CN104805044A

CN104805044A - 一株具有石油降解功能的细菌ah07和其用途以及海底沉降石油降解菌剂

Info

Publication number: CN104805044A
Application number: CN201510222039.2A
Authority: CN
Inventors: 刘秋; 于基成; 潘俊华; 刘长建
Original assignee: Dalian Nationalities University
Current assignee: Dalian Minzu University
Priority date: 2015-04-30
Filing date: 2015-04-30
Publication date: 2015-07-29
Anticipated expiration: 2035-04-30
Also published as: CN104805044B

Abstract

一株具有石油降解功能的细菌AH07和其用途以及海底沉降石油降解菌剂，属于微生物技术领域，所述的菌株AH07的用途为以石油降解的方式进行石油污染的治理。以可沉降菌剂颗粒的形式实现的。菌剂颗粒按照以下步骤获得活化培养料、制繁殖培养基；菌种扩培制适于石油降解的菌种的发酵料；混合造粒，得菌剂颗粒；本发明首次从海洋土著微生物中筛选出适用于石油降解的菌株AH07；研发的一种海底石油降解菌剂，不仅使石油降解微生物拥有寄居的空间，同时微生物可获得缓释的营养；该降解菌剂具备沉降特性，解决了石油污染后引起的海底沉降石油污染及继而引发的海底荒漠化问题。

Description

一株具有石油降解功能的细菌AH07和其用途以及海底沉降石油降解菌剂

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有石油降解功能的细菌AH07(Ochrobactrum cytisi，CGMCC No.10349)以及利用该菌株海洋环境治理领域的应用，尤其是涉及石油污染后引起的石油污染的生物治理领域的应用。

背景技术

近年来随着海洋石油的运输、开采、装卸、加工和使用，海洋石油泄漏事件时有发生，海洋石油污染日益加剧。石油对生物多样性的破坏严重，包括人们常见的各种鱼类、鸟类以及其它生物都受到了严重影响，石油可沾附在鱼鳃上，使鱼窒息，抑制水鸟产卵和孵化，破坏其羽毛的不透水性，降低水产品质量；同时，泄露的石油可形成油膜，阻碍水体的复氧作用，影响海洋浮游生物生长，破坏海洋生态平衡；此外还可破坏海滨风景，影响海滨美学价值。

目前，针对于石油污染，尤其是大面积石油泄漏，通常采用的应急措施除了采油人工打捞等物理方法，还采用加入消油剂使石油乳化，迅速沉降的方法以恢复海面暂时的清洁，虽然这一方法短时看似起到了治理的效果，但背后却隐藏着危机，其会造成二次化学污染。

因此，实施物理化学方法进行生态环境的重建几乎不可能实现，生物修复海洋污染成为唯一可行的途径。但相对于陆地，海洋植物相对匮乏，污染海洋的生物修复还主要依赖海洋微生物的降解作用，尤其依赖于已经适应海底环境的各种土著石油降解微生物。这些石油降解微生物在海底能够利用石油作为其唯一碳源，克服海底黑暗、低温、寡养、缺氧的极端条件，以石油为食，将石油进行分解转化，从而改变而海底荒漠化问题。

发明内容

为了解决石油泄露引发的污染问题，如海面的漂浮石油的污染问题；又如化学治理引发的二次污染，尤其是为了解决石油污染后引起的海底沉降石油污染及继而引发的海底荒漠化问题，发明人设法获得高效的海洋土著石油微生物并进行研究，最终得到了一株具有石油降解功能的细菌AH07。发明人在要求保护此菌株的同时要求对其用途进行保护。

本发明的技术方案如下：

一株具有石油降解功能的细菌AH07，该菌株的建议分类命名为Ochrobactrum cytisi。其16S rRNA序列如SEQ ID No.1所示。

所述的适用于石油降解的菌株AH07是发明人从自然界中分离得到的,在细菌分类学上属于变形杆菌门(Proteobacteria phy.nov.)，阿尔法变形杆菌纲(Alphaproteobacteria)，根瘤菌目(Rhizobiales)，市鲁氏菌科(Brucellaceae)，苍白杆菌属(Ochrobactrum)。发明人从大连新港石油污染海域采集的海底沉积物中分离获得。取泥样5克用无菌水稀释10⁵倍,将原油均匀涂布到ASM培养基上，15℃培养7天分离得到菌株。菌株AH07从大连新港石油污染海域采集的海底沉积物中分离获得，采集者姓名刘长建、采集者联系方式0411-87656046。

