CN101851582A - 去除多环芳烃和/或降解多环芳烃的菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种去除多环芳烃和/或降解多环芳烃的菌剂及其应用。本发明提供了一种菌剂，它的活性成分为红球菌(Rhodococcus sp.)LU3 CGMCC No.3610、微杆菌(Microbacterium sp.)LU1 CGMCC No.3581、苍白杆菌(Ochrobacterium sp.)LU2CGMCC No.3582和博德特氏菌(Bordetella sp.)LU4 CGMCC No.3611。本发明的实验显示：4周后，添加该菌剂的土壤中16种多环芳烃的去除率比未添加该菌剂的土壤中的平均提高了30％，其中6种低环(二/三环)多环芳烃的去除率平均提高了26％，10种中高环(四环及以上)多环芳烃的去除率平均提高了32％。

Description

去除多环芳烃和/或降解多环芳烃的菌剂及其应用

技术领域

本发明涉及生物领域的一种去除多环芳烃和/或降解多环芳烃的菌剂及其应用。

背景技术

森林和草原火灾、火山爆发及微生物的内源合成等均会产生多环芳烃，未开采的煤、石油中也含有大量的多环芳烃。随着工业生产的发展，多环芳烃大大地增加，每年因人类的活动会有成千上万吨的多环芳烃释放到地球环境系统中，远远超过了环境的自净能力。多环芳烃最突出的特性是具有强致癌性、致畸性及致突变性。多环芳烃具有较高的亲脂性，可以通过食物链进入人体，对人类健康和生态环境具有很大的潜在危害，已引起各国环境科学家的极大重视。

研究发现自然界中多种微生物能够降解多环芳烃，但是由于多环芳烃性质稳定，且为强疏水性物质，易被土壤颗粒吸附或被其它作用固定，隔断了其与专性微生物和酶的直接接触，影响其降解速率，因此，加快降解环境中的多环芳烃成为新的研究热点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种去除多环芳烃和/或降解多环芳烃的菌剂及其应用。

本发明提供的去除多环芳烃和/或降解多环芳烃的菌剂，它的活性成分为红球菌(Rhodococcus sp.)LU3 CGMCC No.3610、微杆菌(Microbacterium sp.)LU1 CGMCCNo.3581、苍白杆菌(Ochrobacterium sp.)LU2 CGMCC No.3582和博德特氏菌(Bordetella sp.)LU4 CGMCC No.3611。

本发明的微杆菌(Microbacterium sp.)LU1 CGMCC No.3581和苍白杆菌(Ochrobacterium sp.)LU2 CGMCC No.3582于2010年1月18日保藏，红球菌(Rhodococcus sp.)LU3 CGMCC No.3610和博德特氏菌(Bordetella sp.)LU 4CGMCCNo.3611于2010年1月26日保藏，这四株菌均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。

该菌剂中，所述红球菌(Rhodococcus sp.)LU3 CGMCC No.3610、微杆菌(Microbacterium sp.)LU1 CGMCC No.3581、苍白杆菌(Ochrobacterium sp.)LU2CGMCC No.3582和博德特氏菌(Bordetella sp.)LU4 CGMCC No.3611的集落形成单位数目比可为(1-100)∶(1-100)∶(1-100)∶(1-100)，优选为(1-10)∶(1-10)∶(1-10)∶(1-10)，尤其优选为1∶1∶1∶1。

为了增加多环芳烃在土壤中的生物有效性，在菌剂中可添加表面活性剂使多环芳烃溶解到表面活性剂分子形成的胶束中，从而更易被微生物利用。

所述菌剂中可包括表面活性剂。

上述菌剂可由活性成分和表面活性剂构成。

上述表面活性剂可为非离子表面活性剂，优选为土温80。

所述活性成分和所述表面活性剂的配比可为(1×10⁶CFU-20×10⁶CFU)∶(0.05ml-0.1ml)土温80，优选为15×10⁶CFU∶0.075ml土温80。

所述菌剂的制备方法可包括如下步骤：

1)将红球菌(Rhodococcus sp.)LU3 CGMCC No.3610、微杆菌(Microbacteriumsp.)LU1 CGMCC No.3581、苍白杆菌(Ochrobacterium sp.)LU2 CGMCC No.3582和博德特氏菌(Bordetella sp.)LU4 CGMCC No.3611分别在如下培养基中于30℃进行培养，收集培养容器内的所有物质，将红球菌(Rhodococcus sp.)LU3培养容器内的所有物质称为红球菌(Rhodococcus sp.)LU3发酵物，微杆菌(Microbacterium sp.)LU1培养容器内的所有物质称为微杆菌(Microbacterium sp.)LU1发酵物，苍白杆菌(Ochrobacterium sp.)LU2培养容器内的所有物质称为苍白杆菌(Ochrobacterium sp.)LU2发酵物，博德特氏菌(Bordetella sp.)LU4培养容器内的所有物质称为博德特氏菌(Bordetella sp.)LU4发酵物，将四种发酵物混合获得混合发酵物；

