KR100824969B1

KR100824969B1 - 새로운 스테노트로포모나스 애씨드아마니필리아 균주 및이를 이용한 히드록시 지방산의 제조방법

Info

Publication number: KR100824969B1
Application number: KR1020070011167A
Authority: KR
Inventors: 오덕근; 유인식; 김혜정; 김용휘
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2007-02-02
Filing date: 2007-02-02
Publication date: 2008-04-28

Abstract

본 발명은 미생물을 이용한 히드록시 지방산의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 하수 오니로부터 분리한 새로운 스테노트로포모나스 속 균주 및 이를 이용한 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산 [10-hydroxy-12(Z)-octadecenoic acid]의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 (Stenotrophomonas acidaminiphilia) 균주는 불포화 지방산을 히드록시 지방산으로 효과적으로 전환시킬 수 있고, 본 발명의 제조방법은 상기 미생물을 첨가하고 균체의 농도, 기질 농도, 온도 및 pH 등을 조절하여 배양하는 과정으로 부산물이 없이 향료 락톤 (lactone) 생산의 중간물질이면서 윤활제로 사용되는 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산을 선택적으로 고수율 생산할 수 있으므로, 종래의 화학적인 방법보다 환경 친화적이고 특이성이 높으며 부산물도 없이 유용한 히드록시 지방산을 효율적으로 얻는데 널리 사용될 수 있다.

스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아(Stenotrophomonas acidaminiphilia), 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산[10-hydroxy-12(Z)-octadecenoic acid], 히드록시 지방산

Description

새로운 스테노트로포모나스 애씨드아마니필리아 균주 및 이를 이용한 히드록시 지방산의 제조방법 {Stenotrophomonas acidaminiphilia strain and method for manufacturing hydroxy fatty acid in a high yield by using the same}

도 1a는 본 발명의 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 (Stenotrophomonas acidaminiphilia) 균주를 이용한 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산의 생산성을 pH에 따른 상대적 활성으로 나타낸 것이다.

도 1b는 본 발명의 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 (Stenotrophomonas acidaminiphilia) 균주를 이용한 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산의 생산성을 온도에 따른 상대적 활성으로 나타낸 것이다.

도 2a는 본 발명의 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 균주의 균체 농도에 따른 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산의 생산량을 비교하여 나타낸 것이다.

도 2b는 본 발명의 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 균주의 및 리놀레산 농도에 따른 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산의 생산량을 비교하여 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 균주의 균체 농도 20 g/ℓ 및 리놀레산 농도 20 g/ℓ 조건 하에서 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노 산의 생산 시 히드록시 지방산의 증가 (●) 및 리놀레산의 감소 (○)를 나타낸 것이다.

본 발명은 미생물을 이용한 히드록시 지방산의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 하수 오니 (sludge)로부터 분리한 새로운 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 (Stenotrophomonas acidaminiphilia) 균주 및 이를 이용한 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산 [10-hydroxy-12(Z)-octadecenoic acid]의 제조방법에 관한 것이다.

히드록시 지방산은 자연계에 존재하는 물질로서, 트리글리세롤, 왁스, 세레브로시드 그리고 그 외 식물, 곤충 및 미생물에 존재하는 지질 등에서 발견된다. 이러한 히드록시 지방산은 미생물이 생물학적 전환을 통하여 불포화 지방산으로부터 생산하고, 크게 세 가지 유형인 모노히드록시, 다이히드록시 및 트리히드록시 지방산으로 나뉘어진다. 또한 히드록시 지방산은 향신료를 구성하는 락톤 (lactone)의 전구체로서 산업적으로 유용한 물질이며, 다른 종류의 지방산과 비교시 반응성이 탁월하여 레진, 왁스, 나일론, 플라스틱, 윤활제 및 코팅제의 출발물질로 사용되고 있다.

10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산 [10-hydroxy-12(Z)-octadecenoic acid] 은 리시놀레산의 이성질체로서 윤활제로 많이 사용되고 있고, 가소체 및 레진에 사용되는 세바스산을 생산하는 데 중요한 물질이기도 하다. 리시놀레산과 같은 히드록시 지방산은 이스트 (yeast)에 의하여 감마-데카락톤 (λ-decalactone)으로 전환된다. 이 감마-데카락톤은 특징적으로 복숭아 또는 살구의 향을 내는 식품 공정에 필수적인 물질로서, 식품 산업에서 그 사용이 점차 증가되고 있다. 그러나 감마-데카락톤은 몇몇 과일에만 소량으로 존재하기 때문에, 유기합성법에 의해 대량으로 생산되는 것이 필요하다. 실제로 국민 소득의 증가, 천연음식 및 향장 소재의 요구 그리고 소비재의 고급화 추세에 따라 천연물질이 안정성과 기호도가 선호되는 경향성이 나타나고 있어, 전세계적으로 생물전환 방법을 이용한 제조법이 절실히 요구된다.

