CN103215204B

CN103215204B - 高效降解菲的节杆菌菌株及其应用

Info

Publication number: CN103215204B
Application number: CN201310099767.XA
Authority: CN
Inventors: 杨琴; 张海玲; 周立辉; 任建科; 冀忠伦; 赵敏; 任小荣; 李岩; 蒋继辉; 张璇
Original assignee: China Petroleum and Natural Gas Co Ltd
Current assignee: China Petroleum and Natural Gas Co Ltd
Priority date: 2013-03-26
Filing date: 2013-03-26
Publication date: 2015-01-21
Anticipated expiration: 2033-03-26
Also published as: CN103215204A

Abstract

本发明提供了一种高效降解菲的节杆菌菌株及其应用。所述的降解菲的节杆菌菌株的保藏编号为CGMCC No.6581。本发明的菌株能够有效降解土壤及油泥中多环芳烃和杂环类物质特别是菲类物质，可有效应用于黄土塬区石油污染土壤和土壤中PAHs污染物的生物降解处理，特别是菲的降解率可达98％以上。本发明同时提供了该菌种生长与降解的营养液配方及使用此菌种现场修复石油污染土壤应用的方法。

Description

高效降解菲的节杆菌菌株及其应用

技术领域

本发明属于能源生物技术和环境生物技术领域，具体地说，本发明涉及一株节杆菌属Arthrobacter sp.菌株及其应用，该菌株能够有效降解土壤及油泥中多环芳烃和杂环类物质特别是菲类物质，可有效应用于黄土塬区石油污染土壤和土壤中PAHs污染物的生物降解处理。

背景技术

随着石油工业的发展，石油对环境的污染污染越来越严重。特别是地下油罐和输油管线腐蚀渗漏污染土壤和地下水源，不仅造成土壤盐碱化、毒化，导致土壤破坏和废毁，而且其有毒物（主要是烃类，按照烷烃、环烷烃、烯烃、芳烃的顺序毒性逐渐增强，我国第一批公布的68种优先控制污染物也将7种多环芳烃列入）能通过农作物尤其是地下水进入食物链系统，最终直接危害人类。

目前对已造成石油污染的土壤，可以采用生物或化学的处理技术，主要处理措施有以下三种：物理吸附法、化学光解法及生物代谢和降解法。尽管多环芳烃可以通过化学氧化、光解及挥发而被去除，但微生物降解依然是影响多环芳烃在环境中存留的主要过程。并且，环境中多环芳烃最彻底的处理方法是生物修复，生物修复主要是利用生物，通过工程措施为生物生长与繁殖提供必要的条件，将土壤及地下水或海洋中危险污染物从现场加速去除或降解。

己知含有氧化PAHs(从苯并芘到菲)酶的微生物很多，各国科学家已分离出许多降解PAHs的纯菌或混合菌，这些微生物近年来也被研究应用于污染土壤的生物恢复。但是土壤是一个十分复杂的环境体系，受到其中很多因素，例如营养成分(碳、氮、磷源等)、温度、氧分压、含水量、pH值或盐浓度的变化等的影响，以及微生物在环境中存在不可培养的状态和多环芳烃的难降解性，目前国内仍没有适用于自身的系统成套的固相微生物降解多环芳烃技术。寻找合适的能够有效降解土壤及油泥中多环芳烃和杂环类物质的微生物具有重要价值。

发明内容

本发明主要是针对上述微生物处理石油污染土壤的现状，提供一类能够有效降解土壤及油泥中多环芳烃和杂环类物质的微生物，进而提供利用该微生物处理石油污染土壤的方法。

一方面，本发明提供了一种石油污染土壤高效降解多环芳烃的菌株，该菌株分离自黄土塬区石油污染土壤，通过对其形态特征、生理生化及16S rDNA基因序列分析初步鉴定属于节杆菌属（Arthrobacter sp.），本发明将该菌株命名为D4。该菌株已于2012年09月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号：CGMCC No.6581。该菌株能利用菲、芘及萘作为生长的唯一碳源，现场试验表明该节杆菌对低环的多环芳烃如萘(NAP)、菲(PHE)及蒽(ANT)的去除明显，特别是菲的降解率可达98%以上。本发明中也称该菌为降解菲的节杆菌，或简称降菲菌，即，本发明中的“节杆菌D4”、“降菲菌D4”均是指保藏编号为CGMCC No.6581的降解菲的节杆菌。