1升所述培养基的组成如下：0.5-1.5g NH₄Cl、0.05-0.15g MgSO₄·7H₂O、0.01-0.1gCaCl₂·2H₂O、0.05-0.15g酵母膏、1.5-2g KH₂PO₄、1.5-2g Na₂HPO₄、0.05-0.15ml维生素混合液、0.5-1.5ml微量金属混合液、以及1.5-2.5ml煤焦油，其余为水；所述维生素混合液的组成为：50-150μg/L对氨基苯酸、10-100μg/L叶酸、50-150μg/L硫辛酸、150-250μg/L烟酸、50-150μg/L维生素B2、150-250μg/L硫胺素、50-150μg/L泛酸、450-550μg/L维生素B6、50-150μg/L维生素B12、以及15-25μg/L生物素，其余为水；所述微量金属混合液的组成为：1.5-2.5mg/L FeSO₄·7H₂O、0.01-0.05mg/LMnCl₂·4H₂O、0.15-0.25mg/L CaCl₂·6H₂O、0.01-0.03mg/L NiCl₂·6H₂O、0.02-0.03mg/LNa₂SeO₃·5H₂O、0.5-1.5mg/L EDTA、0.05-0.15mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.1-0.5mg/L H₃BO₃、0.005-0.015mg/L CuCl₂·2H₂O、0.01-0.05mg/L NaMoO₄·2H₂O、0.01-0.05mg/LNa₂MoO₄·2H₂O和0.15-0.25mg/L CoCl₂·6H₂O，其余为水；

2)再向步骤1)得到的混合发酵物中添加表面活性剂获得菌剂。

上述制备方法的步骤1)中1升所述培养基的组成优选为：1g NH₄Cl、0.1gMgSO₄·7H₂O、0.05g CaCl₂·2H₂O、0.1g酵母膏、1.9g KH₂PO₄、1.7g Na₂HPO₄、0.1ml维生素混合液、1ml微量金属混合液、以及2ml煤焦油，其余为水；所述维生素混合液的组成为：100μg/L对氨基苯酸、50μg/L叶酸、100μg/L硫辛酸、200μg/L烟酸、100μg/L维生素B2、200μg/L硫胺素、100μg/L泛酸、500μg/L维生素B6、100μg/L维生素B12、以及20μg/L生物素，其余为水；所述微量金属混合液的组成为：2.0mg/LFeSO₄·7H₂O、0.03mg/L MnCl₂·4H₂O、0.2mg/LCaCl₂·6H₂O、0.02mg/L NiCl₂·6H₂O、0.026mg/L Na₂SeO₃·5H₂O、1.0mg/L EDTA、0.1mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.3mg/L H₃BO₃、0.01mg/LCuCl₂·2H₂O、0.03mg/L NaMoO₄·2H₂O、0.033mg/L Na₂MoO₄·2H₂O和0.2mg/LCoCl₂·6H₂O，其余为水；

所述培养的条件为：培养温度为30℃，培养转速为300r/min，培养时间为两周。

上述培养为放置在恒温振荡培养箱中培养。

所述红球菌(Rhodococcus sp.)、所述微杆菌(Microbacterium sp.)、所述苍白杆菌(Ochrobacterium sp.)和所述博德特氏菌(Bordetella sp.)的集落形成单位数目比可为(1-100)∶(1-100)∶(1-100)∶(1-100)，优选为(1-10)∶(1-10)∶(1-10)∶(1-10)，尤其优选为1∶1∶1∶1。

步骤2)中的所述表面活性剂为非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂优选为土温80；所述混合发酵物与所述表面活性剂的配比为所述活性成分和所述表面活性剂的配比可为(1×10⁶CFU-20×10⁶CFU)∶(0.05ml-0.1ml)土温80，优选为15×10⁶CFU∶0.075ml土温80。

上述菌剂在去除多环芳烃的应用也是本发明保护的范围，所述多环芳烃选自下述16种中的至少一种：萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并蒽、屈、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、茚并[1，2，3-cd]芘、二苯并蒽和苯并[ghi]苝，所述应用可为去除土壤中的所述多环芳烃。