기존에 10-하이드록시-12(제트)-옥타데세노산은 미생물을 이용하여 생산되고 있으며, 이 때 사용되는 미생물로는 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis), 플라보박테리움 속 (Flavobacterium. sp. NRRL B-14859), 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 및 락토바실러스 파라카스 (Lactobacillus paracas)등을 들 수 있다. 그러나 이들 미생물은 10-하이드록시-12(제트)-옥타데세노산을 낮은 수율로만 생산할 수 있고 부산물도 함께 생성되기 때문에, 산업화 시 매우 비경제적이다. 참고로 지금까지 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산의 최대 생산농도 및 생산성은 플라보박테리움 (Flavobacterium sp. NRRL B-14859)을 사용하여 조사된 2.97 g/ℓ와 0.88 g/ℓ·h 인 것으로 보고되어 있다 (Hou, C. T. 1994. Conversion of linoleic acid to 10-hydroxy-12(Z)- octadecenoic acid by Flavobacterium sp. NRRL B-14859. J. Am. Oil Chem. Soc., 71: 975-978).

이에 본 발명자들은 보다 효율적으로 히드록시 지방산을 대량 생산하기 위하여 하수 오니로부터 불포화 지방산을 히드록시 지방산으로 전환할 수 있는 미생물을 선별하고, 상기 미생물이 부산물이 없이 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산 등을 선택적으로 대량 생산할 수 있는 것을 확인한 다음 이 균주를 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 (Stenotrophomonas acidaminiphilia)로 동정하고, 이를 이용한 생물전환 반응에서 균체 농도, 배양 온도, pH 및 기질 농도 등의 최적 반응 조건을 조사하여 히드록시 지방산을 고수율로 얻는 제조방법을 제공함으로써 본 발명을 성공적으로 완성하였다.

본 발명은 미생물을 이용하여 히드록시 지방산을 고수율로 얻는 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 스테노트로포모나스 속 (Stenotrophomonas sp.) 미생물 및 불포화 지방산 기질을 이용하는 생물전환 공정으로 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산 [10-hydroxy-12(Z)-octadeccenoic acid] 등을 얻는 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 히드록시 지방산을 생산하는 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 (Stenotrophomonas acidaminiphilia) 균주 (수탁번호: KCTC 11064 BP)를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 미생물 및 불포화 지방산 기질을 이용하여 감마-락톤 (γ-lactone)의 중간물질인 히드록시 지방산 (hydroxy fatty acid)을 얻는 제조방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 스테노트로포모나스 속 (Stenotrophomonas sp.) 미생물, 기질 및/또는 생물전환 유도물질을 이용하는 생물전환 공정으로 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산 [10-hydroxy-12(Z)-octadeccenoic acid] 등을 얻는 제조방법을 제공한다.

먼저, 본 발명에서는 하수 오니 (sludge)로부터 분리한 히드록시 지방산을 선별적으로 생산할 수 있는 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 (Stenotrophomonas acidaminiphilia) 균주를 제공한다.

본 발명의 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 균주는 국제기탁기관인 한국생명공학연구원에 2007년 1월 16일자로 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 11064 BP).

본 발명의 제조방법에서, 상기 스테노트로포모나스 속 (Stenotrophomonas sp.) 미생물로는 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 (Stenotrophomonas acidaminiphilia) 균주 (수탁번호: KCTC 11064 BP)를 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 불포화 지방산 기질로는 리놀레산 (linoleic acid), 올레산 (oleic acid), 리놀렌산 (linolenic acid), 감마 리놀렌산 (γ-linolenic acid) 및 팔미톨레산 (palmitoleic acid)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 사용하는 것이 바람직하고 리놀레산을 사용하는 것은 더욱 바람직하다. 또한, 상기 리놀레산은 농도 10 내지 40 g/ℓ 범위로 사용되는 것이 바람직하고 농도 15 내지 25 g/ℓ 범위로 사용되는 것은 더욱 바람직하다.

또한, 상기 생물전환 유도물질로도 리놀레산 (linoleic acid), 올레산 (oleic acid), 리놀렌산 (linolenic acid), 감마 리놀렌산 (γ-linolenic acid) 및 팔미톨레산 (palmitoleic acid)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 사용하는 것이 바람직하고 리놀레산을 사용하는 것은 더욱 바람직하다. 또한, 상기 유도물질로서의 리놀레산은 농도 0.1 내지 1.2 g/ℓ 범위로 사용되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 히드록시 지방산으로는 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산 [10-hydroxy-12(Z)-octadeccenoic acid], 10-히드록시스테아르산 (10-hydroxystearic acid), 10-히드록시-12,15(제트,제트)-옥타데카디엔산 (10-hydroxy-12,15(Z,Z)-octadecadienoic acid), 10-히드록시-6,12(제트,제트)-옥타데카디엔산 (10-hydroxy-6,12(Z,Z)-octadecadienoic acid) 및 10-히드록시팔미트산 (10-hydroxypalmitic acid) 등이 포함된다.

본 발명은 스테노트로포모나스 속 (Stenotrophomonas sp.) 미생물 및 불포화 지방산 기질 또는 유도물질로서 리놀레산을 이용하는 생물전환 공정으로 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산 [10-hydroxy-12(Z)-octadeccenoic acid]을 얻는 제조방법을 제공한다.