另一方面，本发明还提供了一种降解菲的节杆菌菌制剂，该降解菲的节杆菌菌制剂中含有保藏编号为CGMCC No.6581的降解菲的节杆菌，该菌制剂可以为固态菌制剂或液态菌制剂。由所述菌株活化制备

另一方面，本发明还提供了所述降菲菌的应用。在本发明的一具体实施方案中，提供了所述的降解菲的节杆菌或所述的降解菲的节杆菌菌制剂在降解多环芳烃菲、萘、蒽中的应用。在本发明的另一具体实施方案中，提供了所述的降解菲的节杆菌或所述的降解菲的节杆菌菌制剂在修复石油污染土壤中的应用，具体是将其应用于对石油污染土壤进行原位修复。更具体地，可以将本发明所述的降解菲的节杆菌或所述的降解菲的节杆菌菌制剂到土壤中，进行培养，从而降解土壤中的污染物。本发明的降解菲的节杆菌还可以与土著菌联合应用于石油污染土壤的原位修复，利用本发明的降菲菌强化石油中菲及其它苯环类物质的降解效果，而土著菌可加强对饱和烃、非烃的降解。具体地，所述土著菌可以是所属领域中能够用于修复石油污染土壤的一些常规菌种，例如可以是选自铜绿假单胞菌、巨大芽孢杆菌、鲁菲不动杆菌和黄色类诺卡氏菌中的一种或多种。

另一方面，本发明还提供了一种石油污染土壤原位修复方法，该方法包括加入本发明所述的降解菲的节杆菌或所述的降解菲的节杆菌菌制剂到土壤中，进行培养，从而降解土壤中的污染物。

在本发明的一个具体实施方案中，本发明的石油污染土壤原位修复方法，是将包括所述降解菲的节杆菌的菌液加入到污染土壤中，以污染土壤的原油含量为100%计，包括所述降解菲的节杆菌的菌液的添加量为0.5wt%～1.5wt%（除特别注明外，本发明中所述比例与含量均为重量比例与含量），菌液浓度为1.0×10⁸～10¹⁰CFU/ml。

根据本发明的具体实施方案，本发明的石油污染土壤原位修复方法中，所述土壤中还加入了土著菌菌液，与所述降解菲的节杆菌共同培养，以污染土壤的原油含量为100%计，土著菌菌液添加量为2wt%～5wt%，菌液浓度为1.0×10⁸～10¹⁰CFU/ml。具体地，所述土著菌可以是选自铜绿假单胞菌、巨大芽孢杆菌、鲁菲不动杆菌、黄色类诺卡氏菌和黄绿链霉菌中的一种或多种。

培养本发明的降解菲的节杆菌可以采用传统的节杆菌的培养基，也可根据其生长特性自行配制培养基。

另一方面，根据本发明的具体实施方案，本发明还提供了所利于述降解菲的节杆菌菌种生长与降解作用的营养液配方，该配方提供了微生物生长所需的营养物质，可强化微生物降解活性。在本发明的石油污染土壤原位修复方法，向土壤中加入该营养液以培养所述降解菲的节杆菌，利于本发明的降解菲的节杆菌的生长与降解效应。具体地，该营养液的配方组分如下：

