CN107502366A - 一种复合微生物制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种复合微生物制剂，本发明属于土壤修复技术领域，具体涉及一种用于修复多环芳烃类污染土壤的复合微生物制剂。本发明中的微生物制剂包含不同菌种微生物，具有修复土壤生态系统和降解多环芳烃的双重功效。本发明提供的复合微生物制剂还包括土壤调理剂，土壤调理剂可提高土壤的渗透性，增加土壤中氧气的传输量，从而快速建立健康的微生物种群结构。此外，本发明的复合微生物菌制剂为干粉，易于储存和活化，保质期长。微生物菌种对土壤进行处理，不产生二次污染，作用条件温和。

Description

一种复合微生物制剂
技术领域
本发明属于土壤修复技术领域，具体涉及一种用于修复多环芳烃类污染土壤的复合微生物制剂。
背景技术
据2014年国家环境保护部和国土资源部联合公布的《全国土壤污染调查公报》显示，全国土壤总的超标率为16.1％，其中耕地土壤点位超标率高达19.4％；在调查的重污染企业用地和工业废弃地点位中，超标率分别高达36.3％和34.9％。其中有机污染物主要有六六六、滴滴涕、多环芳烃以及来源于化工厂、采油区、工业区、氮肥厂、电子厂、焦化厂、农药厂等的废弃物。无机污染物主要有镉、铅、砷等重金属元素；另外耕种过程中过度施用化肥、农药、固体废弃物等都不同程度地造成了土壤污染。
多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是由2个或2个以上苯环以线状、角状或簇状排列组合成的一类稠环化合物。PAHs水溶性差、辛醇-水分配系数高、稳定性强，因此容易吸附于土壤颗粒上及积累于生物体内。同时随着苯环数量的增加以及由线性排列向非线性排列的转变，PAHs的疏水性、亲脂性及其稳定性越来越强，同时其危害性也随之增大。PAHs的危害表现主要为强致癌性、致突变性及致畸性、对微生物生长有强抑制作用以及光致毒效应。
我国土壤修复技术经历3个阶段：第1阶段土壤治理方式为物理修复，主要是土地资源的稳定利用，相关基本环境工程的配套。第2阶段主要修复技术是土地复垦。第3阶段土壤治理方式为物理、化学和生物恢复，修复技术主要采用微生物、植物、动物、固化/稳定化、土壤气提、化学氧化还原、热脱附、淋洗、化学萃取等，其中以微生物修复、植物修复、微生物-植物联合修复为研发应用重点。
本发明提供了一种用于修复多环芳烃类污染土壤的新型复合微生物制剂，修复效果好、作用条件温和、不引入新的污染并且可修复土壤微生物种群。
发明内容
本发明目的在于提供了一种用于修复多环芳烃类污染土壤的新型复合微生物制剂。
为实现上述目的，本发明提供一种复合微生物制剂，其特征在于，包括：
组分A：土壤调理剂
组分B：微生物混合菌剂
所述复合微生物制剂能够降解多环芳烃。
进一步地，所述土壤调理剂包括牡蛎壳细粉、秸秆生物质焦、磷矿粉、加氨污泥，份腐熟剂，石膏粉，微生物混合菌剂包括鞘氨醇单胞菌，微小杆菌，苍白杆菌，洋葱伯克氏菌，假单胞菌，赤红球菌，微黄分支杆菌，地衣形芽孢杆菌，根瘤菌属，短波单胞菌属。
更进一步地，所述复合微生物制剂按重量份的组分包括：牡蛎壳细粉35份、秸秆生物质焦15份、磷矿粉14份、加氨污泥25份，腐熟剂0.1～0.2份，石膏粉3～6份，鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)干粉0.1份，微小杆菌(Exiguobacterium sp.)干粉0.1份，苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)干粉0.1份，洋葱伯克氏菌(Burkholderiacepacia sp.)干粉0.1份，假单胞菌(Pseudomonadaceae sp.)干粉0.1份，赤红球菌(Rhodococcusruber sp.)干粉0.1份，微黄分支杆菌(Mycobacterium gilvum sp.)干粉0.1份，地衣形芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis sp.)干粉0.1份，根瘤菌属(Mesorhizobium sp.)干粉0.1份，短波单胞菌属(Brevundimonas sp.)，所述复合微生物制剂能够降解环境中的多环芳烃污染。