또한, 상기 미생물로서 스테노트로포모나스 속 미생물 또는 스테노트로포모 나스 애씨드아미니필리아 (Stenotrophomonas acidaminiphilia) 균주는 균체 농도가 15 내지 30 g/ℓ 범위로 조절되는 것이 바람직하고 15 내지 25 g/ℓ 범위로 조절되는 것은 더욱 바람직하다.

또한, 상기 미생물의 배양 배지는 0.01 내지 0.25 g/ℓ 포도당, 1 내지 5 g/ℓ 효모 추출액, 1 내지 4 g/ℓ 일인산칼륨, 0.01 내지 0.4 g/ℓ 황산마그네슘, 0.1 내지 0.2 ㎖/ℓ 트윈80 으로 이루어진 배지에 불포화 지방산을 첨가하여 사용하는 것이 바람직하고, 상기에 더하여 배지 내의 포도당 농도를 측정하여 0 내지 0.05 g/ℓ 범위에 이르면 혐기성 조건으로 변화시키어 계속 배양하는 것은 더욱 바람직하다. 이 때 생물 반응기를 사용하여 미생물을 배양하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 생물전환 공정 모두는 pH 7.0 내지 8.0 범위에서 이루어지는 것이 바람직하고, pH 7.0 내지 pH 7.5 범위에서 이루어지는 것은 더욱 바람직하다.

또한, 상기 생물전환 공정은 온도 25 내지 33℃ 범위에서 이루어지는 것이 바람직하고, 온도 27 내지 30℃ 범위에서 이루어지는 것은 더욱 바람직하다.

본 발명은 스테노트로포모나스 속 미생물 및 다양한 종류의 불포화 지방산 기질들을 이용하는 생물전환 공정으로 다양한 종류의 히드록시 지방산들을 얻는 제조방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 불포화 지방산 기질로서 각각 올레산, 리놀렌산, 감마 리놀렌산 또는 팔미톨레산을 사용하여 각각 10-히드록시스테아르산 (10-hydroxystearic acid), 10-히드록시-12,15(제트,제트)-옥타데카디엔산 (10-hydroxy-12,15(Z,Z)-octadecadienoic acid), 10-히드록시-6,12(제트,제트)-옥타데 카디엔산 (10-hydroxy-6,12(Z,Z)-octadecadienoic acid) 및 10-히드록시팔미트산 (10-hydroxypalmitic acid)을 생산하는 제조방법을 제공한다. 상기 생물전환 공정으로 상기 올레산, 리놀렌산, 감마 리놀렌산 및 팔미톨레산 이외에도 모든 종류의 불포화 지방산을 사용하여 다양한 종류의 유용한 히드록시 지방산이 생산될 수 있다.

이하, 실시 예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 히드록시 지방산을 생산하는 미생물의 분리 및 동정

본 발명에서는 불포화 지방산을 히드록시 지방산으로 전환시킬 수 있는 미생물을 분리하고 동정하기 위하여, 하수 오니 (sludge)로부터 스테노트로포모나스 속 (Stenotrophomonas sp.) 균주를 얻고 이 미생물을 API 20NE 키트를 사용하여 분석하였다. 그 결과는 표 1 에 나타내었다. 구체적으로, 구연산 (citrate)을 제외한 포도당 (glucose), 아라비노스 (arabinose), 만노스 (mannose), 만니톨 (mannitol), 앤-아세틸-글루코자민 (N-acetyl-glucosamine), 말토스 (maltose), 글루코네이트 (gluconate), 카프레이트 (caprate), 아디페이트 (adipate), 말레이트 (malate) 및 페닐아세테이트(phenylacetate)의 이용성은 기존의 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 (Stenotrophomonas acidaminiphilia) 균주와 동일하였다.

균주의 API 키트 분석

	분석 종류	API 20E
1	Reduction of nitrates to nitrites	-
2	Indole production	-
3	Glucose acidification	-
4	Arginine dihydrolase	-
5	Urease	-
6	Esculin hydrolysis (β-glucosidase )	+
7	Gelatine hydrolysis(protease)	+
8	β-Glucosidase	+
9	Glucose assimilation	+
10	Arabinose assimilation	-
11	Mannose assimilation	+
12	Mannitol assimilation	-
13	N-acetyl-glucosamine assimilation	+
14	Maltose assimilation	+
15	Gluconate assimilation	-
16	Caprate assimilation	-
17	Adipate assimilation	-
18	Malate assimilation	-
19	Citrate assimilation	+
20	Phenyl-acetate assimilation	-
21	Cytochrome oxidase	-

또한, 상기 분리된 균주에서 세포막의 지방산을 분석하고 그 결과를 표 2 에 나타내었다. 구체적으로 기체 크로마토그래피를 수행하여 분석한 결과, 스테노트 로포모나스 속 균주의 특징으로 알려진 지방산인 11:0 iso, 11:0 iso 3OH 및 13:0 iso 3OH 성분이 상기 균주의 지방산 구성에 포함되어 있었고, 기존의 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 (Stenotrophomonas acidaminiphilia) 균주에서 나타나는 모든 31 성분들이 각각 양적인 차이는 있었지만 상기 균주와 일치하였다. 따라서, 본 발명의 균주는 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 인 것으로 동정되었다.