锰含量（MnCl₂·4H₂O）：25ppm；

钴含量（CoCl₂·6H₂O）：35ppm；

镍含量（NiCl₂·2H₂O）：2ppm；

钼含量（Na₂MoO₄·2H₂O）：2ppm；

铁含量（FeSO₄）：1ppm；

铜含量（CuCl₂）：0.5ppm；

锌含量（ZnCl₂）：2.5ppm；

硼含量（H₃BO₃）：6ppm；

维生素c：0.2%。

上述配方中，各元素后的括号内的内容表示配制时可采用的原料，例如，“锰含量（MnCl₂·4H₂O）”表示可用MnCl₂·4H₂O作为原料配制本发明的营养液，使其中的锰元素含量达到25ppm。营养液中余量为水。

根据本发明的一具体实施方案，本发明的利用本发明的降菲节杆菌现场修复石油污染土壤的方法主要包括：

（1）降菲节杆菌活化、扩大培养，备用；

（2）按照相应比例添加降菲节杆菌（并可根据需要添加所述营养液，另可根据需要添加尿素和过磷酸钙使土壤中C:N:P=85-100:8-10:3-1，按2-4%左右（wt%）的比例添加锯末，表面活性剂吐温-800.5-1.0wt%），采用旋耕机将加入的物质及大块油泥破碎混匀；每天进行翻土通风和浇水，增加供氧量，保持水分40-50%；

（3）10d～15d后再补充添加降菲节杆菌、营养液（降菲节杆菌、营养液的补充量约为首次添加量的1/3～2/3，通常为1/2左右），继续翻耕浇水；

按照上述方法，处理约40d天后，即可取得良好的降菲效果（降菲率可高达98%以上甚至100%）。期间可定期检测含油率、原油组分及微生物活动状况，适当补充菌剂和/或营养液加强过程监测和控制。

根据本发明的一具体实施方案，本发明的利用本发明的降菲节杆菌及土著菌共同现场修复石油污染土壤的方法主要包括：

（1）将降菲节杆菌活化、扩大培养，备用；将土著菌进行富集驯化、活化培养，大规模生产，备用；

（2）按照相应比例添加土著菌及菌剂营养液，添加尿素和过磷酸钙使土壤中C:N:P=85-100:8-10:3-1，按2-4%左右（wt%）的比例添加锯末，表面活性剂吐温-800.5-1.0wt%，采用旋耕机将加入的物质及大块油泥破碎混匀；每天进行翻土通风和浇水，增加供氧量，保持水分40-50%；

（3）10d后添加降菲节杆菌，继续采用旋耕机混匀，每天进行翻土通风和浇水，增加供氧量，保持水分30-40%；

（4）继续培养15d后再按照比例补充添加土著菌、节杆菌和营养液（补充量约为首次添加量的1/3～2/3，通常为1/2左右），定期翻耕浇水；

按照上述方法，处理约40d天后，即可取得良好的降菲效果（降菲率可高达100%）。期间可定期检测含油率、原油组分及微生物活动状况，加强过程监测和控制。

利用本发明的方法能有效降低含油污泥中的石油烃、多环芳烃的含量，实现含油污泥的无害化处置，消除污染土壤中多环芳烃对人体的危害，恢复土壤的生态功能。

综上所述，本发明以降解多环芳烃为出发点，分离和培养了对土壤环境毒性物质具有明显降解作用的微生物，研究了此类微生物生长及进行原位修复的营养液配方，并进一步提供了现场含油污染土壤微生物原位修复技术的具体实施措施，可使得中度原油污染土壤的饱和烃类降解率达100%，多环芳烃的降解率高达90%左右，降菲率可高达100%。

用于专利程序的微生物保存：

保藏日期：2012年9月18日

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所

保藏编号：CGMCC NO.6581

分类命名：节杆菌（Arthrobacter sp.）。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步详细说明本发明的菌株及其特点和应用中所具有的技术效果，但本发明并不因此而受到任何限制。

