CN109370931A - 一种高效降解多环芳烃的复合菌剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高效降解多环芳烃的复合菌剂，有效成分为：保藏号为CGMCC No.6531的分枝杆菌（Mycobacterium sp.）、保藏号为CGMCC No.6532的不动杆菌（Acinetobacter sp.）、保藏号为CGMCC No.6530的微杆菌（Microbacterium sp.）。该复合菌剂能以多环芳烃，如芴、萘、蒽、苊、苊烯、硫芴、咔唑、屈、菲、芘、荧蒽、苯并荧蒽、苯并蒽或苯并芘等为唯一碳源生长。本发明的复合菌剂能够显著提升单菌对于有机类污染土壤的降解效果，三种菌株发酵时间短，效果显著，成本较低，因此对多环芳烃类重度污染土壤及水体有着较强的应用前景和推广价值。

Description

一种高效降解多环芳烃的复合菌剂及其应用
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域，具体地说，涉及一种高效降解多环芳烃的复合菌剂及其应用。
背景技术
多环芳烃(PAHs)化合物是一类可长久存在于环境中，具有强致癌、致畸与致突变等特性的环境污染物。这类物质通常难溶于水，具有很高的辛醇-水分配系数以及较小的蒸气压。在自然条件下，多环芳烃非常稳定，难于被生物所降解利用。伴随着苯环数目的增加，多环芳烃的脂溶性有所增强，水溶性减小，在环境中存在的时间越长，遗传毒性越高。
农田污染主要来自污灌农田，从地域分布上，污灌农田主要集中在北方水资源严重短缺的海、辽、黄、淮四大流域，约占全国污水灌溉面积的85%。污水灌溉对农田造成的污染来自两个方面，一是污染物被土壤吸附，从而进入食物体内；二是向下迁移，对浅水地下水的水质造成影响。对于多环芳烃的危害尤其值得注意的是，当水生养殖动物暴露于持续的污染源中时，即使在水中的多环芳烃浓度处于检测限以下，水生动物体内的浓度也将富集到客观的程度。Jeannie等的研究就发现水中多环芳烃浓度处于检测限下(<0.01mg/L)，斑马贝组织中的浓度为6.58mg/L。除农田污染外，我国河流的污染情况也极为严重，2000年，长江和辽河沉积物中检测出多环芳烃类化合物17种，其中属于美国EPA优先控制的种类11种，属于我国环境优先污染物的有6种。
此外，伴随着我国城市化进程的深入，大量污染企业从城市中心搬迁、拆迁，遗留下大量的污染场地，这些场地将要进入土地开发市场，作为商业、住宅用地。这些场地的污染状况直接关系到将要在这些土地上生活工作的人群的身体健康。
中国现有耕地有近1/5受到不同程度的污染，污染土壤将导致农作物减产，甚至有可能引起农产品中污染物超标，进而危害人体健康。另外，随着经济发展与城市化的加速，工矿企业导致的PAHs场地污染也十分严重。由于产业结构与城市布局的变化与调整，有些化工、冶金等污染企业纷纷搬迁，加上一些企业的倒闭，污染场地不断产生。土壤是人类社会生产活动的重要物质基础，是不可缺少、难以再生的自然资源。没有处理的污染场地将是化学定时炸弹，一旦大面积爆发将会对国家可持续发展造成难以估量的影响，因此必须对土壤污染的预防和污染土壤修复予以高度重视。因此有必要妥善管理并加以修复，使其得到合理利用。
微生物降解被认为是PAHs在自然界中降解的主要途径，应用生物降解原理治理被污染环境的生物修复技术近年来发展很快，这种方法的主要优点是经济、安全，所能处理的阈值低和残留少，应用前景十分广阔。近年来对降解PAHs的微生物进行了广泛的研究，常见的微生物有红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、分枝杆菌(Mycobacterium)、芽胞杆菌属(Bacillus)、黄杆菌属(Flavobac-terium)、气单胞菌属(Aeromonas)、拜叶林克氏菌属(Beijernckia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、蓝细菌(Cyanobacteria)、微球菌属(Micrococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)和弧菌属(VIbrio)等。真菌也具有降解PAHs的能力，研究较多的是白腐真菌(White rot fungi)。有些藻类也能降解PAHs，但因为它们光能自养的局限，其降解效率很低，关于这方面的研究不多。