균주의 세포막 지방산 분석

Rt	Area	Ar/Ht	Respon	ECL	명칭
2.815	1333	0.023	1.110	9.605	10 : 0 ISO
3.009	2097	0.024	1.098	10.001	10 : 0
3.418	38290	0.026	1.081	10.608	11 : 0 ISO
3.476	1794	0.027	1.079	10.694	10 : 0 ANTEISO
4.058	659	0.026	1.060	11.419	10 : 0 3OH
4.227	603	0.025	1.055	11.608	12 : 0 ISO
4.677	16806	0.031	1.044	12.087	11 : 0 ISO 3OH
5.069	1020	0.029	1.036	12.436	11 : 0 3OH
5.268	4770	0.038	1.032	12.613	13 : 0 ISO
5.369	832	0.033	1.030	12.702	13 : 0 ANTEISO
5.834	13033	0.034	1.022	13.097	12 : 0 ISO 3OH
6.312	11119	0.035	1.015	13.453	12 : 0 3OH
6.534	43944	0.035	1.012	13.619	14 : 0 ISO
6.926	524	0.038	1.006	13.911	14 : 0 w5c
7.046	16445	0.037	1.005	14.000	14 : 0
7.209	12579	0.036	1.003	14.107	13 : 0 ISO 3OH
7.337	3606	0.036	1.001	14.192	13 : 0 2OH
7.675	20811	0.038	0.997	14.414	15 : 1 ISO F
7.994	195615	0.038	0.993	14.625	15 : 0 ISO
8.129	36123	0.039	0.992	14.713	15 : 0 ANTEISO
8.251	915	0.044	0.990	14.794	15 : 1 w8c
8.343	765	0.046	0.989	14.855	15 : 1 w6c
8.565	7101	0.039	0.987	15.001	15 : 0
9.232	523	0.046	0.981	15.321	16 : 0 ISO H
9.594	27389	0.040	0.977	15.627	16 : 0 ISO
9.835	4164	0.037	0.974	15.773	16 : 1 w9c
10.207	26398	0.040	0.971	16.000	16 : 0
10.922	34765	0.043	0.965	16.416	ISO 17 : 1 w9c
11.287	7634	0.042	0.962	16.630	17 : 0 ISO
11.567	1872	0.036	0.959	16.793	17 : 1 w8c
13.268	428	0.034	0.946	17.770	18 : 1 w9c

또한, 상기 균주의 16S rRNA (842 bp)의 염기 서열을 분석하였다. 그 결과 대조군 균주로서 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 (S. acidaminiphila CIP 106456, Accession No. AF273080), 스테노트로포모나스 니트리티레두센스 (S. nitritireducens DSM 12575, AJ012229), 스테노트로포모나스 코레엔시스 (S. koreensis KCTC 12211, AB166885), 스테노트로포모나스 리조필리아 (S. rhizophila DSM 14405, AJ293463), 스테노트로포모나스 독도엔시스 (S. dokdonensis KDTC 12543, DQ178977) 및 스테노트로포모나스 말토필리아 (S. maltophila ATCC 19861, AB021406) 균주 등과 비교하여 상동성이 각각 99.6%, 98.5%, 96.7%, 96.3%, 94.8%및 94.4% 인 것으로 측정되었다. 따라서, 본 발명의 균주는 다시 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 인 것으로 동정할 수 있었다.

실시예 2. 히드록시 지방산을 생산하는 미생물의 특성 조사.

본 발명의 스테노트로포모나스 속 미생물의 특성을 조사하기 위하여, 불포화 지방산을 히드록시 지방산으로 전환시키는 효소를 발현하기 위한 배양 배지를 사용하여 상기 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 균주를 배지 내 포도당이 모두 소비된 후 3시간 동안 혐기적 조건에서 배양하고 이로부터 균체를 수집하였다.

구체적으로, 상기 미생물 균체는 10,000× g로 4℃에서 10분 동안 원심분리하고 pH 7.5, 50 mM 트리스 완충용액으로 두 번 세척하였다. 또한, 상기 미생물 균체와 리놀레산의 반응 조건으로 기질 농도는 5 내지 10 g/ℓ의 범위로 pH 는 7.0 내지 8.0 범위에서 25 내지 30℃로 반응시켰다. 그 결과, 본 발명의 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 균주는 리놀레산으로부터 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산으로 생산할 수 있는 것을 확인하였다.