实施例1

节杆菌属（Arthrobacter sp.）菌株的分离与鉴定

将黄土塬区石油芳烃污染土壤悬液以15%的接种量接种于以菲(200mg/L)为唯一碳源的MS液体培养基中，28℃好氧条件下150r/min摇床培养3～4d，相同条件下转接1次。稀释、涂于以菲为唯一碳源的MS固体培养基中，28℃恒温培养4～5d形成单菌落。挑取生长迅速、丰满、边缘整齐的菌落接入MS液体培养基中，摇瓶复筛，得到目的菌株。

菌株D4的分离：

本实施例中，共分离纯化得到56株菌株，发现其中1株降解能力最强生长最为旺盛，本发明中将该菌株命名为D4，进行进一步的鉴定。

菌株D4形态和生理生化水平鉴定：

在普通培养基上培养48h后，菌株D4全部或大部分是由大小均一的球状细胞组成，48h以前则是杆状，在培养过程中从长杆菌逐渐变短，且培养时间越长菌体越短，直到变为球菌，具有明显的球杆变化周期。在不同的培养时间内，D4呈不同的形状。杆菌的排列彼此按一定角度呈“V”或Y”型，无鞭毛，不运动，不产生芽孢、液化明胶，不水解淀粉，还原硝酸盐为亚硝酸盐，氧化葡萄糖、乳糖、果糖、半乳糖、蔗糖、木糖和乙醇，不氧化山梨醇和甘露醇。脲酶实验呈阳性，产氨实验呈阳性，不产生吲哚，产生H₂S，不含卵磷脂酶，牛奶分解实验产碱。最适生长温度为20℃～37℃，在pH值为6～10的范围内可以生长，最适生长pH值7～8。将菌株D4分别接入到牛肉膏蛋白胨培养基、加 500mg/L MP的牛肉膏蛋白胨培养基和加500mg/L MP的基础培养基中，在600nm处测定其吸光值，结果表明在加有农药MP的情况下菌株的生长受到一定的抑制，在营养条件很差的情况下菌株生长受到很大影响，生长非常缓慢。

分子生物学水平鉴定：

细菌16srDNA PCR扩增的通用引物为R：5′到3′GGC TAC CTT GTT ACG ACT（SEQ ID No.：1），F：5′到3′AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG（SEQ ID No.：2）。按照所属领域的常规操作，用通用引物扩增出菌株D4的16srDNA序列参见SEQ ID No.：3，在Genebank blast程序上比较，得出D4为节杆菌属。结合生理生化性质鉴定出D4为简单节杆菌。本发明中称其为节杆菌D4，该菌株已于2012年09月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号：CGMCC No.6581。由于该菌株具有显著的降解菲的能力（菲的降解率可达98%以上），本发明中也称该菌为降解菲的节杆菌，或简称降菲菌。

此外，本发明中还按照常规方法从甘肃省庆阳市庆城县长庆油田采油二厂城壕作业区西259-3井场石油污染土壤中筛选出了一些修复石油污染土壤的土著菌群，其包含的菌株为：铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、鲁菲不动杆菌（Acinetobacter lwoffii）、黄色类诺卡氏菌（Nocardioides luteus）和黄绿链霉菌（Streptomyces fulvoviridis）。经鉴定，这些菌群均为现有技术的已知菌种。

实施例2含油污泥微生物原位修复处理

本实施例中，利用实施例1所筛选得到的降菲菌CGMCC No.6581和/或土著菌对含油污泥进行原位修复处理，具体操作如下：

（1）将修复井场的含油污泥土壤的土著菌和本发明的降菲菌CGMCC No.6581在保藏培养基上进行富集驯化、活化培养，大规模生产，备用；

其中，菌种保藏培养基：牛肉膏蛋白胨斜面培养基，具体配方如下：

牛肉膏5g，蛋白陈10g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH7.2～7.4。

菌剂的扩大培养：分别培养实例1中得到的降菲节杆菌CGMCC No.6581以及土著菌铜绿假单胞菌、巨大芽孢杆菌、鲁菲不动杆菌、黄色类诺卡氏菌和黄绿链霉菌。方法如下：取六十只牛肉膏蛋白胨斜面培养基，分成六组，每组十管，一组划一种菌，在37℃的培养箱中培养24h后，每种菌取一只试管在无菌操作箱里用2ml生理盐水把试管里生长的菌全部洗出来放入另外一支试管里。取1ml洗下来的菌液用平板稀释法检查菌落数大于1.0×10⁸cfu.ml^-1（通常在1×10⁸～10¹⁰cfu.ml^-1）即可用于以下操作中的现场修复。各菌种也可接种至MS液体培养基中扩大培养至1×10⁸～10¹⁰cfu.ml^-1用于现场修复。