所述的菌株AH07已提交保藏，具体保藏信息如下：

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2015年01月13日；

保藏编号：CGMCC No.10349；

分类命名:Ochrobactrum cytisi；

所述的适用于石油降解的菌株AH07的形态及生理生化特征为：

(1)菌落形态特征

菌株AH07的菌落形态为：在LB培养基上培养7天后，呈乳白色，菌落较小，表面略有光泽，光滑，菌落边缘光滑整齐。

(2)菌株形态及其生理生化特性

在细菌分类学上属于变形杆菌门(Proteobacteria phy.nov.)，阿尔法变形杆菌纲(Alphaproteobacteria)，根瘤菌目(Rhizobiales)，市鲁氏菌科(Brucellaceae)，苍白杆菌属(Ochrobactrum)。革兰氏阴性好氧细菌，色氨酸酶阴性，过氧化氢酶阳性，无色素产生，产生H2S。菌体杆状，0.8-2.0*0.3-0.4μm。在NaCl浓度0-20％范围内均能生长，最适NaCl浓度3％，生长的温度范围4-50℃，最适温度范围25-30℃，pH范围5-10.5，最适pH7.0-8.5，水解明胶和淀粉，不能利用葡萄糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、果糖、木糖、棉籽糖、甘露糖、山梨糖醇、甘油。

所述的菌株AH07的用途为以石油降解的方式进行石油污染的治理。

优选的，该用途是以可沉降菌剂颗粒的形式实现的。

发明人的第一个技术构思为：研发一种石油降解微生物的载体，不仅能够为菌株AH07提供寄居的空间，同时该载体可为菌株AH07提供缓释营养并且具备沉降特性。

本发明的此目的通过下述方案实现：

海底沉降石油降解菌剂，是将菌种AH07的发酵料与石油降解微生物载体的制备原料按照1:5-15的质量比，优选1:10的质量比混合后造粒烘干而得；进一步的，使最终的菌剂浓度为10¹⁰cfu/ml以上为佳；

所述的石油降解微生物载体的制备原料及其配比包括：

腐殖酸	50-80wt％
		花生饼粉	2-5wt％
麸皮	2-5wt％
		膨润土	15-39wt％
Na₂HPO₄	0.5-0.7wt％
		KH₂PO₄	0.1-0.2wt％
NH₄NO₃	0.2-0.3wt％

进一步的，所述的菌种AH07的发酵料可采用本领域普通技术人员所公知的任意一种发酵方法来获得。但采用发明人所使用的以下方法生产发酵料，会取得更好的效果：

菌种AH07的发酵料是将活化好的菌种AH07培养料与繁殖培养基按照1:5-10质量比，优选1:10的质量比混合；于20～50℃、优选37℃下固体发酵3～7天，优选发酵5天，得菌种AH07的发酵料，进一步的，使最终发酵料的活菌数10¹⁰cfu/g以上；

所述的菌种AH07培养料是在LB斜面挑取待活化细菌AH07菌株接入活化液体LB培养基中25-50℃下、优选37℃进行活化而得；从而得到活化后菌体浓度为10¹⁰cfu/ml的的培养料；所述活化液体LB培养基为：蛋白胨10g/L,NaCl 10g/L,酵母膏5g/L，pH 7.0～7.5；121℃,30min灭菌；

所述的繁殖培养基固态原料及配比：

腐殖酸	50-80wt％
		花生饼粉	2-5wt％
麸皮	3-8wt％
		膨润土	15-37wt％

繁殖培养基成品的湿度优选55％。

进一步的，所述的造粒烘干可按照常规方法造粒即可，但优选下述发明人采用的方法，可产生更优的效果：

造粒烘干是将混合料加入搅拌机中并加入粘结剂搅拌，加水充分混合使含水量低于25wt％，挤压造粒，80℃以下顺流烘干10min以下；冷却后即得海底沉降石油降解菌剂，保证海底沉降石油降解菌剂中活菌数达到10⁹cfu/ml；