실시예 3. 기질에 따른 히드록시 지방산의 생산성 조사

본 발명에서는 불포화 지방산을 히드록시 지방산으로 전환하는 효소의 발현을 증가된 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 균주를 분리하기 위하여, 기존 배양 배지를 사용하지 않고 유도물질로서 기질인 리놀레산을 소량 포함하는 배양 배지를 선택하여 사용하였다. 먼저 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 균주는 영양배지 (nutrient broth) 3 ㎖ 이 들어있는 시험관에 접종하여 12시간 동안 배양한 다음, 이를 불포화 지방산을 히드록시 지방산으로 전환시키는 효소의 발현용 배지 (0.01 내지 0.25 g/ℓ 포도당, 1 내지 5 g/ℓ 효모 추출액, 1 내지 4 g/ℓ 일인산칼륨, 0.01 내지 0.4 g/ℓ 황산마그네슘, 0.1 내지 0.2 ㎖/ℓ 트윈80 및 0.1 내지 1.2 g/ℓ 리놀레산) 100 ㎖이 들어있는 500 ㎖ 플라스크에 접종하여 본 배양을 실시하였다. 상기 배양 과정 중에서 교반 속도는 200 rpm, 배양 온도는 28℃로 유지되도록 조정하였다. 균체 배양 시 배지 속의 포도당 농도를 확인하여 포도당의 농도가 0 내지 0.05 g/ℓ에 이르면 혐기적인 조건으로 전환시키어 3 내지 5시간 동안 더 배양하였다. 또한 상기 균체를 영양 배지 3 ㎖에 접종하여 12시간 동안 배양한 다음 동일한 배지 100 ㎖이 들어있는 500 ㎖의 플라스크에 접종하고 28℃에서 200 rpm으로 12시간 동안 배양하여 대량으로 균체를 얻었다. 상기 종균 배양된 배양액은 다시 지방산을 히드록시 지방산으로 전환시키는 효소의 발현용 배지 (0.01 내지 0.25 g/ℓ 포도당, 1 내지 5 g/ℓ 효모 추출액, 1 내지 4 g/ℓ 일인산칼륨, 0.01 내지 0.4 g/ℓ 황산마그네슘, 0.1 내지 0.2 ㎖/ℓ 트윈80 및 0.1 내지 1.2 g/ℓ 리놀레산) 3 ℓ가 들어있는 5ℓ 배양기에 접종하여 본 배양을 실시하였다. 상기 배양액 속의 균주는 온도 28℃에서 0.3 vvm의 통기량과 400 rpm의 교반 속도로 15시간 동안 배양되었다. 상기 과정에서 포도당 농도를 확인하고 통기량을 0 vvm 으로 조정하여 혐기적인 조건을 전환시킨 다음 3 내지 5시간 동안 배양하여 효소의 발현을 유도하였다. 또한 상기 배양액을 10,000× g로 4℃에서 10분 동안 원심분리하고 50 mM 트리스 용액 (pH 7.5)으로 두 번 세척하여 균체를 획득하였다.

본 발명에서는 상기 생물 전환 반응의 수행 시 첨가되는 기질에 따른 히드록시 지방산의 생산성을 조사하기 위하여, 상기 표 1에 나타낸 바와 같이 리놀레산 (linoleic acid), 미리스톨레산 (myristoleic acid), 팔미톨레산 (palmitoleic acid), 페트로셀린산 (petroselinic acid), 올레산 (oleic acid), 엘라이드산 (elaidic acid), 배센산 (vaccenic acid), 리놀렌산 (linolenic acid), 감마 리놀렌산 (λ-linolenic acid), 아라키돈산 (arachidonic acid) 및 이루신산 (erucic acid) 등의 함량을 조사하여 그 결과를 확인하였다. 또한 각 기질은 농도 20 mM 을 0.2 ㎖/ℓ의 트윈 80 이 포함된 50 mM 트리스 완충용액에서 pH 7.5 및 온도 30℃ 조건에서 20 g/ℓ의 균체와 2시간 동안 반응을 진행시킨 후 50% 황산을 첨가하여 다시 반응을 정지시켰다. 또한, 상기 균주는 원심분리하여 제거하고 이로부터 상층액만을 회수하여 동일한 양의 에틸아세테이트 (ethyl acetate)로 추출한 다음 증류 농축장치를 이용하여 농축시키고 잔존하는 불포화 지방산들을 14%의 불소브롬 메탄올 (BF₃ methanol)을 이용하여 메틸화시켰다. 또한, 메틸화된 각각의 불포화 지방산들을 노르말 헥산 (n-hexane)을 이용하여 추출한 다음 실리카 겔 (silica gel)이 장착된 SPB-1 모세관 컬럼 (SPB-1 capillary column)이 장착된 기체 크로마토그래피 (gas chromatography)를 수행하여 상기 균체의 효소 활성을 측정하였다. 이 때 검출기는 불꽃 이온화 검출기 (flame ionization detector)를 이용하였고, 검출기, 주입구의 온도는 각각 250℃ 및 260℃로 맞추었으며 컬럼의 온도는 150℃부터 210℃까지 분당 4℃씩 온도가 상승하도록 조절하였다.

또한, 상기의 생물 전환 반응한 불포화 지방산들은 다시 실리카 겔 60 F254로 덮여 있는 얇은 막 크로마토그래피 (TLC, thin layer chromatography)를 실시하여 전환된 히드록시 지방산이 있는지 여부를 관찰하였다. 이 때 전개 용매로는 79% 톨루엔 (toluene), 14% 디옥산 (dioxane) 및 7% 아세트산 (acetic acid)을 사용하고, 발색시약으로는 95% 메탄올 (methanol), 5% 황산 (H₂SO₄) 용매에 100㎖당 0.3 g의 N-1-나프틸에틸렌디아민 다이히드로클로라이드 (N-1-naphtylethyleneaiamine dihydrochloride)를 첨가하여 사용하였다. 그 결과, 본 발명의 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 균주는 리놀레산, 올레산, 리놀렌산, 감마 리놀렌산 및 팔미톨레산의 순서로 전환효소의 활성이 높았으며 특히 리놀레산에서 가장 높은 생산 수율을 나타내었다.