目前已发现多种微生物具有降解单一PAHs的能力，例如分枝杆菌(Mycobacterium)、戈登氏菌（Gordonia）等，但环境中PAHs通常以多种组分同时存在，呈现复合污染现象，并且高分子量PAHs(4～6环PAHs)对微生物生长有强抑制作用，生物可利用性很低，增加了降解的难度。研究表明，混合菌群作为一种多菌体共存的生物群体。在其生长过程中能分解有机物，同时依靠各种微生物之间相互共生增殖及协同代谢作用降解环境中的有机物。并能激活其他具有净化功能的微生物，从而形成复杂而稳定的微生态系统。分析已有的降解多环芳烃的相关报道，分枝杆菌出现的频率较高，主要是因为其对高环PAHs具有很强的开环能力，能够迅速完成第一步分解，但由于分枝杆菌自身的生长及代谢特性：（1）分枝杆菌生长缓慢，通常都需要1～2周的生长期，而且生长量较少，给实际现场修复带来了不便以及高额的成本；（2）单一分枝杆菌对16种PAHs的降解的广谱性比较差，降解速率慢；（3）缺少与分枝杆菌协同作用的共代谢菌株，提升降解速率。基于上述原因，欲使其降解速度更快，还要联合其他微生物协同分解。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于高效降解多环芳烃的复合菌剂及其应用。
为了实现本发明目的，本发明的一种用于高效降解多环芳烃的复合菌剂，其有效成分为：保藏编号为CGMCC No.6531的分枝杆菌（Mycobacterium sp.）、保藏编号为CGMCCNo.6532的不动杆菌（Acinetobacter sp.）、保藏编号为CGMCC No.6530的微杆菌（Microbacterium sp.）。
前述复合菌剂由如下重量份的组分组成：
分枝杆菌菌剂 1-100份；
不动杆菌菌剂 1-100份；
微杆菌菌剂 1-100份。
优选地，前述复合菌剂由如下重量份的组分组成：
分枝杆菌菌剂 2份；
不动杆菌菌剂 1份；
微杆菌菌剂 1份。
其中，三种菌剂中活菌数各为1×108-1×109 cfu/ml。
本发明还提供所述复合菌剂在降解多环芳烃污染土壤及水体中的应用。其中，所述多环芳烃为芴、萘、蒽、苊、苊烯、硫芴、咔唑、屈、菲、芘、荧蒽、苯并荧蒽、苯并蒽或苯并芘等中的一种或多种。
本发明的分枝杆菌（Mycobacterium sp.），革兰氏阳性杆菌，无芽孢，通过16srDNA分析鉴定，与其它公布的分支杆菌16SrDNA的序列同源性为99%，鉴定为分支杆菌（Mycobacterium gilvum），命名为sh14-2，保藏编号为CGMCC No.6531。其发酵培养基配方为：葡萄糖5～15g/L、硫酸铵2.5～5g/L、硫酸亚铁0.28～0.5 mg/L、磷酸氢二钠1.5～2g/L、磷酸二氢钾1.36～1.6 g/L、硫酸镁 0.25～0.5 g/L、氯化钙10.7～12mg/L、氯化钠0.5～1g/L、氯化铁0.004～0.01 g/L、1 ml/L微量金属液和1 ml/L维生素复合溶液，以水配制。
本发明的不动杆菌（Acinetobacter sp.），革兰氏阴性杆菌，通过16srDNA分析鉴定，与其它公布的分支杆菌16SrDNA的序列同源性为99%，鉴定为不动杆菌（Acinetobacterlwoffii），命名为sh14-2，其保藏编号为CGMCC No.6532。发酵培养基配方分别为：氯化钠5～10g/L、酵母浸出粉5～8g/L和蛋白胨5～10g/L，以水配制。
