CN103555612B

CN103555612B - 一种微黄分支杆菌及其在降解石油组分多环芳烃中的应用

Info

Publication number: CN103555612B
Application number: CN201310479232.5A
Authority: CN
Inventors: 党志; 伍凤姬; 郭楚玲; 邓辅财; 卢桂宁; 杨琛; 易晓筠
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2013-10-14
Filing date: 2013-10-14
Publication date: 2015-06-03
Anticipated expiration: 2033-10-14
Also published as: CN103555612A

Abstract

本发明公开了一种微黄分支杆菌及其在降解石油组分多环芳烃中的应用，该菌为微黄分支杆菌（Mycobacterium gilvum）CP13，于2013年7月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.7963。该菌株在pH为7.0～10.0、温度为30～35℃，150r/min振荡培养7天，对初始浓度为50mg/L的芘降解率可达88％以上。该菌对荧蒽、菲、蒽、芴、苊、萘等多环芳烃也具有很强的降解能力，可用于石油污染水体和土壤的生物修复及含多环芳烃工业废水的生物处理。

Description

一种微黄分支杆菌及其在降解石油组分多环芳烃中的应用

技术领域

本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一种降解石油组分多环芳烃的菌株及其在废水生物处理和环境污染修复中的应用。

背景技术

石油是一种含有多种烃类（正烷烃、支链烷烃、芳烃、脂环烃）及少量其他有机物（硫化物、氮化物、环烷酸类等）的复杂混合物。随着石油开采和使用量的增加，大量的石油及其加工品进入环境，在其开采、运输、炼制和使用过程中不可避免的对环境造成了污染。石油及石油产品中普遍含有PAHs(多环芳烃)和酚类等有毒物质，PAHs具有生物积累性和环境持久性，并且有致癌、致畸、致突变（三致）作用，对自然界生物安全和人类健康构成巨大威胁。美国环保局（USEPA）在上个世纪八十年代就将16种未带分支的PAHs列入了环境优先污染物的黑名单。

在污染环境中比较常见、难以降解、浓度较高的多为含有3～4个苯环的多环芳烃，其中芘尤其难以降解，芘是多环芳烃四个苯环的代表物。利用微生物处理法解决环境中的PAHs污染问题已被广泛接受，其优点在于效果好、费用低、二次污染少等，是一类低耗高效和环境安全的生物修复技术，而筛选分离高效降解PAHs的微生物菌株是该项技术的关键环节。

目前，人们通过人工富集培养等技术，已经分离得到很多能降解或转化某种多环芳烃的细菌、真菌、放线菌、藻类等，其中细菌由于在生化上的多种适应能力以及容易诱发突变菌种从而占据了主要地位。然而，目前所获得的微生物中，能够对于四环以上的多环芳烃，如芘，具有高效降解效果的并不多。因此，寻找高效降解菌株是目前污染环境治理和修复研究的热点问题之一。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有降解石油组分中多环芳烃存在的难题，提供一种能高效降解多环芳烃的菌株。

本发明的另一个目的是提供上述菌株在废水生物处理和环境污染修复中用于降解多环芳烃的应用。

本发明所提供的微黄分支杆菌（Mycobacterium gilvum）CP13，于2013年7月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.7963。所述微黄分支杆菌CP13的形态为：菌落光滑、球型，边缘平整，呈橘黄色，属革兰氏阳性菌，电子显微镜下观察该菌体的形态为短杆状。

该高效降解菌株CP13来源于广东省韶关市韶钢焦化厂焦化废水处理工艺中好氧池中的活性污泥，经人工富集培养、分离纯化得到，菌株CP13的16SrDNA在GeneBank的登录号为KF378755。所述微黄分支杆菌可在降解石油组分多环芳烃中的应用。

所述多环芳烃包括芘、荧蒽、菲、蒽、芴、苊、萘。

所述菌株的培养液为含多环芳烃的MSM培养液。所述MSM培养液的配方为：100mg/L(NH₄)₂SO₄，20mg/L MgSO₄·7H₂O，10mg/L CaCl₂·2H₂O；微量元素：1.2mg/L FeSO₄·7H₂O，0.3mg/L MnSO₄·H₂O，0.3mg/L ZnSO₄·7H₂O，0.1mg/L CoSO₄·7H₂O，0.1mg/L(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O；磷酸盐缓冲溶液：2.5g/LK₂HPO₃，0.77g/L KH₂PO₃，pH值为7.2～7.4。