또한, 상기 불포화 지방산에 따라 각기 생산되는 히드록시 지방산을 확인하기 위하여, 기체 크로마토그래피/질량 측정법 (Gas chromatography/mass spectroscopy)을 실시하고 이 때 70 eV 로 이온화시키고 이온의 온도는 230℃로 조절하였으며, 상기 기체 크로마토그래피 분석과 동일하게 검출기, 컬럼, 주입기의 온도를 조정하였다. 그 결과, 상기 불포화 지방산들 중 리놀레산, 올레산, 리놀렌산, 감마 리놀렌산 및 팔미톨레산을 사용한 경우 각각 10-히드록시-12(제트)옥타데세노산 (10-hydroxy-12(Z)-octadecenoic acid), 10-히드록시스테아르산 (10-hydroxystearic acid), 10-히드록시-12,15(제트,제트)-옥타데카디엔산 (10-hydroxy-12,15(Z,Z)-octadecadienoic acid), 10-히드록시-6,12(제트,제트)-옥타데카디엔산 (10-hydroxy-6,12(Z,Z)-octadecadienoic acid) 및 10-히드록시팔미트산 (10-hydroxypalmitic acid)이 전환되어 생산되는 것을 확인할 수 있었다.

불포화 지방산에 대한 기질 특이성 조사

기질	상대 활성도(%)	산물
기질	상대 활성도(%)	TLC	GC/MS (m/z)	히드록시 지방선
Myristoleic acid (C14:△⁹)	0	-	-	-
Palmitoleic acid (C16:△⁹)	26	+	169, 201, 268	10-Hydroxypalmitic acid
Petroselinic acid (C18:△⁶)	0	-	-	-
Oleic acid (C18:△⁹⁽ ^Z ⁾)	64	+	169, 201, 296	10-Hydroxystearic acid
Elaidic acid (C18:△⁹⁽ ^E ⁾)	0	-	-	-
Linoleic acid (C18:△⁹)	100	+	169, 201, 294	10-Hydroxy-12(Z)-octadecenoic acid
Vaccenic acid (C18:△11)	0	-
Linolenic acid (C18:△^9,12,15)	79	+	169, 201, 292	10-Hydroxy-12,15(Z,Z)-octodecadienoic acid
λ-Linolenic acid (C18:△^6,9,12)	70	+	167, 199, 292	10-Hydroxy-6,12(Z,Z)-octodecadienoic acid
Arachidonic acid (C20:△^5,8,11,14)	0	-	-	-
Erucic acid (C22:△¹³)	0	-	-	-

상기와 같이 기질 특이성을 조사한 결과, 본 발명의 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 균주는 리놀레산 사용 시 최대 효소 활성을 나타내고 탄소수 14 보다 큰 cis-9 형태의 불포화 지방산에게만 특이성을 보이며 다른 부산물을 생산하지 않는 특성을 가지는 것을 알 수 있었다.

실시예 4. pH 및 온도 변화에 따른 생물 전환 활성 조사

본 발명은 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 균주의 pH 및 온도 변화에 따른 생물전환 활성을 조사하기 위하여, 기질로서 리놀레산을 사용하여 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산을 생산하는 효소의 활성을 다음과 같이 측정하였다. 먼저 상기 실시예 3과 동일한 과정으로 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 균주를 배양하고, pH 및 온도 변화에 따라 리놀레산으로부터 10-히드록시-12-옥타데세노산을 높게 생산하는 최적 조건을 조사하기 위하여 다양한 pH 및 온도 조건들에서 균체와 기질을 반응시키고 효소 활성을 비교하였다.

구체적으로 상기 전환 활성에 미치는 pH 효과를 조사하기 위하여, 10 g/ℓ 리놀레산, 10 g/ℓ 균체 및 0.2 ㎖/ℓ 트윈 80을 포함하는 50 mM 인산 완충용액을 pH 6.0 에서부터 7.0까지의 범위에서 반응시키고 다시 10 g/ℓ 리놀레산과 10 g/ℓ 균체, 0.2 ㎖/ℓ 트윈 80을 포함한 50 mM 트리스 완충용액을 pH 7.0 에서부터 8.0까지의 범위에서 반응시켰다. 상기의 반응양은 10 ㎖으로 조절하고 15 ㎖ 플라스틱 용기에서 250 rpm의 교반속도로 반응을 진행시켰다. 이 때 반응 온도는 30℃로 반응 시간은 1시간으로 조절하였다. 그 다음 50% 황산을 첨가하여 반응을 정지시키고 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산의 양을 측정하여 그 생산량을 기초로 상대적인 효소 활성을 산정하였다. 그 결과 도 1a에 나타난 바와 같이, pH 7.5 에서 최대의 전환 활성이 나타나는 것을 확인하였다.