本发明的微杆菌（Microbacterium sp.），革兰氏阳性断杆菌，通过16srDNA分析鉴定，与其它公布的微杆菌16SrDNA的序列同源性为100%，鉴定为微杆菌（Microbacteriumoxydans），命名为sh13-2，其保藏编号为CGMCC No.6530。发酵培养基配方分别为：氯化钠5～10g/L、酵母浸出粉5～8g/L和蛋白胨5～10g/L，以水配制。
以上三种菌现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期2012年10月9日。
本发明提供的一种用于高效降解多环芳烃的复合菌剂，由三种菌株组合而成：高效降解菌株分枝杆菌（Mycobacterium sp.），以及两株协同作用菌株分别为微杆菌（Microbacterium sp.）和不动杆菌（Acinetobactersp.）。该复合菌剂能以多环芳烃，如芴、萘、蒽、苊、苊烯、硫芴、咔唑、屈、菲、芘、荧蒽、苯并荧蒽、苯并蒽或苯并芘等为唯一碳源生长。该复合菌剂对200ppm的芘10天降解率为93.2%，对10mg/L的苯并芘60天的降解率为67.5%。本发明提供的复合菌剂能够显著提升单菌对于有机类污染土壤的降解效果，三种菌株发酵时间短，效果显著，成本较低，因此对PAHs类重度污染土壤及水体有着较强的应用前景和推广价值。
图1为本发明实施例1中以不同污染物为唯一碳源培养复合菌16S r DNA V3区PCR-DGGE电泳图；其中，A：芘（200ppm）+细菌培养基I；B：苯并芘（10ppm）+细菌培养基I。
图2为本发明实施例2中三种单菌分别对芘的降解结果。
图3为本发明实施例3中单一分枝杆菌与三种混菌对芘的降解结果。
图4为本发明实施例4中单一分枝杆菌与三种混菌对苯并芘的降解结果。
图5为本发明实施例5中投加菌种60天后PAHs的降解效果；其中，空白为不加菌，处理1为加入复合菌剂，处理2为重复处理1。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1 利用PCR-DGGE方法筛选降解菌株及协同菌株
1.1菌种的分离及培养：包括菌种的分离、鉴定和菌种的培养
菌种培养采用两种培养基，即细菌培养基I和II：
细菌培养基I：硫酸铵2.5g，硫酸亚铁0.28 mg，磷酸氢二钠 1.5 g，磷酸二氢钾1.36 g，硫酸镁 0.25 g，氯化钙10.7 mg，氯化钠0.5 g，氯化铁0.004 g，1 mL微量金属液，1 mL维生素复合溶液，加水至1000 mL并将pH控制在7.2-7.4，摇匀后作为液体培养基备用，若为固体培养基，则加入1.5%琼脂粉。其中微量金属液的组成为：CoCl2·6H20 35 mg, CuCl2 0. 20mg, H3BO3 6.0 mg, MnCl2·4H2O 25 mg, Na2MoO4·2H2O 3.0 mg, NiCl2·2H2O 2.0 mg,ZnCl2 2.5 mg，加水至1000 mL；维生素复合溶液的组成为：维生素B6 1.0mg，维生素H0.5mg，维生素C 1.5mg，加水至1000 mL。
细菌培养基II：氯化钠10g，酵母浸出粉5g，蛋白胨10g，蒸馏水1L，1.5%琼脂粉。
培养基中加入PAHs的方法：在灭菌三角瓶中加入不同浓度PAHs的丙酮溶液，超净工作台内使丙酮溶液挥发完全，再加入细菌培养基I，使多环芳烃终浓度为100 mg/L。
在150ml三角瓶中加入100ml灭菌蒸馏水，加入10g新鲜高浓度PAHs污染土壤，30℃，90rpm条件下培养5天后，取10ml分别接种至上述含多环芳烃的100ml细菌培养基I中，同样条件下培养5天。
1.2分离与降解PAHs相关的目标细菌
通过划线接种的方式，分别接种于上述细菌培养基I和II制成的固体培养基平板上，30℃恒温培养箱培养至菌落生长，16S rRNA鉴定。
