要的有机化工原料，在合成纤维、合成橡胶、石料、医药、农药、香料、染料以及涂料等方面具有广泛的应用。同时也是煤气洗涤、炼焦、合成氨、造纸、木材防腐和化工行业废水的主要污染物，其中炼焦产生的废水是典型的难降解工业废水。焦化废水含酚类、苯系物、胺类、烷烃、喹啉等有机物，同时含有硫化物、氰化物、油类和重金属(铜、锰、锌、镍、铅、镉等)，苯酚类及其衍生物在焦化废水有机物质量分数中所占比例最大约为60％。苯酚属高毒物质，对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经或损害肝、肾功能，高浓度酚可使蛋白质凝固及引起组织损伤、坏死。由于苯酚具有致癌、致畸、致突变的潜在毒性，各国都相继提出了把苯酚列为水中优先控制污染物。我国“水中优先控制污染物黑名单”列出的68种有毒化学污染物中也包括苯酚、间甲酚等6种酚类化合物。焦化废水未经处理，大量排放，造成严重的环境污染，严重危害人体健康和生态环境。因此，如何有效地处理焦化废水是环境污染防治领域迫切解决的问题。
目前国内外处理含酚废水的主要方法有物理、化学和生物三种途径。生物法及其酚类生物处理主要是利用微生物的新陈代谢作用，降解水中的酚类化合物，将其转化为无机物，使废水得到净化。微生物与化学、物理法相比较因处理成本低、效率高、易操作、无二次污染等优点，逐渐被重视和推广用于处理含酚废水。为了取得高效的生物处理效果，分离筛选高效降酚菌株处理含酚废水已成为治理含酚废水的必然要求。已经分离鉴定出多种降酚微生物菌株如红球菌、克雷伯菌、嗜热菌、芽孢杆菌、酵母菌、Corynebacterium、不动杆菌、Micrococcus、产碱杆菌、沙雷氏菌、假单胞菌等。然而，不同的降酚菌株来源不同，对不同废水的适应性不同，在生物处理焦化废水中的应用不多。另一方面，焦化废水是复杂的混合体系，往往同时含有多种有机污染物和高浓度的重金属离子，这些物质会严重抑制微生物对酚类的生化降解。为此，分离筛选出能降酚和多种有机污染物的耐或抗高浓度重金属离子的菌株，对于生物处理焦化废水具有重要的应用前景。
发明内容：
本发明的目的在于提供一株可高效降解苯酚的菌株，为焦化废水的治理提供理论基础和技术支持。
本发明人从焦化厂二次沉淀池采集活性污泥，经过富集驯化及筛选，得到一株高效降解苯酚的菌株，经鉴定该菌株16S rDNA序列与已知Diaphorobacter sp.16S rDNA序列同源性为99％，命名为P2。
本发明中，富集驯化、筛选和分离Diaphorobacter P2菌株的过程为：取5ml摇匀的样品废水装于含有100ml富集培养基的锥形瓶中置摇床中震荡培养(37℃，180r/min)，待培养基变浑浊，在无菌操作条件下取出5ml培养基加入到含有100ml的新鲜富集培养基中培养。培养基浑浊后，取出2ml转接到含苯酚浓度为100mg/L的新鲜富集培养基中培养，富集瓶混浊后，取2ml培养液转接到苯酚浓度为200mg/L的液体培养基中培养。依次类推，逐级提高苯酚浓度，在300～400mg/L的条件下进行富集培养。将经过苯酚浓度为400mg/L的富集培养基富集后的菌体稀释成10-5、10-6、10-7、10-8四个梯度，分别涂布于苯酚浓度为400mg/L的富集培养基平板上，每个稀释度重复三次，同时倒置于生物培养箱中于30℃条件下恒温培养。待出现菌斑后，挑取富集培养基平板上的单菌落于苯酚浓度为400mg/L的无机盐培养基平板上反复划线进行纯化，然后将分离纯化后的菌株加入到含苯酚浓度为400mg/L的无机盐液体培养基中培养，培养基浑浊后，再依次转接至苯酚浓度分别为400、600、800、1000mg/L的无机盐培养基中。
所述液体富集培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，具体配方：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，去离子水1000ml，pH 7.0～7.2，苯酚(根据需要量加入)，固体培养基是在此培养基中加入15～20g琼脂。无机盐液体培养基，具体配方：KH2PO4 0.5g，NH4NO3 1.0g，MgSO40.2g，CaCl2 0.2g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·H2O 0.01g，苯酚(根据需要量加入)，加蒸馏水定容至1L，固体培养基是在此培养基中加入15～20g琼脂。调节pH值所用的NaOH浓度为2mol/L，HCl浓度为0.5mol/L。
附图说明：
图1：P2菌株的菌落形态；
图2：P2菌株的电镜扫描图；
图3：P2菌株的系统发育分析树；
图4：不同初始酚浓度对P2菌株生长和生物降解的影响；
图5：P2菌株在降酚过程中培养液pH的变化
图6：P2菌株降解焦化废水中酚类物质的效率；
具体实施方式
1.活性污泥样品的采集：
采集焦化厂二次沉淀池活性污泥样品装入无菌封口塑料壶内，带回实验室进行富集筛选。
2.培养与分离鉴定所需培养基配方