또한, 상기 전환 활성에 미치는 온도의 효과를 조사하기 위하여, 전환 반응은 온도 20℃에서 40℃까지 범위에서 10 g/ℓ 리놀레산과 10 g/ℓ 균체, 0.2 ㎖/ℓ 트윈 80을 포함한 50 mM 트리스 완충용액을 사용하여 pH 7.5 조건에서 각각 1시간 동안 진행시켰으며, 이 때 50% 황산을 첨가하여 반응을 정지시키고 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산의 생산량을 측정하여 그 상대적인 효소 활성을 산정하였다. 그 결과 도 1b에 나타난 바와 같이, 온도 30℃에서 최적의 활성이 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산이 생산되는 최적 pH 및 온도는 각각 pH 7.5 및 30℃ 인 것을 알 수 있었고, 이 때 사용되는 완충용액은 트리스 완충용액이 바람직한 것을 확인하였다.

도 1a 및 도 1b는 본 발명의 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 (Stenotrophomonas acidaminiphilia) 균주를 이용한 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산의 생산성을 pH 및 온도에 따른 상대적인 활성으로 나타낸 것이고, 이 때 ●는 인산 완충용액; ○는 트리스 완충용액을 나타낸다.

실시예 5. 균체 농도 및 리놀레산 농도의 변화에 따른 생물 전환 활성 조사

본 발명은 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 균주에서 균체 농도 및 리놀레산 농도에 따른 10-히드록시-12-옥타데세노산의 생산량을 조사하기 위하여, 상기 실시예 3과 동일한 과정으로 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 균주를 배양하고 상기 균주와 리놀레산으로부터 10-히드록시-12-옥타데세노산이 높게 생산되는 최적 조건을 다음과 같이 조사하였다.

먼저 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 균체의 농도가 미치는 효과를 조사하기 위하여, 10 g/ℓ 리놀레산과 0.2 ㎖/ℓ 트윈 80이 포함된 pH 7.5, 50 mM 인산 완충용액을 사용하고 10 g/ℓ에서부터 40 g/ℓ까지 범위의 균체 농도에서 전환 반응을 진행시켰다. 상기 반응양은 10 ㎖으로 조절하고 15 ㎖ 플라스틱 용기에서 250 rpm의 교반속도로 반응을 진행시켰다. 이 때 반응 온도는 30℃으로 반응 시간은 1시간으로 조정하였다. 그 다음 50% 황산을 첨가하여 반응을 정지시키고 생산된 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산의 양을 측정하였다. 그 결과 도 2a에 나타난 바와 같이, 20 g/ℓ의 균체 농도에서 최대 전환 활성이 나타나는 것을 확인하였다.

또한 상기 전환 활성에 미치는 리놀레산 농도의 효과를 조사하기 위하여, 전환 반응은 리놀레산의 농도 5 g/ℓ에서부터 40 g/ℓ까지 범위에서 20 g/ℓ 균체, 0.2 ㎖/ℓ 트윈 80을 포함한 50 mM 트리스 완충용액을 pH 7.5 조건에서 각각 1시간 동안 진행시켰으며, 이 때 50% 황산을 첨가하여 반응을 정지시키고 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산의 생산량을 측정하였다. 그 결과는 도 2b에 나타난 바와 같다. 따라서, 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산이 생산되는 최적 균체 농도는 20 g/ℓ인 것으로 확인되었다. 그러나 기질 농도에 따른 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산의 생산량은 20 g/ℓ보다 높은 농도에서 그 생산량이 적게 증가하고 전환율도 감소하는 것을 알 수 있어 리놀레산의 농도는 20 g/ℓ이내 범위가 바람직한 것을 확인하였다.

도 2a 및 도 2b는 본 발명의 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 균주의 균체 농도에 따른 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산의 생산량및 리놀레산 농도에 따른 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산의 생산량을 비교하여 나타낸 것이다. 이 때 전환 반응은 pH 7.5 및 30℃의 조건에서 진행되었고, ●는 리놀레산의 농도에 따른 전환율을 ○은 리놀레산의 농도에 따른 전환율을 나타낸다.

실시예 6. 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 균주를 이용한 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산의 고수율 생산

본 발명에서는 미생물을 이용하여 리놀레산으로부터 10-히드록시-12-옥타데세노산을 대량 생산하는 방법을 개발하기 위하여, 상기 실시예 3과 동일한 과정으로 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 균주를 배양하고, 생물전환 반응은 250 ㎖ 생물반응기에서 100 ㎖의 반응양으로 20 g/ℓ 리놀레산, 20 g/ℓ의 균체 및 0.2 ㎖/ℓ 트윈 80이 포함된 50 mM 트리스 완충용액을 pH 7.5 조건에서 3시간까지 진행되도록 하였다. 이 때 반응 온도는 30℃로 조정하고 반응 전에 95% 질소와 5% 이산화탄소를 이용하여 혐기적인 조건으로 만들어준 후 200 rpm의 교반 속도로 반응을 진행시켰다. 또한, 시간에 따라 생물반응기에서 1 ㎖씩을 회수하여 50%의 황산을 첨가하여 반응을 정지시키고 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산의 생산량을 측정하였다. 그 결과는 도 3에 나타난 바와 같다.