1.3确定不同污染物富集的样品中微生物群落分析采用PCR-DGGE方法，根据结果确定要分离纯化的目标菌落：
取1.5ml细菌培养液提取总DNA，选取细菌16S rDNA V3区进行PCR扩增。制备1 mm厚10％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度梯度为30％-70％(100％变性剂组成为7mol /L尿素和40％去离子甲酰胺)。加样后，置于1×TAE缓冲液中45 V电泳16 h。电泳完毕，取下凝胶，EB上染色。DGGE凝胶经EB染色后，在紫外灯下将凝胶中较亮的条带用洁净的刀片小心切下。将目的条带置于30μl灭菌超纯水中，-20℃放置过夜。PCR前65℃水浴溶解10min，取DNA浸出液作为模板进行PCR扩增，扩增产物再用DGGE电泳确认所回收条带的正确位置（图1）。然后PCR扩增纯化，完成测序。序列信息输入NCBI数据库进行BLAST分析。（表1）
表1 以不同污染物为唯一碳源培养复合菌16S r DNA V3区PCR-DGGE电泳图谱对应单个条带的序列比对分析
从表1中可以看出，在以芘和苯并芘为唯一碳源的培养过程中，主要有4个优势菌株，分别是分枝杆菌（Mycobacterium sp.）、微杆菌（Microbacterium sp.）、不动杆菌（Acinetobacter sp.）和黄单孢菌属（Xanthomonas sp.），其中在两种污染物中都存在的菌株分别为分枝杆菌、微杆菌和不动杆菌这三种菌。
1.4发酵培养基的筛选
分别选取以下几种配方的培养基对分枝杆菌进行培养，培养条件为30℃，90rpm振荡培养24小时，测量培养液OD值变化。
配方一：蛋白胨1g/L，酵母膏0.5g/L，氯化钠1g/L，硫酸铵2.5～5g/L，硫酸亚铁0.28～0.5 mg/L，磷酸氢二钠 1.5～2g/L，磷酸二氢钾1.36～1.6 g/L，硫酸镁 0.25～0.5g/L，氯化钙10.7～12mg/L，氯化钠0.5～1 g/L，氯化铁0.004～0.01 g/L，1 ml/L微量金属液，1 ml/L维生素复合溶液。
配方二：蛋白胨2g/L，酵母膏1g/L，氯化钠2g/L，硫酸铵2.5～5g/L，硫酸亚铁0.28～0.5 mg/L，磷酸氢二钠 1.5～2g/L，磷酸二氢钾1.36～1.6 g/L，硫酸镁0.25～0.5 g/L，氯化钙10.7～12mg/L，氯化钠0.5～1 g/L，氯化铁0.004～0.01 g/L，1 ml/L微量金属液，1ml/L维生素复合溶液。
配方三：葡萄糖5g/L，硫酸铵2.5～5g/L，硫酸亚铁0.28～0.5 mg/L，磷酸氢二钠1.5～2g/L，磷酸二氢钾1.36～1.6 g/L，硫酸镁 0.25～0.5 g/L，氯化钙10.7～12mg/L，氯化钠0.5～1 g/L，氯化铁0.004～0.01 g/L，1 ml/L微量金属液，1 ml/L维生素复合溶液。
配方四：葡萄糖10g/L，硫酸铵2.5～5g/L，硫酸亚铁0.28～0.5 mg/L，磷酸氢二钠1.5～2g/L，磷酸二氢钾1.36～1.6 g/L，硫酸镁 0.25～0.5 g/L，氯化钙10.7～12mg/L，氯化钠0.5～1 g/L，氯化铁0.004～0.01 g/L，1 ml/L微量金属液，1 ml/L维生素复合溶液。
配方五：葡萄糖15g/L，硫酸铵2.5～5g/L，硫酸亚铁0.28～0.5 mg/L，磷酸氢二钠1.5～2g/L，磷酸二氢钾1.36～1.6 g/L，硫酸镁 0.25～0.5 g/L，氯化钙10.7～12mg/L，氯化钠0.5～1 g/L，氯化铁0.004～0.01 g/L，1 ml/L微量金属液，1 ml/L维生素复合溶液。