本发明提供的菌剂去除土壤中的多环芳烃的实验结果显示，4周后，添加该菌剂的土壤中16种多环芳烃(萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并蒽、屈、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、茚并[1，2，3-cd]芘、二苯并蒽、苯并[ghi]苝)的去除率比未添加该菌剂的土壤中的平均提高了30％，其中其中6种低环(二/三环)多环芳烃(萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽)的去除率平均提高了26％，10种中高环(四环及以上)多环芳烃(荧蒽、芘、苯并蒽、屈、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、茚并[1，2，3-cd]芘、二苯并蒽、苯并[ghi]苝)的去除率平均提高了32％。

附图说明

图1为处理组和对照组中16种多环芳烃的去除率。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的浓度如无特殊说明，均为终浓度。

实施例1、多环芳烃微生物降解菌的分离及鉴定

一、分离

取北京焦化厂污染土壤，接种到LB培养基中，常温(25-30℃)培养一周后，分别以美国环保局优先控制的16种不同多环芳烃(萘NAP、苊烯ANY、苊ANE、芴FLE、菲PHE、蒽ANT、荧蒽FLA、芘PYR、苯并蒽BaA、屈CHR、苯并[b]荧蒽BbF、苯并[k]荧蒽BkF、苯并[a]芘BaP、茚并[1，2，3-cd]芘IcdP、二苯并蒽DahA、苯并[ghi]苝BghiP)为唯一碳源，按照平板划线法对土壤中的不同多环芳烃降解菌进行多次分离，得到单菌落。挑取单菌落接种到以相应多环芳烃为唯一碳源的液体培养基中，常温(25-30℃)培养数天后，提取其DNA作为模板，用带GC夹的细菌16S rRNA基因的通用引物为引物进行扩增(F341：5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，R518：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)，通过变性梯度凝胶电泳对产物的纯度进行验证。

二、鉴定

1、分子水平鉴定

将上述通过变性梯度凝胶电泳检测到条带纯的菌的DNA作为模板，用不带GC夹的细菌16S rRNA基因的通用引物为引物进行扩增(F27：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，R 1492：5′-TACGYTACCTTGTTACGACT-3′)，对扩增产物进行基因测序。将测序结果在美国国立生物信息中心的基因库内进行同源序列搜索，确定其种属。其中，编号为LU1、LU2、LU3、LU4的菌株测序结果见序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4，它们对应的种属分别为：微杆菌(Microbacteriumsp.)、苍白杆菌(Ochrobacterium sp.)、红球菌(Rhodococcus sp.)和博德特氏菌(Bordetellasp.)。

2、特征鉴定

研究中发现，同一种菌可以降解不同的多环芳烃，同一多环芳烃可以被不同的菌降解，例如，红球菌既可降解苯并[b]荧蒽，也可降解萘。苯并[b]荧蒽既可被红球菌降解，也可被微杆菌降解。这表明了多环芳烃降解菌的生物多样性和代谢多样性。

观察通过分子鉴定确定种属的上述四株菌的特征，具体如下表1所示。

表1为多环芳烃降解菌的特征

种属	特征
		红球菌(Rhodococcus sp.)LU3	个体形态为球状；菌落呈赤红色，表面光滑，不透明，边缘整齐；革兰氏阳性
微杆菌(Microbacterium sp.)	个体形态为短杆或球状；菌落呈黄色，表面光滑，
		LU1	半透明，边缘整齐，有光泽；革兰氏阳性
苍白杆菌(Ochrobacterium sp.)LU2	个体形态为形态杆状；菌落呈象牙白色，表面光滑，半透明，边缘不整齐，有光泽；革兰氏阴性。
		博德特氏菌(Bordetella sp.)LU4	个体形态为短杆状；菌落呈象牙白色，表面光滑，不透明，边缘不整齐；革兰氏阴性

上述微杆菌(Microbacterium sp.)LU1 CGMCC No.3581和苍白杆菌(Ochrobacterium sp.)LU2 CGMCC No.3582于2010年1月18日保藏，红球菌(Rhodococcus sp.)LU3 CGMCC No.3610和博德特氏菌(Bordetella sp.)LU4 CGMCCNo.3611于2010年1月26日保藏，这四株菌均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。