优选地，所述环境包括但不限于水环境、土壤环境、大气环境。
进一步地，所述多环芳烃包括但不限于萘、芴、菲或苯并芘。
更进一步地，所述多环芳烃为苯并芘。
优选地，所述石膏粉为磷石膏粉、脱硫石膏粉、柠檬酸石膏粉或氟石膏粉。
本发明术语“多环芳烃”是指是煤，石油，木材，烟草，有机高分子化合物等有机物不完全燃烧时产生的挥发性碳氢化合物，是重要的环境和食品污染物。迄今已发现有200多种PAHs,其中有相当部分具有致癌性，如苯并芘，苯并蒽等。PAHs广泛分布于环境中，可以在我们生活的每一个角落发现，任何有有机物加工，废弃，燃烧或使用的地方都有可能产生多环芳烃。
本发明术语“优势菌种”是指对某种特定的污染物或者特定的某种废水具有较高的去除降解效果的细菌、真菌、酵母菌、藻类等微生物。这些具有某种特定降解能力的微生物可以被污染的水、土壤或驯化好的污泥中分离、纯化而得到，或通过基因手段改造微生物以使之具有特定的降解能力。高效优势菌种在特定的污染环境中能够存活，它们即使不能利用污水中的污染成分做养分来源，对环境也有一定的耐受能力。
大多数环境中都存在着能够降解有毒有害污染物的天然微生物(土著微生物)，但由于营养盐缺乏、溶解氧不足，能高效降解的微生物生长缓慢甚至不生长等因素，往往自然净化过程极为缓慢。土壤的微生物修复技术就是基于这一情况，通过提供氧气、添加营养盐、提供电子受体、接种经驯化培养具有高效降解作用的微生物等方法加强土壤自净过程。微生物修复与传统的分解不同的是它有分解作用所没有的新特征(如共代谢作用、降解质粒等)，因此可视为是分解作用的扩展和延伸。由于微生物个体小、繁殖快、适应性强、易变异，所以可随环境变化产生新的自发突变株，也可能通过形成诱导酶产生新的酶系，具备新的代谢功能以适应新的环境，从而降解和转化那些陌生的化合物.
联合修复技术就是协同两种或两种以上修复方法，克服单项修复技术的局限性,实现对多种污染物的同时处理和对复合污染土壤的修复,提高污染土壤的修复速率与效率，该方法已成为土壤修复技术中的重要研究内容。
本发明的有益效果是：
1、本发明提供了一种用于修复多环芳烃类污染土壤的新型复合微生物制剂，修复效果好、作用条件温和、不引入新的污染。
2、本发明提供的复合微生物制剂还包括土壤调理剂，土壤调理剂可提高土壤的渗透性，增加土壤中氧气的传输量，从而快速建立健康的微生物种群结构。
附图说明
图1为土著菌群处理的样品中苯并芘降解量，横坐标为时间，纵坐标为苯并芘浓度；
图2为优势菌复合制剂处理的样品中的苯并芘降解量，横坐标为时间，纵坐标为苯并芘浓度；
图3为复合微生物制剂处理的样品中的苯并芘降解量，横坐标为时间，纵坐标为苯并芘浓度。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1：降解苯并芘的微生物菌群的富集
土样来自受多环芳烃污染的区域，采样采取五点法取样方式进行，每点取样200g，共计取样1000g，混匀待检测。
配置苯并芘无机盐培养基：分别以丙酮配制10g/L的苯并芘溶液，0.25mm滤膜除菌，量取一定量的苯并芘溶液置于灭菌三角瓶中，待丙酮挥发完毕后加入适量灭菌的无机盐基础培养基，使得苯并芘终浓度为1500mg/L。
取6个三角瓶，每个三角瓶放置含有苯并芘的液体无机盐培养基150ml，取上述三角瓶5个(A1-A5)，每瓶加入1g土样，另1个三角瓶加入灭菌水1g，作为对照(CK1)，上述三角瓶中各加入灭菌玻璃珠15粒，在28摄氏度，100r/min转速下摇床培养7天，按20％接种量转接到另一苯并芘培养基中继续培养5天。五天中每隔24小时测定样品OD600值及苯并芘含量，以加入灭菌水的培养基的苯并芘含量作为对照，选取含有优势降解均系的三角瓶两个。苯并芘含量测定结果如表1所示，示意图见图1。
表1苯并芘降解量
实施例2：降解苯并芘的微生物菌群的分离、鉴定、获得