牛肉膏蛋白胨富集培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，去离子水1000ml，pH 7.0～7.2，苯酚(根据需要量加入)，固体培养基是在此培养基中加入15～20g琼脂。
无机盐液体培养基具体配方：KH2PO4 0.5g，NH4NO3 1.0g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.2g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·H2O 0.01g，苯酚(根据需要量加入)，加蒸馏水定容至1L，固体培养基是在此培养基中加入15～20g琼脂。
调节pH值所用的NaOH浓度为2mol/L，HCl浓度为0.5mol/L。
3.降酚菌株的筛选、分离和鉴定
3.1降酚菌株的富集驯化及筛选
取5ml摇匀的样品废水装于含有100ml富集培养基的锥形瓶中置摇床中震荡培养，待培养基变浑浊，在无菌操作条件下取出5ml培养基加入到含有100ml的新鲜富集培养基中培养。培养基浑浊后，取出2ml转接到含苯酚浓度为100mg/L的新鲜富集培养基中培养，富集瓶混浊后，取2ml培养液转接于苯酚浓度为200mg/L的液体培养基中培养。依次类推，逐级提高苯酚浓度，在300～400mg/L的条件下进行富集培养。将经过苯酚浓度为400mg/L的富集培养基富集后的菌体稀释成10-5、10-6、10-7、10-8四个梯度，分别涂布于苯酚浓度为400mg/L的富集培养基平板上，每个稀释度重复三次，同时倒置于生物培养箱中于30℃条件下恒温培养。待出现菌斑后，挑取富集培养基平板上的单菌落于苯酚浓度为400mg/L的无机盐培养基平板上反复划线进行纯化，然后将分离纯化后的菌株加入到含苯酚浓度为400mg/L的无机盐液体培养基中培养，培养基浑浊后，再依次转接至苯酚浓度分别为400、600、800、1000mg/L的无机盐培养基中。
3.2菌株的鉴定
菌株16S rDNA序列比对鉴定：采用CTAB法提取细菌基因组。使用16S rDNA通用引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(正向引物F27)和5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′(反向引物R1492)进行DNA扩增(PCR)。50μL的PCR反应体系：10×PCR缓冲液(含Mg2+)5μL，10mmol/L dNTPmix 0.25μL，引物(45pmol/μL)0.5μL，DNA模板1μL，灭菌去离子水42.25μL和DNA聚合酶Taq(2.5U/μL)0.5μL。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环，72℃最终延伸5min。PCR产物直接送公司处理，所测序列使用NCBI BLAST比对分析，并使用ClustalW2进行多序列比对绘制进化树。
3.3不同初始酚浓度对菌株降酚效率的影响
菌株在无机盐培养基中培养至对数生长期，离心分离菌体，用灭菌的无机盐培养基洗涤2 次，重新悬于等体积的无机盐培养基中。然后，将菌株以5％的量接种于不同初始酚浓度181～1087mg/L的无机盐培养基中，于37℃、180r/min条件下振荡培养，定时取样采用4-氨基安替比林法测定苯酚浓度，采用比浊法OD600测定菌株生物量，每个指标试验重复三次，结果取其平均值。
3.4单一重金属对菌株降酚效率的影响
菌株以5％的量接种于苯酚浓度为600mg/L的无机盐培养基中，再分别添加重金属离子Cu2+、Cd2+、Ni2+、Pb2+、Mn2+、Zn2+和Cr7+，浓度设置为两个梯度分别为50μmol/L和200μmol/L，以未添加重金属离子的无机盐培养基为对照，所用锥形瓶于180r/min、37℃下振荡培养24h取样测定苯酚浓度。
3.5复合重金属对菌株降酚效率的影响
基于单一重金属对菌株降酚效率的影响，按照L9(33)正交试验设计配制含不同重金属浓度(Zn2+、Mn2+和Pb2+)的培养基，将对数生长期的菌株以5％的量接种于复合重金属液体培养基中，于180r/min、37℃下振荡培养24h取样测定苯酚浓度。
3.6菌株处理实际焦化废水实验研究
将菌株以5％的量接种于蒸馏水与焦化原水分别按2∶1，1∶1，1∶2体积比配置成的废水中置180r/min、37℃下振荡培养定时取样测定酚降解率。
3.7其他芳香族化合物的降解实验
将菌株以5％的量分别接种于含有吡啶、喹啉、苯胺、邻甲酚的无机盐培养基中，于180r/min、37℃下振荡培养取样测定其降解情况，四种芳香族化合物的浓度均为200mg/L。
4 菌株的鉴定结果
4.1形态特征及16S rDNA分子鉴定结果