实施例2、去除多环芳烃和/或降解多环芳烃的菌剂的制备

一、活性成分的制备

将实施例1中获得的微杆菌(Microbacterium sp.)LU1 CGMCC No.3581、苍白杆菌(Ochrobacterium sp.)LU2 CGMCC No.3582、红球菌(Rhodococcus sp.)LU3 CGMCCNo.3610和博德特氏菌(Bordetella sp.)LU4 CGMCC No.3611分别接种到4个装有1L新鲜液体培养基的三角瓶中，培养两周后，分别收集三角瓶中的所有物质，分别称为红球菌(Rhodococcus sp.)LU3发酵物、微杆菌(Microbacterium sp.)LU1发酵物、苍白杆菌(Ochrobacterium sp.)LU2发酵物和博德特氏菌(Bordetella sp.)LU4发酵物。其中，红球菌(Rhodococcus sp.)LU3发酵物中的菌体含量为1×10⁶CFU/ml、微杆菌(Microbacterium sp.)LU1发酵物的菌体含量为1×10⁶CFU/ml、苍白杆菌(Ochrobacterium sp.)LU2发酵物的菌体含量为1×10⁶CFU/ml和博德特氏菌(Bordetella sp.)LU4发酵物的菌体含量为1×10⁶CFU/ml。将这四种发酵物按红球菌(Rhodococcus sp.)LU3、微杆菌(Microbacterium sp.)LU 1、苍白杆菌(Ochrobacteriumsp.)LU2和博德特氏菌(Bordetella sp.)LU4的集落形成单位数目比为1∶1∶1∶1的比例混合得到该菌剂的活性成分，该菌剂的总菌数为1×10⁶CFU/ml。

所述液体培养基的组分包括(每升含量)：1g NH₄Cl、0.1g MgSO₄·7H₂O、0.05gCaCl₂·2H₂O、0.1g酵母膏、1.9g KH₂PO₄、1.7g Na₂HPO₄、0.1ml维生素混合液、1ml微量金属混合液、以及2ml煤焦油，其余为水。其中，维生素混合液的组分为：对氨基苯酸(100μg/L)、叶酸(50μg/L)、硫辛酸(100μg/L)、烟酸(200μg/L)、维生素B2(100μg/L)、硫胺素(200μg/L)、泛酸(100μg/L)、维生素B6(500μg/L)、维生素B12(100μg/L)、以及生物素(20μg/L)，其余为水；微量金属混合液的组分为：FeSO₄·7H₂O(2.0mg/L)、MnCl₂·4H₂O(0.03mg/L)、CaCl₂·6H₂O(0.2mg/L)、NiCl₂·6H₂O(0.02mg/L)、Na₂SeO₃·5H₂O(0.026mg/L)、EDTA(1.0mg/L)、ZnSO₄·7H₂O(0.1mg/L)、H₃BO₃(0.3mg/L)、CuCl₂·2H₂O(0.01mg/L)、NaMoO₄·2H₂O(0.03mg/L)、Na₂MoO₄·2H₂O(0.033mg/L)和CoCl₂·6H₂O(0.2mg/L)，其余为水。该培养基可替换为普通的细菌培养基。

培养条件为：温度控制在30℃，以无菌棉花塞住瓶口，在恒温振荡箱中以300r/min的转速振荡培养两周。

二、菌剂的制备

将步骤一获得的活性成分和土温80按配比为：15×10⁶CFU∶75μl混合，获得去除多环芳烃和/或降解多环芳烃的液体菌剂。

实施例3、去除多环芳烃和/或降解多环芳烃菌剂在土壤修复中的应用

从北京焦化厂采集了多环芳烃污染土壤进行实验，土壤质地主要为砂质土，夹带粘质土，有效氮和有效磷的含量分别为60mg/kg和3.5mg/kg，总有机碳含量为0.6％(6000mg/kg)，16种多环芳烃的总含量约为240～307mg/kg。土壤中的多环芳烃采用微波萃取，柱层析净化，GC-MS测定。具体实验步骤为：在万分之一天平上称3g土样装入微波萃取柱，加入10mL正己烷和10mL丙酮作为萃取剂，萃取程序为10分钟升温至100℃，保持10分钟。冷却30分钟后，将萃取柱取出。将萃取液连同土壤一并倒入微波萃取仪配套的过滤装置中，加压过滤，用5mL正己烷洗两次萃取柱，将清洗液一并过滤转入圆底烧瓶。取适量灼烧过的硅胶(80-200mesh)和氧化铝装入层析柱，加入1cm的无水硫酸钠，用两倍柱体积的正己烷淋洗柱子。将微波萃取出的萃取液在旋转蒸发仪上浓缩到1ml，待第一次淋洗液液面下降到与填充物上部相切时，将浓缩后的萃取液倒入层析柱。用少量正己烷润洗圆底烧瓶两次，将润洗液分别加入层析柱。然后用20ml正己烷淋洗，淋洗液弃去。用70ml二氯甲烷洗脱，用圆底烧瓶收集洗脱液，旋蒸至1ml，转入1ml瓶中。采用气相色谱-质谱仪(安捷伦GC6890/5973MSD，HP-5石英毛细管色谱柱：30m×0.32mm，ID 0.25μm液膜厚)测定。测定条件为：载气为高纯He，柱前压0.03MPa，线速度37cm/s.进样口温度300℃，不分流进样方式。初始温度60℃，以5℃/min速度升温至300℃，保留20min至样品完全流出。质谱条件为：EI电离源70eV，质量范围45～600amu，倍增器电压1288V，离子源温度230℃，采用选择离子模式(SIM)。在该检测条件下，16种多环芳烃的保留时间分别为(分钟)：萘8.67、苊烯15.23、苊16.04、芴18.42、菲22.81、蒽23.04、荧蒽28.35、芘29.34、苯并蒽35.06、屈35.21、苯并(b)荧蒽39.8、苯并(k)荧蒽39.93、苯并(a)芘41.28、茚并(1，2，3-cd)芘46.78、二苯并蒽47.06、苯并(ghi)苝)47.96。采用内标法定量。内标为2-氟联苯和对-三联苯，浓度均为250ppb(ug/kg)。实验土壤中16种多环芳烃的初始浓度见表2和表3。