所述多环芳烃的初始浓度小于75mg/L。

所述多环芳烃的初始浓度为50mg/L。

所述微黄分支杆菌CP13降解多环芳烃的温度为30～35℃。

所述微黄分支杆菌CP13降解多环芳烃的pH值≥7。

所述pH值为8.0～9.0。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明菌株CP13在pH为7.0～10.0、温度为30～35℃，150r/min振荡培养7天，对初始浓度为50mg/L的芘降解率可达88％以上。该菌对荧蒽、菲、蒽、芴、苊、萘等多环芳烃也具有很强的降解能力，可用于石油污染水体和土壤的生物修复及含多环芳烃工业废水的生物处理。

附图说明

图1是菌株CP13的形态观察图，其中，A为平板菌落形态，B为扫描电镜图。

图2为菌株CP13对芘的降解曲线图。

图3为芘初始浓度对菌株CP13降解率的影响图。

图4为温度对菌株CP13降解率的影响图。

图5为pH对菌株CP13降解率的影响图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

实施例1

Mycobacterium gilvum CP13的分离与降解芘的性能

现场采集韶关市韶钢焦化厂焦化废水处理工艺中好氧池中的活性污泥，采用以芘为唯一碳源的纯无机盐体系驯化芘降解菌，芘的初始浓度保持50mg/L。无机盐培养液(MSM)成分：100mg/L(NH₄)₂SO₄，20mg/L MgSO₄·7H₂O，10mg/LCaCl₂·2H₂O；微量元素：1.2mg/L FeSO₄·7H₂O，0.3mg/L MnSO₄·H₂O，0.3mg/LZnSO₄·7H₂O，0.1mg/L CoSO₄·7H₂O，0.1mg/L(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O；磷酸盐缓冲溶液：2.5g/L K₂HPO₃，0.77g/L KH₂PO₃，pH值为7.2～7.4。经转接5代反复驯化后，富集培养液在含芘的固体无机盐培养基表面上进行涂布，待菌落长好后，选择具有透明圈且形态特征不同的菌落，在营养肉汤(NB)固体培养基中划线纯化培养，得到多株纯菌，纯菌进一步接种至含芘的MSM培养液中检验其降解芘的能力，最后获得一株芘的高效降解菌CP13。平板观察该菌落的形态（如图1A所示），其呈橘黄色，球形，边缘平整，菌落表面光滑湿润。电子显微镜下观察该菌体的形态为短杆状（如图1B所示），大小约为1.03×0.34μm。经16S rDNA测序（北京六合华大基因科技股份有限公司），得到的序列参见SEQ NO.1。

通过NCBI BLAST比对，其与微黄分支杆菌属（Mycobacterium gilvum）相似同源性达99%，因此推定该菌为微黄分支杆菌，其GeneBank的登录号为KF378755，并于2013年7月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7963。

用MSM培养液将菌株CP13配制成菌悬液并调节OD₆₀₀至0.5，按10%（V/V）的比例将该菌悬液接种至含芘50mg/L的MSM培养基中，在150r/min、30℃摇床中避光振荡培养，在第1、2、3、4、5、6、7天的同一时间分别取样测定培养液中芘的剩余量，实验结果见图2。在培养初期，CP13对芘的降解效率较低；从第4天开始，CP13对芘的降解作用迅速增强，到第6天时，CP13对芘的降解率达88.91%，到第7天，摇瓶中的芘几乎被完全降解，降解率达96.62%。

本实施例说明分离驯化所得到的降解菌CP13可利用多环芳烃芘作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，并且具有高效降解芘的能力。

实施例2

芘初始浓度对菌株CP13降解芘的影响

用MSM培养液将菌株CP13配制成菌悬液并调节OD₆₀₀至0.5，按10%（V/V）的比例将该菌悬液接种至芘浓度分别为25、50、75、100和150mg/L的MSM培养液中，pH=7.2～7.4，以不含有菌株CP13的含芘MSM培养液为空白，在150r/min、30℃摇床中避光振荡培养7天后测定培养液中芘的剩余量。由图3可知，菌株CP13对各芘初始浓度的降解率分别为95.40%、96.79%、92.79%、84.99%和68.94%。菌株CP13对芘初始浓度小于75mg/L的降解效率都在90%以上，其最佳初始浓度为50mg/L。但是当芘的初始浓度增加到100mg/L时，残留芘的浓度便显著增加。当芘浓度达到150mg/L时，其降解效能受到一定的抑制，这可能是因为高浓度芘在降解过程中积累了某种有害的中间产物，对微生物产生了一定的毒害作用。上述多环芳烃的降解率已扣除空白中的少量挥发，所得的降解率仅仅是微生物对多环芳烃的降解率。