从表1结果可以看出，A2和A4培养液中含有降解苯并芘的优势菌群，吸取0.1ml上述A2和A4培养液，按一定比例稀释，涂布于含有苯并芘的无机盐固体培养基上，挑取特征不同的单菌落，纯化后分别接种到含有苯并芘的无机固体盐培养基上，培养并选取生长速度较快的菌株，碱裂解法小提16S rDNA并进行16S rDNA序列分析(序列分析由上海美吉生物医药科技有限公司完成)，对测序结果进行BLAST比对，获得高降解苯并芘的菌株15种，菌株名称如表2所示。
表2苯并芘降解菌菌株名称
购买上述菌株(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，经活化培养后获得大量菌体，具体步骤如下：
步骤2.1在无菌操作下，用无菌微量吸管，从已溶解的管中吸取50μL(或1-2滴)的菌液，滴入固态指定培养基(培养基编号及温度示于菌株订购单)某一边缘附近，以划线法接种于培养基。
步骤2.2将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养。
步骤2.3在无菌环境下，以沾有75％酒精的棉花擦拭外管，在火焰上加热外管之尖端。滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，再以硬棒敲破尖端。取出隔热纤维纸和内管，以灭菌过的镊子取出内管的棉塞。
步骤2.4适用于细菌用无菌吸管，吸取0.3-0.5ml指定之液体培养基，滴入内管内，并轻微震荡(可用该吸管协助)，直到均匀悬浮。适用于霉菌、酵母菌用无菌吸管，吸取0.3-0.5ml无菌水，滴入内管内，待干燥粉末溶解后，以无菌吸管吸取并滴入约含有5ml无菌水之试管内，轻微震荡使其均匀后，静置30至60分钟。
步骤2.5取0.1-0.2ml之菌体悬浮液于指定的平板培养基上，做划线分离培养或做成一系列之稀释，用无菌L型玻棒均匀涂抹，以检验菌种之纯度及活化情形，而剩余的菌体则全部移入指定的液体培养基内，并依指定的温度培养之。
步骤2.6某些菌种经过冷冻干燥保存后，迟滞期较长，必须等培养二倍时间后才能长出，且再经过一、二次继代培养后才能正常生长。经过以上的努力后仍培养失败，才视为不能活化。
取编号1-10的菌株按照等比例质量份数(各1g)复配加入到150ml苯并芘无机盐液体培养基中(实验组B1)；取编号5-15的菌株按照等比例质量份数(各1g)复配加入到150ml苯并芘无机盐液体培养基中(实验组B2)；取编号1-5和10-15的菌株按照等比例质量份数(各1g)复配加入到150ml苯并芘无机盐液体培养基中(实验组B3)，取另外一个三角瓶加入灭菌水10g作为对照(CK2)，每个三角瓶中加入灭菌玻璃珠15粒，在28摄氏度，100r/min转速下摇床培养7天，按20％接种量转接到另一苯并芘培养基中继续培养5天。五天中每隔24小时测定样品OD600值及苯并芘含量，加入灭菌水的培养基的苯并芘含量作为对照，苯并芘含量测定结果如表3所示，示意图见图2。
表3苯并芘降解量
由表3结果可知，实验组B2对苯并芘的降解效果最好，实验组B1对苯并芘的降解效果次之，而实验组B3对苯并芘相较于土壤本底菌群较差，说明实验组B3中的菌群在降解苯并芘的过程中存在拮抗反应。
实施例3：
土壤调理剂能够打破土壤板结、疏松土壤、提高土壤透气性、降低土壤容重，促进土壤微生物活性、增强土壤肥水渗透力；具有改良土壤，增强农作物抗病能力，提高农作物产量，改善农产品品质，恢复农作物原生态等功能。本发明提供的土壤调理剂主要用于提高土壤的渗透性，增加土壤中氧气的传输量，从而快速建立健康的微生物种群结构。
本发明提供的复合微生物制剂按重量份的组分包括
组分A(土壤调理剂)：牡蛎壳细粉35份、秸秆生物质焦15份、磷矿粉14份、加氨污泥25，份腐熟剂0.1～0.2份，石膏粉3～6份；