实验设置两组：对照组和处理组，每组设计6次采样(每周一次)，每次采样取两个平行样，具体操作如下：

对照组：在小桶中加入180g土，用加样枪移取15ml高纯水，搅拌均匀，然后平均分装在12个150ml三角瓶中，用铝箔密闭瓶口。

处理组：在小桶中加入180g土，用加样枪移取15ml实施例2获得的多环芳烃微生物降解菌剂，搅拌均匀，然后平均分装在12个150ml三角瓶中，用铝箔密闭瓶口。

将上述24个三角瓶装入纸箱中，放在暗室避光培养。每隔一周加水，保持土壤含水率在15％。每周从各组中取一次样(两个三角瓶，平行)，对瓶中全部土壤进行多环芳烃的含量分析。

每周取样进行检测。第五周取样中，由于处理组中有一个样品损坏，故取第四周的样品进行去除率的分析。对照组和处理组4周后土壤中16种多环芳烃中各多环芳烃的浓度见表2和表3。

表2对照组4周前和4周后16种多环芳烃的浓度

多环芳烃	4周前浓度(mg/kg)	4周后浓度(mg/kg)
			萘	0.066±0.055	0.047±0.004
苊烯	4.339±3.915	3.993±0.716
			苊	124.219±105.529	128.413±21.915
芴	74.142±61.813	83.851±9.911
			菲	20.654±17.237	24.417±1.787
蒽	3.287±2.825	3.626±0.538
			荧蒽	5.573±4.688	6.692±0.615
芘	3.260±2.754	3.876±0.421
			苯并蒽	0.865±0.740	1.005±0.215

多环芳烃	4周前浓度(mg/kg)	4周后浓度(mg/kg)
			屈	0.801±0.672	1.033±0.074
苯并(b)荧蒽	1.100±0.945	1.190±0.323
			苯并(k)荧蒽	0.295±0.251	0.359±0.027
苯并(a)芘	0.640±0.564	0.678±0.227
			茚并(1，2，3-cd)芘	0.420±0.379	0.390±0.192
二苯并蒽	0.062±0.055	0.056±0.024
			苯并(ghi)苝	0.309±0.276	0.308±0.126

表3处理组4周前和4周后16种多环芳烃的浓度

多环芳烃	4周前浓度(mg/kg)	4周后浓度(mg/kg)
			萘	0.110±0.025	0.051±0.014
苊烯	5.084±0.924	3.748±0.824
			苊	161.811±33.242	130.492±41.366
芴	95.081±18.097	80.445±21.343
			菲	25.686±3.889	22.635±4.424
蒽	4.069±0.658	3.275±0.534
			荧蒽	6.898±0.837	5.895±0.801
芘	4.029±0.481	3.414±0.449
			苯并蒽	1.022±0.101	0.832±0.108

多环芳烃	4周前浓度(mg/kg)	4周后浓度(mg/kg)
			屈	0.972±0.092	0.857±0.122
苯并(b)荧蒽	1.259±0.121	0.958±0.106
			苯并(k)荧蒽	0.337±0.051	0.322±0.052
苯并(a)芘	0.744±0.073	0.544±0.052
			茚并(1，2，3-cd)芘	0.452±0.044	0.280±0.021
二苯并蒽	0.068±0.006	0.043±0.005
			苯并(ghi)苝	0.343±0.033	0.233±0.025