所述铜绿假单胞菌、巨大芽孢杆菌、鲁菲不动杆菌、黄色类诺卡氏菌和黄绿链霉菌菌液混合使用，菌液混合重量份比为3:1.5:1:2:2.5。

（2）在长庆油田陇东区块的西××井场建立两个3*2*0.5m³（长*宽*高）含油污泥生物处理单元（处理池），收集钻井、试油、压裂、洗井、检修等作业污染土壤分别置于两个油泥生物处理单元中，每个处理池约2m³油污土壤，并分拣出油污土壤中的砖瓦、石块、杂草、塑料杂物和颗粒较大的砂石，并用铁锹将油泥反复破碎至粒径约小于10mm。

（3）分析石油污染土壤的含油量、原油组分及含量、碳氮磷的含量，确定菌剂和营养物质添加量。按照相应比例向两个处理池中分别添加土著菌菌液及营养液，以污染土壤的原油含量为100%计，每个处理池中，土著菌混合菌液添加量为2wt%～5wt%，营养液添加量为0.0005wt%～0.001wt%，并添加尿素和过磷酸钙使土壤中C:N:P=85-100:8-10:3-1，按2-4%左右（wt%）的比例添加锯末，表面活性剂吐温-800.5-1.0wt%，采用旋耕机将加入的物质及大块油泥破碎混匀；每天进行翻土通风和浇水，增加供氧量，保持水分30-40%。

本实施例中此次含油污泥生物处理单元油泥初始含油率为10%左右，尿素和过磷酸钙添加量为C:N:P=100:8:1，营养液添加量为0.0005wt%，土著菌菌液添加量为2%，锯末添加2%，表活剂加量为0.5%。所述的营养液配方：锰含量（MnCl₂·4H₂O）25ppm，钴含量（CoCl₂·6H₂O）35ppm，镍含量（NiCl₂·2H₂O）2ppm，钼含量（Na₂MoO₄·2H₂O）2ppm，铁含量（FeSO₄）1ppm，铜含量（CuCl₂）0.5ppm，锌含量（ZnCl₂）2.5ppm，硼含量（H₃BO₃）6ppm，维生素c0.2%，余量为水。

（4）10d后向其中一个处理池中添加降菲节杆菌CGMCC No.6581菌液添加量为0.5wt%（以污染土壤的原油含量为100%计），另一处理池不添加节杆菌仍继续培养，两个处理池均继续采用旋耕机混匀，每天进行翻土通风和浇水，增加供氧量，保持水分30-40%。

（5）继续培养15d后再按照比例向各处理池中分别添加土著菌菌液、节杆菌菌液和营养液，添加量为各处理池首次加量的1/2，定期翻耕浇水。

（6）定期检测含油率、原油组分及微生物活动状况，加强过程监测和控制。

按照上述方法对含油污泥进行生物处理试验，总共经过40d的处理后，测定各处理池中对照池中含油率，并采用气质联用仪对试验前后样品进行原油油组分分析，结果记录于下表1。

表1含油污泥各组分降解率

实施例3含油污泥微生物原位修复处理

本实施例中，所用降菲节杆菌CGMCC No.6581的富集驯化、活化参见实施例1，菌种经活化并初级扩大培养后再接种至MS液体培养基中扩大培养至1×10⁸～10¹⁰cfu.ml^-1用于现场修复。本实施例所用营养液配方同实施例1中所用营养液配方。本实施例利用所述降菲菌对含油污泥进行原位修复处理的具体操作如下：