筛选最优发酵培养基：分别采用上述配方对分枝杆菌进行培养，培养条件为30℃，90rpm振荡培养24小时，测量培养液OD600值变化。根据表2中的结果，在经过相同培养条件扩培以后，配方5的OD600值最高，为1.85，配方1的OD600值最低为0.52，由此可以看出，配方5是比较适合培养分枝杆菌菌株，且此培养基的成分较简单，成本较低，具有很好的应用价值。
表2 各配方培养后OD600结果
1.5降解实验
共设置三个方案，目的在于通过比较来验证最佳降解效果，设置不加菌悬液的作为对照，采用GC-MS测定菌株的降解效果。
方案一：将要降解的芘作为唯一的碳源，在含细菌培养基I的液体中，分别加入培养好的三种单一细菌，室温90rpm条件下，在2、4、6、8、10d进行萃取，通过GC-MS检测；
方案二：将要降解的芘作为唯一的碳源，在含细菌培养基I的液体中，分别加入培养好的单一分枝杆菌与三种混合菌，室温90rpm条件下，在2、4、6、8、10d进行萃取，通过GC-MS检测；
方案三：将要降解的苯并芘为唯一的碳源，在含细菌培养基I的液体中，分别加入培养好的单一分枝杆菌与三种混合菌，室温90rpm条件下，在5、10、15、20、30、40、50、60d进行萃取，通过GC-MS检测；
方案四：将3种菌分别接种到上述细菌培养基I中，添加1%葡萄糖溶液，30℃，90rpm振荡培养24小时后，离心收集菌液，用适量的上述细菌培养基I混悬后，投放到长期污染的含有高分量多环芳烃污染土壤中，定期投加适量的不同配比的营养元素，室温下，保持环境中的40-60%的水分含量，定期通过GC-MS检测土壤中污染物浓度的变化。
实施例2 三种单菌分别对芘的降解效果
将要降解的芘（终浓度200ppm）作为唯一的碳源，在含细菌培养基I的液体中，分别加入等量培养好的三种单一细菌，室温90rpm条件下，在2、4、6、8、10d进行萃取，通过GC-MS检测；由图2可以看出，分枝杆菌具有较强分解芘的能力，在第10天对终浓度200ppm的芘溶液降解率为77.1%，而单一微杆菌和不动杆菌对芘的分解能力很弱，在第10天降解率分别为18.1%和13.2%。
实施例3 单一分枝杆菌与三种混合菌对芘的降解效果
将要降解的芘（终浓度200ppm）作为唯一的碳源，在含细菌培养基I的液体中，分别加入培养好的单一分枝杆菌与三种混合菌，室温90rpm条件下，在2、4、6、8、10d进行萃取，通过GC-MS检测；由图3可以看出，分枝杆菌具有较强分解芘的能力，在第10天对终浓度200ppm的芘溶液降解率为77.1%，三种混合菌（分枝杆菌：微杆菌：不动杆菌=2；1；1）进一步强化了降解能力，在第10天检测到混合菌对芘的降解率为93.2%，因此可以得出，微杆菌和不动杆菌具有协同强化作用，混合菌的应用效果要优于单一分枝杆菌。
实施例4 单一分枝杆菌与三种混合菌对苯并芘的降解效果
将要降解的苯并芘（终浓度10ppm）为唯一的碳源，在含细菌培养基I的液体中，分别加入培养好的单一分枝杆菌与三种混合菌，室温90rpm条件下，在5、10、15、20、30、40、50、60d进行萃取，通过GC-MS检测；由图4可以看出，经过60天实验，单一分枝杆菌对苯并芘的降解率为47.3%，而三种混合菌对苯并芘的降解率为67.5%，另外还发现，单一分枝杆菌在经过30天实验以后，降解趋势和降解速率明显减慢，有可能是因为代谢产物影响进一步分解及微生物的生长。因此微杆菌和不动杆菌具有协同强化作用，三种混合菌对苯并芘的效果要明显好于单一分枝杆菌。
实施例5 混合菌对多环芳烃污染土壤的降解效果