本实施例说明菌株CP13可在较宽的浓度范围内（25～75mg/L）较好地降解多环芳烃芘，为多环芳烃污染环境的生物修复提供了保证。

实施例3

温度对菌株CP13降解芘的影响

用MSM培养液将菌株CP13配制成菌悬液并调节OD₆₀₀至0.5，按10%（V/V）的比例将该菌悬液接种至芘浓度50mg/L的MSM培养液中，pH=7.2～7.4，以不含有菌株CP13的含芘MSM培养液为空白，分别置于25、30、35、40、45℃的摇床中，在150r/min条件下避光振荡培养7天后测定培养液中芘的剩余量。如图4所示，菌株CP13在30～35℃时对芘有很好的降解效果，降解率均在88%以上，其最适宜温度为35℃，降解率达92.63%。当温度低于30℃时或高于35℃时，芘的降解率显著下降，这可能由于低温或高温对微生物的生长有抑制作用。

本实施例说明菌株CP13在中温范围内能较好的降解芘，为其在实际环境温度中的应用提供了基础和保证。

实施例4

pH值对菌株CP13降解芘的影响

研究了在pH值为5～10条件下对菌株CP13降解芘的影响，用MSM培养液将菌株CP13配制成菌悬液并调节OD₆₀₀至0.5，按10%（V/V）的比例将该菌悬液接种至芘浓度50mg/L的MSM培养液中，以不含有菌株CP13的含芘MSM培养液为空白，置于35℃的摇床中，在150r/min条件下避光振荡培养7天后测定培养液中芘的剩余量。由图5可知，CP13在pH5～6酸性条件下生长受到一定抑制，导致芘降解率偏低。当pH值≥7时，CP13对芘具有良好的降解效果，其中pH值为8.0～9.0时，CP13对芘的降解效果最佳，达95%以上，说明碱性条件可促进CP13对芘的降解。

本实施例说明菌系CP13在中性和碱性的较宽pH范围内均能较好的降解芘，为其在不同pH环境中的应用提供了保证。

实施例5

菌株CP13对其他多环芳烃的降解效果

将CP13菌液按10%（V/V）的比例分别接种至含荧蒽、菲、蒽、芴、苊、萘（各浓度为5mg/L）等6种PAHs的MSM培养液中，以不含有菌株CP13的含多环芳烃的MSM培养液为空白，置于30℃的摇床中，在150r/min条件下避光振荡培养3天后测定培养液中各种PAHs的剩余量。结果显示，6种多环芳烃的剩余量均为0，菌株CP13在3天内能完全去除这6种多环芳烃。说明菌株CP13对四环及四环以下的多环芳烃都有很好的降解效果。

本实施例说明菌株CP13对多种多环芳烃具有很好的降解效果，为其降解石油组分中多环芳烃的应用提供了保证。

Claims

1.一种微黄分支杆菌，其特征在于，该菌为微黄分支杆菌（Mycobacteriumgilvum）CP13，于2013年7月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.7963。

2.权利要求1所述微黄分支杆菌在降解石油组分多环芳烃中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述多环芳烃包括芘、荧蒽、菲、蒽、芴、苊、萘。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述菌株的培养液为含多环芳烃的MSM培养液。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述多环芳烃的初始浓度小于75mg/L。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述多环芳烃的初始浓度为50mg/L。

7.根据权利要求2或3或4或5或6所述的应用，其特征在于，所述微黄分支杆菌CP13降解多环芳烃的温度为30～35℃。

8.根据权利要求2或3或4或5或6所述的应用，其特征在于，所述微黄分支杆菌CP13降解多环芳烃的pH值为7.0～10.0。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述pH值为8.0～9.0。

10.根据权利要求2或3或4或5或6所述的应用，其特征在于，所述MSM培养液的配方为：100mg/L(NH₄)₂SO₄，20mg/L MgSO₄·7H₂O，10mg/LCaCl₂·2H₂O；微量元素：1.2mg/L FeSO₄·7H₂O，0.3mg/L MnSO₄·H₂O，0.3mg/LZnSO₄·7H₂O，0.1mg/L CoSO₄·7H₂O，0.1mg/L(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O；磷酸盐缓冲溶液：2.5g/L K₂HPO₃，0.77g/L KH₂PO₃，pH值为7.2～7.4。