优选的，所述的顺流烘干，具体是将湿颗粒通过烘干机前部的中间仓进入烘干筒内，与此同时热风以顺流方式进入烘干筒，在旋转筒体的内抄板带动下，物料被抄起，形成分撒均匀的较密集的料幕；

优选的，石油降解微生物载体的制备原料均为20目以下的细粉；

优选的，繁殖培养基的制备原料均为20目以下的细粉。

本发明的有益效果在于：

1.本发明首次从海洋土著微生物中筛选出适用于石油降解的菌株AH07；

2.发明人研发的一种海底石油降解菌剂，不仅使石油降解微生物拥有寄居的空间，同时微生物可获得缓释的营养；该降解菌剂具备沉降特性，解决了石油污染后引起的海底沉降石油污染及继而引发的海底荒漠化问题。

附图说明

图1菌株AH07的菌落形态图；

图2菌株AH07的菌体的扫描电子显微镜观察图；

图3菌株AH07的系统发育树；

图4菌株AH07的石油降解性能测定；

图5菌剂载体对菌株AH07的营养作用图；

图6本发明菌株AH07菌剂颗粒形态图。

具体实施方式

下面以具体实施的方式对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明不以任何形式受限于实施例内容。

一、实施例

实施例1

海底沉降石油降解菌剂，是将菌种AH07的发酵料与石油降解微生物载体的制备原料按照1:15的质量比混合后造粒烘干而得；进一步的，使最终的菌剂浓度为10¹⁰cfu/ml以上为佳；

所述的石油降解微生物载体的制备原料及其配比包括：

腐殖酸	80wt％
		花生饼粉	2wt％
麸皮	2wt％
		膨润土	15wt％
Na₂HPO₄	0.5wt％
		KH₂PO₄	0.2wt％
NH₄NO₃	0.3wt％

菌种AH07的发酵料是将活化好的菌种AH07培养料与繁殖培养基按照1:10质量比，于50℃下固体发酵7天，得菌种AH07的发酵料，进一步的，使最终发酵料的活菌数10¹⁰cfu/g以上；

所述的菌种AH07培养料是在LB斜面挑取待活化适于石油降解的菌株接入活化液体LB培养基中50℃下、优选37℃进行活化而得；从而得到活化后菌体浓度为10¹⁰cfu/ml的培养料；所述活化液体LB培养基为：蛋白胨10g/L,NaCl 10g/L,酵母膏5g/L，pH 7.0～7.5；121℃,30min灭菌；

所述的繁殖培养基固态原料及配比：

腐殖酸	80wt％
		花生饼粉	2wt％
麸皮	3wt％
		膨润土	15wt％

繁殖培养基成品的湿度优选55％。

优选的，繁殖培养基的制备原料均为20目以下的细粉。

所述的烘干机可以选用任意一种能够完成烘干步骤的市售烘干机，但优选以下厂家生产的该型号的烘干机：章丘市宇龙机械有限公司，顺流滚筒式烘干机GHGф1.0*12*1。

实施例2

海底沉降石油降解菌剂，是将菌种AH07的发酵料与石油降解微生物载体的制备原料按照1:5的质量比混合后造粒烘干而得；进一步的，使最终的菌剂浓度为10¹⁰cfu/ml以上为佳；

所述的石油降解微生物载体的制备原料及其配比包括：

腐殖酸	53.1wt％
		花生饼粉	5wt％
麸皮	2wt％
		膨润土	39wt％
Na₂HPO₄	0.5wt％
		KH₂PO₄	0.2wt％
NH₄NO₃	0.2wt％

菌种AH07的发酵料是将活化好的菌种AH07培养料与繁殖培养基按照1:5质量比混合；于20℃下固体发酵3天，优选发酵5天，得菌种AH07的发酵料，进一步的，使最终发酵料的活菌数10¹⁰cfu/g以上；

所述的活化好菌种AH07培养料是在LB斜面挑取待活化适于石油降解的菌株接入活化液体LB培养基中25℃下进行活化而得；从而得到活化后菌体浓度为10¹⁰cfu/ml的培养料；所述活化液体LB培养基为：蛋白胨10g/L,NaCl 10g/L,酵母膏5g/L，pH 7.0～7.5；121℃,30min灭菌；