废水样品经初筛和驯化筛选，获得一株降酚菌株，命名P2。菌落特征：P2菌落颜色乳白色半透明，圆形，边缘整齐，菌落略隆起，菌落形态见图1，电镜扫描观察菌株呈杆状(图2)。菌株16S rDNA鉴定：以P2基因组DNA为模板，利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，得到长度约为1440bp(base pair)的扩增产物。BLAST比对分析显示P216S rDNA序列(基因注册号：JN984128)与Diaphorobacter.sp的16S rDNA序列同源性高达99％，表明P2菌株为Diaphorobacter。系统进化树见图3。
4.2不同初始酚浓度对Diaphorobacter P2菌株降酚效率的影响
为了研究不同初始酚浓度对菌株降酚效率的影响，设置了6个不同的初始酚浓度。结果表明(图4、图5)，无机盐培养基中苯酚浓度随细菌数量的增加而降低，pH随时间的延长而下降，最终趋于稳定。生长延迟期，苯酚浓度基本不变，pH变化不大，酚浓度较高，延迟期愈长，苯 酚浓度在181～625mg/L之间所需延迟期大约为12h，苯酚浓度为1087mg/L时，延迟期为24h：对数生长期，苯酚浓度急剧降低，pH急剧下降；当菌体生长进入稳定期，酚浓度愈高，菌株OD600愈大，同时酚浓度不大于625mg/L几乎被完全降解，即苯酚的降解主要发生在对数生长期。在菌株生长过程中，培养基初始pH为6.8左右，随着培养时间的延长，培养液的pH逐渐下降，这是因为在苯酚生物降解过程中产生己二酸、唬拍酸、乙二酸、β-酮基二乙酸、α-酮基二乙酸等酸性物质。
4.3单一重金属对Diaphorobacter P2菌株降酚效率的影响
振荡培养24h取样测定苯酚浓度，结果表明，与对照相比较，菌株分别在50μmol/L、200μmol/LPb2+，200μmol/L Mn2+的条件下均能将600mg/L的苯酚降解完全，Zn2+对菌株降酚有一定的抑制作用，Cu2+、Ni2+、Cd2+、Cr7+完全抑制菌株对酚的降解。
4.4复合重金属对Diaphorobacter P2菌株降酚效率的影响
基于单一重金属对菌株降酚的影响，设计了正交试验方案(表1)来探讨复合重金属对菌株降酚的影响。菌株以5％的量接种于苯酚浓度为600mg/L，不同重金属复合的无机盐培养基中置于180r/min、37℃下振荡培养24h取样测定苯酚浓度。极差(R)的大小分析得出不同重金属离子对菌株降酚影响作用大小依次为Zn2+＞Mn2+＞Pb2+(表1)。方差分析(表2)表明，Zn2+，Mn2+对P2降酚有显著的抑制作用，Pb2+对P2降酚没有明显影响。
表1正交试验方案(单位：μmol/L)
表2正交试验方差分析
a.R方＝0.989(调整R方＝0.986)
分析(表1)表明重金属离子浓度为200μmol/L Zn2+、300μmol/L Mn2+、300μmol/L Pb2+复合组合时对菌株的降酚抑制作用小于其他组合。
4.5Diaphorobacter P2菌株处理实际焦化废水实验研究
焦化原水经测定pH9.56～9.58，总酚935.58～937.56mg/L。为研究菌株对实际焦化废水的降解性能，先将焦化原水做一定预处理，及先将原水用滤纸过滤以除杂，然后利用灭菌的蒸馏水与焦化原水分别以2∶1，1∶1，1∶2的体积比配置成合成焦化废水。将菌株以5％的量接种于蒸馏水与焦化原水按不同体积比配置成的废水中置于下振荡培养，定时取样测定酚降解率。结果表明(图6)，菌株4天内可生化降解无菌水与焦化原水以2∶1，1∶1体积比组成的合成废水，1∶2体积比组成的合成废水基本不被降解。
焦化废水是复杂的混合体系，往往同时含有多种有机污染物如吡啶、苯胺、喹啉、邻甲酚等。将菌株分别接入上述四种浓度均为200mg/L的无机盐培养基中探讨P2菌株的生长和降解情况。结果表明(表3)，Diaphorobacter P2菌株可降解吡啶、邻甲酚；苯胺、喹啉不能被菌株作为唯一的碳源和能源加以利用(“+”表示肯定，“-”表示否定)。
表3P2菌株降解其他芳香族化合物及其生长情况分析
Claims (5)
1.一株Diaphorobacter sp菌株，其特征在于，该菌株属于Diaphorobacter属，命名为P2菌株。
2.如权利要求书1所述的Diaphorobacter P2菌株，该菌株的形态特征：
在固体培养基上划线分离单菌落，培养后形成乳白色半透明，圆形的菌斑，边缘整齐，菌落略隆起，表面光滑，质地湿润，易挑起，电镜扫描观察其呈杆状。
3.如权利要求书1所述的DiaphorobacterP2菌株，其特征在于，所述菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求书1所述的Diaphorobacter P2菌株的耐酚浓度达1200mg/L，其在无机盐液体培养基中可降解1087mg/L苯酚，625mg/L苯酚可在24h完全降解，重金属Pb2+对菌株降酚效率没有显著影响。
5.如权利要求书1所述的DiaphorobacterP2菌株可应用于焦化废水酚污染物的生物处理。
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