在长庆油田陇东油区城壕作业区含油污泥堆放点建立20*10*0.5m³（长*宽*高）含油污泥生物处理单元，将钻井、试油、压裂、洗井、检修等作业收集的石油污染土壤60m³至于处理单元中，分拣出砖瓦、石块、杂草和塑料等杂物，并采用旋耕机将油泥反复破碎至粒径小于10mm。

分析石油污染土壤的含油量、原油组分及含量、碳氮磷的含量，确定菌剂和营养物质添加量。此次含油污泥生物处理单元油泥初始含油率为12.27%，向其中添加降菲节杆菌菌液，添加量为含油量的0.1%；并添加尿素和过磷酸钙使土壤中C:N:P=100:8.1:0.33，营养液添加量为0.0006wt%，锯末添加3%，表面活性剂吐温-80添加量为0.6%，采用旋耕机将加入的物质及大块油泥破碎混匀；每天进行翻土通风和浇水，增加供氧量，保持水分30-40%。

处理15d后再按照比例添加降菲节杆菌菌液和营养液，添加量为首次加量的1/2，继续定期翻耕浇水。并定期检测含油率、原油组分及微生物活动状况，加强过程监测和控制。

本实施例的现场应用试验表明，对陇东油田井场60m³含油污泥经过42d生物处理，含油污泥的含油率由12.27%下降至0.43%。采用气质联用仪对试验前后样品进行原油油组分分析，结果显示42d处理后的烷烃几乎全部降解，菲含量从1.96%降至为0。处理过程中含油污泥各组分的降解数据参见下表2。

表2含油污泥各组分降解率

以上实验表明，本发明的节杆菌CGMCC NO.6581可有效应用于石油污染土壤的生物降解处理，特别是对菲类物质具有显著的降解效果。

Claims

1.一种降解菲的节杆菌菌株(Arthrobacter sp.)，其保藏编号为CGMCC No.6581。

2.一种降解菲的节杆菌菌制剂，该降解菲的节杆菌菌制剂中含有保藏编号为CGMCCNo.6581的降解菲的节杆菌菌株，该菌制剂为固态或液态菌制剂。

3.权利要求1所述的降解菲的节杆菌菌株或权利要求2所述的降解菲的节杆菌菌制剂在降解多环芳烃菲、萘、蒽中的应用。

4.权利要求1所述的降解菲的节杆菌菌株或权利要求2所述的降解菲的节杆菌菌制剂在修复石油污染土壤中的应用。

5.一种石油污染土壤原位修复方法，该方法包括加入权利要求1所述的降解菲的节杆菌菌株或权利要求2所述的降解菲的节杆菌菌制剂到土壤中，进行培养，从而降解土壤中的污染物。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，是将包括所述降解菲的节杆菌的菌液加入到污染土壤中，以污染土壤的原油含量为100％计，包括所述降解菲的节杆菌的菌液的添加量为0.5wt％～1.5wt％，菌液浓度为1.0×10⁸～10¹⁰CFU/ml。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，所述土壤中还加入了土著菌菌液，与所述降解菲的节杆菌共同培养，以污染土壤的原油含量为100％计，土著菌菌液添加量为2wt％～5wt％，菌液浓度为1.0×10⁸～10¹⁰CFU/ml；所述土著菌选自铜绿假单胞菌、巨大芽孢杆菌、鲁菲不动杆菌、黄色类诺卡氏菌和黄绿链霉菌中的一种或多种。

8.根据权利要求5或6所述的方法，其中，还向土壤中加入了营养液以培养所述降解菲的节杆菌，所述营养液配方：

锰含量：25ppm；

钴含量：35ppm；

镍含量：2ppm；

钼含量：2ppm；

铁含量：1ppm；

铜含量：0.5ppm；

锌含量：2.5ppm；

硼含量：6ppm；

维生素c：0.2wt％。