计算了对照组和处理组土壤中各种多环芳烃的去除率，见图1。去除率(％)等于(4周前多环芳烃含量-4周后多环芳烃含量的差值)/4周前多环芳烃含量。其中横坐标为1、萘；2、苊烯；3、苊；4、芴；5、菲；6、蒽；7、荧蒽；8、芘；9、苯并蒽；10、屈；11、苯并(b)荧蒽；12、苯并(k)荧蒽；13、苯并(a)芘；14、茚并(1，2，3-cd)芘；15、二苯并蒽；16、苯并(ghi)苝，纵坐标为去除率，■代表处理组，◆代表对照组。从图2中可以看出，与对照组相比，处理组中16种多环芳烃的去除率有明显提高，平均提高了30％，其中6种低环(二/三环)多环芳烃的去除率平均提高了26％，10种中高环(四环及以上)多环芳烃的去除率平均提高了32％。

序列表

<110>北京大学

 

<120>去除多环芳烃和/或降解多环芳烃的菌剂及其应用

 

<130>CGGNARB102258

 

<160>4

 

<170>PatentIn version 3.2

 

<210>1

<211>1395

<212>DNA

<213>微杆菌(Microbacterium sp.)

 

<400>1

gcaagtcgaa cggtgaacac ggagcttgct ctgtgggatc agtggcgaac gggtgagtaa      60

cacgtgagca acctgcccct gactctggga taagcgctgg aaacggcgtc taatactgga     120

tatgtgacgt gaccgcatgg tctgcgtttg gaaagatttt tcggttgggg atgggctcgc     180

ggcctatcag cttgttggtg aggtaatggc tcaccaaggc gtcgacgggt agccggcctg     240

agagggtgac cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag     300

tggggaatat tgcacaatgg gcggaagcct gatgcagcaa cgccgcgtga gggatgacgg     360

ccttcgggtt gtaaacctct tttagcaggg aagaagcgaa agtgacggta cctgcagaaa     420

aagcgccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg tagggcgcaa gcgttatccg     480

gaattattgg gcgtaaagag ctcgtaggcg gtttgtcgcg tctgctgtga aatcccgagg     540

ctcaacctcg ggcctgcagt gggtacgggc agactagagt gcggtagggg agattggaat     600

tcctggtgta gcggtggaat gcgcagatat caggaggaac accgatggcg aaggcagatc     660

tctgggccgt aactgacgct gaggagcgaa agggtgggga gcaaacaggc ttagataccc     720

tggtagtcca ccccgtaaac gttgggaact agttgtgggg tccattccac ggattccgtg     780

acgcagctaa cgcattaagt tccccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct aaaactcaaa     840

ggaattgacg gggacccgca caagcggcgg agcatgcgga ttaattcgat gcaacgcgaa     900

gaaccttacc aaggcttgac atatacgaga acgggccaga aatggtcaac tctttggaca     960

ctcgtaaaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc    1020

ccgcaacgag cgcaaccctc gttctatgtt gccagcacgt aatggtggga actcatggga    1080

tactgccggg gtcaactcgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg    1140

tcttgggctt cacgcatgct acaatggccg gtacaaaggg ctgcaatacc gtgaggtgga    1200

gcgaatccca aaaagccggt cccagttcgg attgaggtct gcaactcgac ctcatgaagt    1260

cggagtcgct agtaatcgca gatcagcaac gctgcggtga atacgttccc gggtcttgta    1320

cacaccgccc gtcaagtcat gaaagtcggt aacacctgaa gccggtggcc taacccttgt    1380

ggagggagcc gtcga                                            1395

 

<210>2

<211>541

<212>DNA

<213>苍白杆菌(Ochrobacterium sp.)

 

<400>2

gccccgcaag gggagcggca gacgggtgag taacgcgtgg gaacgtacct tttgctacgg    60

aataactcag ggaaacttgt gctaataccg tatgtgccct tcgggggaaa gatttatcgg   120

caaaggatcg gcccgcgttg gattagctag ttggtgaggt aaaggctcac caaggcgacg   180

atccatagct ggtctgagag gatgatcagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc   240

ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga caatgggcgc aagcctgatc cagccatgcc   300

gcgtgagtga tgaaggccct agggttgtaa agctctttca ccggtgaaga taatgacggt   360

aaccggagaa gaagccccgg ctaacttcgt gccagcagcc gcggtaatac gaagggggct   420

agcgttgttc ggatttactg ggcgtaaagc gcacgtaggc ggacttttaa gtcaggggtg   480

aaatcccggg gctcaacccc ggaactgcct ttgatactgg aagtcttgag tatggtagag   540

g                                                        541

 

<210>3

<211>876

<212>DNA

<213>红球菌(Rhodococcus sp.)