组分B(微生物混合菌剂)：鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)干粉0.1份，微小杆菌(Exiguobacterium sp.)干粉0.1份，苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)干粉0.1份，洋葱伯克氏菌(Burkholderiacepacia sp.)干粉0.1份，假单胞菌(Pseudomonadaceae sp.)干粉0.1份，赤红球菌(Rhodococcusruber sp.)干粉0.1份，微黄分支杆菌(Mycobacterium gilvumsp.)干粉0.1份，地衣形芽孢杆菌(Bacillus licheniformis sp.)干粉0.1份，根瘤菌属(Mesorhizobium sp.)干粉0.1份，短波单胞菌属(Brevundimonas sp.)。制作成用于降解土壤中苯并芘的复合微生物菌剂。
取污染土壤200g置于1000ml烧杯中，与10g上述复合微生物菌剂混匀，设置三组平行实验(C1，C2，C3),取污染土壤200g，与10g上述组分A混匀(C4)，取污染土壤200g，与10g上述组分B混匀(C5)，取污染土壤210g，作为对照(CK3)。上述烧杯放置于室外环境下，每隔5天取混合土样10g，用二氯甲烷萃取，PENELSON高效液相色谱仪(配有紫外检测器)测定含量，流动相：甲醇/水＝9：1，流速0.7ml/min，进样量20ml，测定时间20min，测定波长240nm。复合微生物菌剂对土壤中苯并芘的降解量测定结果详见表4及图3。
表4复合微生物菌剂对土壤中苯并芘的降解效果
从表3结果可见，复合微生物菌剂对苯并芘污染的土壤有较强的降解效果，单独加入土壤调理剂的实验组表现出较弱的降解效果，推测该降解效果是因为土壤调理剂的吸附作用以及室外环境的挥发，单独加入微生物复合菌剂的实验组对苯并芘污染的土壤表现出了良好的降解效果，随然降解量低于复合微生物菌剂但是显著高于对照组。
综上，本发明提供的微生物菌剂对苯并芘污染土壤的修复效果好、作用条件温和、不引入新的污染。与土壤调理剂配合使用，可提高土壤的渗透性，增加土壤中氧气的传输量，从而快速建立健康的微生物种群结构，高效、快速、无二次污染降解污染土壤中的苯并芘。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (7)

1.一种复合微生物制剂，其特征在于，包括：
组分A：土壤调理剂
组分B：微生物混合菌剂
所述复合微生物制剂能够降解多环芳烃。
2.根据权利要求1所述复合微生物制剂，其特征在于，所述土壤调理剂包括牡蛎壳细粉、秸秆生物质焦、磷矿粉、加氨污泥，份腐熟剂，石膏粉，微生物混合菌剂包括鞘氨醇单胞菌，微小杆菌，苍白杆菌，洋葱伯克氏菌，假单胞菌，赤红球菌，微黄分支杆菌，地衣形芽孢杆菌，根瘤菌，短波单胞菌。
3.根据权利要求1或2任一所述复合微生物制剂，其特征在于，所述复合微生物制剂按重量份的组分包括：牡蛎壳细粉35份、秸秆生物质焦15份、磷矿粉14份、加氨污泥25份，腐熟剂0.1～0.2份，石膏粉3～6份，鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.干粉0.1份，微小杆菌Exiguobacterium sp.干粉0.1份，苍白杆菌Ochrobactrum sp.干粉0.1份，洋葱伯克氏菌Burkholderiacepacia sp.干粉0.1份，假单胞菌Pseudomonadaceae sp.干粉0.1份，赤红球菌Rhodococcusruber sp.干粉0.1份，微黄分支杆菌Mycobacterium gilvum sp.干粉0.1份，地衣形芽孢杆菌Bacillus licheniformis sp.干粉0.1份，根瘤菌Mesorhizobium sp.干粉0.1份，短波单胞菌Brevundimonas sp.，所述复合微生物制剂能够降解环境中的多环芳烃污染。
4.根据权利要求3所述复合微生物制剂，其特征在于，所述环境包括但不限于水环境、土壤环境、大气环境。
5.根据权利要求1-4任一所述复合微生物制剂，其特征在于，所述多环芳烃包括但不限于萘、芴、菲或苯并芘。
6.根据权利要求5所述复合微生物制剂，其特征在于，所述多环芳烃为苯并芘。
7.根据权利要求3所述复合微生物制剂，其特征在于，所述石膏粉为磷石膏粉、脱硫石膏粉、柠檬酸石膏粉或氟石膏粉。
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