将三种菌分别接种到上述细菌培养基I中，添加1.5%葡萄糖溶液中，30℃，90rpm振荡培养24小时后，离心收集菌液，用适量的上述细菌培养基I混悬后，投放到长期污染的含有高分量多环芳烃污染土壤中，定期投加适量的不同配比的营养元素，室温下，保持环境中的40-60%的水分含量，定期通过GC-MS检测土壤中污染物浓度的变化。由图5可以计算出，处理1（加入复合菌剂）和处理2（重复处理1）相对于空白的降解效果。经统计，在60天的实验后，空白的PAHs含量为3665.46ppm，而处理1和处理2的含量分别为2176.549ppm和2167.252ppm，降解率分别为40.7%和40.9%，降解效果显著。因此，本发明的混菌菌剂对PAHs污染土壤的具有较强的实用价值和推广价值，解决了高环芳烃降解难，速度慢等问题。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种高效降解多环芳烃的复合菌剂，其有效成分为：保藏编号为CGMCC No.6531的分枝杆菌（Mycobacterium sp.）、保藏编号为CGMCC No.6532的不动杆菌（Acinetobactersp.）、保藏编号为CGMCC No.6530的微杆菌（Microbacterium sp.）。
2.根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，由如下重量份的组分组成：
分枝杆菌菌剂 1-100份；
不动杆菌菌剂 1-100份；
微杆菌菌剂 1-100份；
其中，三种菌剂中活菌数各为1×108-1×109 cfu/ml。
3.根据权利要求2所述的复合菌剂，其特征在于，其特征在于，由如下重量份的组分组成：
分枝杆菌菌剂 2份；
不动杆菌菌剂 1份；
微杆菌菌剂 1份。
4.权利要求1-3任一项所述复合菌剂在降解多环芳烃污染土壤及水体中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述多环芳烃为芴、萘、蒽、苊、苊烯、硫芴、咔唑、屈、菲、芘、荧蒽、苯并荧蒽、苯并蒽或苯并芘中的一种或多种。
6.一种分枝杆菌（Mycobacterium sp.），其保藏编号为CGMCC No.6531。
7.权利要求6所述分枝杆菌的发酵培养基，其配方为：葡萄糖5～15g/L、硫酸铵2.5～5g/L、硫酸亚铁0.28～0.5 mg/L、磷酸氢二钠1.5～2g/L、磷酸二氢钾1.36～1.6 g/L、硫酸镁 0.25～0.5 g/L、氯化钙10.7～12mg/L、氯化钠0.5～1 g/L、氯化铁0.004～0.01 g/L、1ml/L微量金属液和1 ml/L维生素复合溶液，以水配制。
8.一种不动杆菌（Acinetobacter sp.），其保藏编号为CGMCC No.6532。
9.一种微杆菌（Microbacterium sp.），其保藏编号为CGMCC No.6530。
10.权利要求8所述不动杆菌或权利要求9所述微杆菌的发酵培养基，其配方为：氯化钠5～10g/L、酵母浸出粉5～8g/L和蛋白胨5～10g/L，以水配制。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110434170A (zh) * 2019-08-14 2019-11-12 江苏师范大学 一种降解土壤中苯并芘的方法
CN112899185A (zh) * 2021-01-29 2021-06-04 哈尔滨工业大学（深圳） 一株黑臭底泥中苯并[a]蒽降解菌的筛选及其应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010073276A (ko) * 2000-01-13 2001-08-01 안태영 다환식 탄화수소 오염 토양의 생물정화를 위한 고분자다환식 탄화수소 분해 미생물, 그의 제조 방법 및 분해미생물을 포함하는 유류 분해 조성물
CN101643707A (zh) * 2008-08-07 2010-02-10 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 多环芳烃降解微生物菌剂
CN101899406A (zh) * 2010-04-27 2010-12-01 北京大学 一种去除多环芳烃和/或降解多环芳烃的菌株及其应用