 

<400>3

ggttttccgg tgcaggatgg gcccgcggcc tatcagcttg ttggtggggt aacggcccac    60

caaggcgacg acgggtagcc ggcctgagag ggcgaccggc cacactggga ctgagacacg   120

gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcgc aagcctgatg   180

cagcgacgcc gcgtgaggga tgacggcctt cgggttgtaa acctctttca gtaccgacga   240

agcgcaagtg acggtaggta cagaagaagc accggccaac tacgtgccag cagccgcggt   300

aatacgtagg gtgcgagcgt tgtccggaat tactgggcgt aaagagctcg taggcggttt   360

gtcgcgtcgt ctgtgaaaac ccgcagctca actgcgggct tgcaggcgat acgggcagac   420

ttgagtactg caggggagac tggaattcct ggtgtagcgg tgaaatgcgc agatatcagg   480

aggaacaccg gtggcgaagg cgggtctctg ggcagtaact gacgctgagg agcgaaagcg   540

tgggtagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacggtg ggcgctaggt   600

gtgggtttcc ttccacggga tccgtgccgt agctaacgca ttaagcgccc cgcctggggg   660

agtacggccg caaggctaaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggcggagc   720

atgtggatta attcgatgca cgcgaagacc cttacttggg ttttgacata caccggaccg   780

ccccagagat ggggtttccc ttgtggtcgg tgtcagtggg tgcatggctg tcgtcagctt   840

cctgtcgtga gagctgggtt aagtcccgca acagcg                        876

 

<210>4

<211>639

<212>DNA

<213>博德特氏菌(Bordetella sp.)

 

<400>4

agtcgaacgg cagcgcggac ttcggtctgg cggcgagtgg cgaacgggtg agtaatgtat    60

cggaacgtgc cccgtagcgg gggataacta cgcgaaagcg tagctaatac cgcatacgcc   120

ctgaggggga aagcggggga tcttcggacc tcgcactatt ggagcggccg atatcggatt   180

agctagttgg tggggtaacg gctcaccaag gcgacgatcc gtatctggtt tgagaggacg   240

accagccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat   300

tttggacaat gggggcaacc ctgatccagc catcccgcgt gtgcgatgaa ggccttcggg   360

ttgtaaagca cttttggcag gaaagaaacg gcgctggcta atacctggcg caactgacgg   420

tacctgcaaa ataagcaccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtgc   480

aggcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgtgcgcagg cggttcggaa agaaagatgt   540

gaaatcccag ggcttaacct tggaactgca tttttaacta ccgggctaga gtgtgtcaga   600

ggggggtgga attccacgtg tagcagtgaa atgcgtaga                      639

Claims (10)

1.一种去除多环芳烃和/或降解多环芳烃的菌剂，它的活性成分为红球菌(Rhodococcus sp.)LU3 CGMCC No.3610、微杆菌(Microbacterium sp.)LU1 CGMCCNo.3581、苍白杆菌(Ochrobacterium sp.)LU2 CGMCC No.3582和博德特氏菌(Bordetella sp.)LU4 CGMCC No.3611。

2.根据权利要求1中所述的菌剂，其特征在于：所述红球菌(Rhodococcus sp.)LU3 CGMCC No.3610、所述微杆菌(Microbacterium sp.)LU1 CGMCC No.3581、所述苍白杆菌(Ochrobacterium sp.)LU2 CGMCC No.3582和所述博德特氏菌(Bordetellasp.)LU4 CGMCC No.3611的集落形成单位数目比为(1-100)∶(1-100)∶(1-100)∶(1-100)，优选为(1-10)∶(1-10)∶(1-10)∶(1-10)，尤其优选为1∶1∶1∶1。

3.根据权利要求1或2中所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂中包括表面活性剂。

4.根据权利要求3中所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂由活性成分和表面活性剂构成。

5.根据权利要求3或4中所述的菌剂，其特征在于：所述表面活性剂为非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂优选为土温80。

6.根据权利要求3-5中任一所述的菌剂，其特征在于：所述活性成分和所述表面活性剂的配比为(1×10⁶CFU-20×10⁶CFU)∶(0.05ml-0.1ml)土温80，优选为15×10⁶CFU∶0.075ml土温80。

7.根据权利要求3-6中任一所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂的制备方法包括如下步骤：

1)将红球菌(Rhodococcus sp.)LU3 CGMCC No.3610、微杆菌(Microbacteriumsp.)LU1 CGMCC No.3581、苍白杆菌(Ochrobacterium sp.)LU2 CGMCC No.3582和博德特氏菌(Bordetella sp.)LU4 CGMCC No.3611分别在如下培养基中在30℃进行培养，收集培养容器内的所有物质，将红球菌(Rhodococcus sp.)LU3培养容器内的所有物质称为红球菌(Rhodococcus sp.)LU3发酵物，微杆菌(Microbacterium sp.)LU1培养容器内的所有物质称为微杆菌(Microbacterium sp.)LU1发酵物，苍白杆菌(Ochrobacterium sp.)LU2培养容器内的所有物质称为苍白杆菌(Ochrobacterium sp.)LU2发酵物，博德特氏菌(Bordetella sp.)LU4培养容器内的所有物质称为博德特氏菌(Bordetella sp.)LU4发酵物，将四种发酵物混合获得混合发酵物；