도 3에 나타난 바와 같이, 리놀레산과 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 균주를 반응시키고 2시간이 경과했을 때 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산은 15 g/ℓ의 생산량을 보이고 7.4 g/ℓ??h의 생산율을 나타내었다. 지금까지 생산된 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산의 최대 농도와 생산성은 플라보박테리움 (Flavobacterium sp. NRRL B-14859)에 의한 2.97 g/ℓ와 0.88 g/ℓ·h 인 점을 참고하면, 본 발명의 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 균주는 상기 플라보박테 리움보다 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산을 각각 생산 농도 5배와 생산성 89배가 높은 전환 효율을 나타내는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 발명의 미생물 생촉매를 이용하는 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산의 제조방법은 그 수율이 매우 높고 선택성도 우수한 것임을 확인하였다.

도 3은 본 발명의 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 균주의 농도 20 g/ℓ 및 리놀레산 농도 20 g/ℓ 조건에서 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산의 생산 시 지방산의 생산량 증가 (●) 및 리놀레산의 감소 (○)를 나타낸 것이다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 (Stenotrophomonas acidaminiphilia) 균주는 불포화 지방산을 히드록시 지방산으로 효과적으로 전환시킬 수 있고, 본 발명의 제조방법은 상기 미생물을 첨가하고 균체의 농도, 기질 농도, 온도 및 pH 등을 조절하여 배양하는 과정으로 부산물이 없이 향료 락톤 (lactone) 생산의 중간물질이면서 윤활제로 사용되는 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산을 선택적으로 고수율 생산할 수 있으므로, 종래의 화학적인 방법보다 환경 친화적이고 특이성이 높으며 부산물도 없이 유용한 히드록시 지방산을 효율적으로 얻는데 널리 사용될 수 있다. 또한 식물체에 다량 함유된 불포화 지방산을 원료로 사용하는 생물전환 공정이므로, 생산 비용을 효과적으로 절감시키고 효율을 극대화시킬 수 있다.

Claims

스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 (Stenotrophomonas acidaminiphilia) 균주; 리놀레산 (linoleic acid), 올레산 (oleic acid), 리놀렌산 (linolenic acid), 감마 리놀렌산 (γ-linolenic acid) 및 팔미톨레산 (palmitoleic acid)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 불포화 지방산 기질; 및 리놀레산 (linoleic acid), 올레산 (oleic acid), 리놀렌산 (linolenic acid), 감마 리놀렌산 (γ-linolenic acid) 및 팔미톨레산 (palmitoleic acid)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 유도물질을 이용하는 생물전환 공정으로 히드록시 지방산 (hydroxy fatty acid)을 얻는 제조방법.
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제 1항에 있어서,

상기 히드록시 지방산은 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산 [10-hydroxy-12(Z)-octadecenoic acid], 10-히드록시스테아르산 (10-hydroxystearic acid), 10-히드록시-12,15(제트,제트)-옥타데카디엔산 (10-hydroxy-12,15(Z,Z)-octadecadienoic acid), 10-히드록시-6,12(제트,제트)-옥타데카디엔산 (10-hydroxy-6,12(Z,Z)-octadecadienoic acid) 및 10-히드록시팔미트산 (10-hydroxypalmitic acid)을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서,

상기 불포화 지방산 지질 및 유도물질로서 리놀레산 (linoleic acid)을 사용하여 상기 히드록시 지방산으로서 10-히드록시-12(제트)-옥타데세노산 [10-hydroxy-12(Z)- octadecenoic acid]을 생산하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항 또는 제 6항에 있어서,

상기 불포화 지방산 기질로서 리놀레산은 농도 10 내지 40 g/ℓ 범위로 사용되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항 또는 제 6항에 있어서,

상기 불포화 지방산 유도물질로서 리놀레산은 농도 0.1 내지 1.2 g/ℓ 범위로 사용되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서,

상기 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 (Stenotrophomonas acidaminiphilia) 균주는 0.01 내지 0.25 g/ℓ 포도당, 1 내지 5 g/ℓ 효모 추출액, 1 내지 4 g/ℓ 일인산칼륨, 0.01 내지 0.4 g/ℓ 황산마그네슘, 0.1 내지 0.2 ㎖/ℓ 트윈80 으로 이루어진 배양 배지로 불포화 지방산을 첨가하여 배양되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 9항에 있어서,

상기에 더하여, 상기 포도당의 농도 0 내지 0.05 g/ℓ 범위에서 혐기성 조건 으로 변화시키고 계속 배양하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서,

상기 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 (Stenotrophomonas acidaminiphilia) 균주는 균체 농도가 15 내지 30 g/ℓ 범위로 조절되는 것을 특징으로 하는 제조방법
제 1항에 있어서,

상기 생물전환 공정은 pH 7.0 내지 8.0 범위에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법
제 1항에 있어서,

상기 생물전환 공정은 온도 25 내지 33℃ 범위에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
히드록시 지방산을 생산하는 스테노트로포모나스 애씨드아미니필리아 (Stenotrophomonas acidaminiphilia) 균주 (수탁번호: KCTC 11064 BP).