CN102533578A (zh) * 2010-12-10 2012-07-04 中国农业大学 多环芳烃降解微生物菌剂
CN102776135A (zh) * 2011-05-12 2012-11-14 中国科学院沈阳应用生态研究所 一种降解多环芳烃污染物的混合菌剂
CN102899271A (zh) * 2012-09-29 2013-01-30 轻工业环境保护研究所 高效降解多环芳烃和苯系有机物的分枝杆菌16f及其应用
CN103045507A (zh) * 2012-12-12 2013-04-17 轻工业环境保护研究所 高效降解高分子量多环芳烃的细菌分离方法及其应用
CN106834158A (zh) * 2016-08-12 2017-06-13 轻工业环境保护研究所 一种处理皮革废水的微生物菌剂及其制备方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010073276A (ko) * 2000-01-13 2001-08-01 안태영 다환식 탄화수소 오염 토양의 생물정화를 위한 고분자다환식 탄화수소 분해 미생물, 그의 제조 방법 및 분해미생물을 포함하는 유류 분해 조성물
CN101643707A (zh) * 2008-08-07 2010-02-10 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 多环芳烃降解微生物菌剂
CN101899406A (zh) * 2010-04-27 2010-12-01 北京大学 一种去除多环芳烃和/或降解多环芳烃的菌株及其应用
CN102533578A (zh) * 2010-12-10 2012-07-04 中国农业大学 多环芳烃降解微生物菌剂
CN102776135A (zh) * 2011-05-12 2012-11-14 中国科学院沈阳应用生态研究所 一种降解多环芳烃污染物的混合菌剂
CN102899271A (zh) * 2012-09-29 2013-01-30 轻工业环境保护研究所 高效降解多环芳烃和苯系有机物的分枝杆菌16f及其应用
CN103045507A (zh) * 2012-12-12 2013-04-17 轻工业环境保护研究所 高效降解高分子量多环芳烃的细菌分离方法及其应用
CN106834158A (zh) * 2016-08-12 2017-06-13 轻工业环境保护研究所 一种处理皮革废水的微生物菌剂及其制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘芳等: "高分子量多环芳烃降解菌LD29的筛选及降解特性研究", 《环境科学》 *
孙翼飞等: "一株高浓度多环芳烃降解菌的鉴定和降解特性", 《生态学杂志》 *
毛健等: "一株高分子量多环芳烃降解菌的筛选、鉴定及降解特性研究", 《微生物学通报》 *
许丽等: "一株高效降解芘的细菌分离、鉴定及其降解效果", 《微生物学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110434170A (zh) * 2019-08-14 2019-11-12 江苏师范大学 一种降解土壤中苯并芘的方法
CN110434170B (zh) * 2019-08-14 2021-07-30 江苏师范大学 一种降解土壤中苯并芘的方法
CN112899185A (zh) * 2021-01-29 2021-06-04 哈尔滨工业大学（深圳） 一株黑臭底泥中苯并[a]蒽降解菌的筛选及其应用
CN112899185B (zh) * 2021-01-29 2022-09-09 哈尔滨工业大学（深圳） 一株黑臭底泥中苯并[a]蒽降解菌的筛选及其应用

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