1升所述培养基的组成如下：0.5-1.5g NH₄Cl、0.05-0.15g MgSO₄·7H₂O、0.01-0.1gCaCl₂·2H₂O、0.05-0.15g酵母膏、1.5-2g KH₂PO₄、1.5-2g Na₂HPO₄、0.05-0.15ml维生素混合液、0.5-1.5ml微量金属混合液、以及1.5-2.5ml煤焦油，其余为水；所述维生素混合液的组成为：50-150μg/L对氨基苯酸、10-100μg/L叶酸、50-150μg/L硫辛酸、150-250μg/L烟酸、50-150μg/L维生素B2、150-250μg/L硫胺素、50-150μg/L泛酸、450-550μg/L维生素B6、50-150μg/L维生素B12、以及15-25μg/L生物素，其余为水；所述微量金属混合液的组成为：1.5-2.5mg/L FeSO₄·7H₂O、0.01-0.05mg/LMnCl₂·4H₂O、0.15-0.25mg/L CaCl₂·6H₂O、0.01-0.03mg/L NiCl₂·6H₂O、0.02-0.03mg/LNa₂SeO₃·5H₂O、0.5-1.5mg/L EDTA、0.05-0.15mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.1-0.5mg/L H₃BO₃、0.005-0.015mg/L CuCl₂·2H₂O、0.01-0.05mg/L NaMoO₄·2H₂O、0.01-0.05mg/LNa₂MoO₄·2H₂O和0.15-0.25mg/L CoCl₂·6H₂O，其余为水；

2)再向步骤1)得到的混合发酵物中添加表面活性剂获得菌剂。

8.根据权利要求3-7中任一所述的菌剂，其特征在于：

步骤1)中1升所述培养基的组成如下：1g NH₄Cl、0.1g MgSO₄·7H₂O、0.05gCaCl₂·2H₂O、0.1g酵母膏、1.9g KH₂PO₄、1.7g Na₂HPO₄、0.1ml维生素混合液、1ml微量金属混合液、以及2ml煤焦油，其余为水；所述维生素混合液的组分为：100μg/L对氨基苯酸、50μg/L叶酸、100μg/L硫辛酸、200μg/L烟酸、100μg/L维生素B2、200μg/L硫胺素、100μg/L泛酸、500μg/L维生素B6、100μg/L维生素B12、以及20μg/L生物素，其余为水；所述微量金属混合液的组成为：2.0mg/L FeSO₄·7H₂O、0.03mg/L MnCl₂·4H₂O、0.2mg/LCaCl₂·6H₂O、0.02mg/L NiCl₂·6H₂O、0.026mg/LNa₂SeO₃·5H₂O、1.0mg/L EDTA、0.1mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.3mg/L H₃BO₃、0.01mg/LCuCl₂·2H₂O、0.03mg/L NaMoO₄·2H₂O、0.033mg/L Na₂MoO₄·2H₂O和0.2mg/LCoCl₂·6H₂O，其余为水；

所述培养的条件为：培养温度为30℃，培养转速为300r/min，培养时间为两周。

所述红球菌(Rhodococcus sp.)、所述微杆菌(Microbacterium sp.)、所述苍白杆菌(Ochrobacterium sp.)和所述博德特氏菌(Bordetella sp.)的集落形成单位数目比为(1-100)∶(1-100)∶(1-100)∶(1-100)，优选为(1-10)∶(1-10)∶(1-10)∶(1-10)，尤其优选为1∶1∶1∶1。

步骤2)中的所述表面活性剂为非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂优选为土温80；所述混合发酵物与所述表面活性剂的配比为所述活性成分和所述表面活性剂的配比为(1×10⁶CFU-20×10⁶CFU)∶(0.05ml-0.1ml)土温80，优选为15×10⁶CFU∶0.075ml土温80。

9.权利要求1-8中任一所述的菌剂在去除多环芳烃的应用，所述多环芳烃选自下述16种中的至少一种：萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并蒽、屈、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、茚并[1，2，3-cd]芘、二苯并蒽和苯并[ghi]苝。

10.根据权利要求9所述的菌剂，其特征在于：所述应用为去除土壤中的所述多环芳烃。

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