所述的繁殖培养基固态原料及配比：

腐殖酸	55wt％
		花生饼粉	5wt％

麸皮	3wt％
		膨润土	37wt％

繁殖培养基成品的湿度优选55％。

优选的，繁殖培养基的制备原料均为20目以下的细粉。

实施例3

海底沉降石油降解菌剂，是将菌种AH07的发酵料与石油降解微生物载体的制备原料按照1:10的质量比混合后造粒烘干而得；进一步的，使最终的菌剂浓度为10¹⁰cfu/ml以上为佳；

所述的石油降解微生物载体的制备原料及其配比包括：

腐殖酸	75wt％
		花生饼粉	3wt％
麸皮	3wt％
		膨润土	18wt％
Na₂HPO₄	0.5wt％
		KH₂PO₄	0.2wt％
NH₄NO₃	0.3wt％

菌种AH07的发酵料是将活化好的菌种AH07培养料与繁殖培养基按照1:8质量比混合；于37℃下固体发酵5天，得菌种AH07的发酵料，进一步的，使最终发酵料的活菌数10¹⁰cfu/g以上；

所述的活化好菌种AH07培养料是在LB斜面挑取待活化适于石油降解的菌株接入活化液体LB培养基中37℃进行活化而得；从而得到活化后菌体浓度为10¹⁰cfu/ml的培养料；所述活化液体LB培养基为：蛋白胨10g/L,NaCl 10g/L,酵母膏5g/L，pH 7.0～7.5；121℃,30min灭菌；

所述的繁殖培养基固态原料及配比：

腐殖酸	74wt％
		花生饼粉	4wt％
麸皮	7wt％
		膨润土	15wt％

繁殖培养基成品的湿度优选55％。

优选的，繁殖培养基的制备原料均为20目以下的细粉。

二、菌株AH07石油降解性能测定

1)150ml的锥形瓶加入ASM培养基50ml/瓶121℃灭菌30min；ASM培养基配方：

NaCl：30g，NH₄NO₃：1g，KH₂PO₄：0.2245g，Na₂HPO₄·12H₂O：5g，天然海水1000ml，微量溶液：10ml，pH 7.5。灭菌温度121℃30min。

微量溶液配方：

CaCl₂	FeCl.6H₂O	CuSO₄	MnCl.4H₂O	ZnSO₄·7H₂O	蒸馏水
						2mg	50mg	0.5mg	0.5mg	10mg	1000ml

2)将灭好菌的培养基中加入250ul原油及微量溶液0.5m；

3)控制菌株的菌体浓度10⁹cfu/ml，分别加入1ml菌悬液于锥形瓶中；

4)以不加菌的空白ASM培养基(添加了250ul原油)为对照；

5)15℃静置培养7d，实验重复三次；对照效果如图4所示；

6)石油降解率的测定方法：

A:将上述培养好的锥形瓶拿出加入石油醚20ml倒入分液漏斗中静置15min。

B:打开分液漏斗将水相分离出来，留下剩余石油，配平后离心1000r/15min,将液体倒入容量瓶。

C:将B中分离得到的水相再倒入15ml石油醚进行2次萃取静置10min重复B工作。

D:取10ml石油醚清洗分液漏斗，并将其导入容量瓶。

E：容量瓶液体定容。待测。

石油降解率的测定方法：紫外分光光度法(波长225nm)测定降解率按下式定义：

η = \frac{(C_{0} - C_{1})}{C_{0}} \times 100 %

C₀是对照样品吸光值，C₁是测定样品吸光值。降解率是三个样品的平均值。

菌株AH07的石油降解率

表1菌株AH07石油降解性能的测定

三、菌株AH07菌剂颗粒的石油降解性能测评

分别取制备好的活菌数达到10⁹cfu/ml的菌剂颗粒0.2g、0.5g、1g、2g、4g，分别添加至装入100mL不含石油的ASM培养基的无菌三角瓶中，加入0.5mL的灭菌石油，混合摇匀，15℃静止培养9d后，测定石油降解率。以不加入菌剂颗粒的含石油ASM培养基作为对照。

表2石油降解菌株AH07菌剂颗粒添加量对石油降解性能的影响(石油降解率％)

四、菌剂载体对菌株AH07的营养作用

试验方法：

取实施例1方法制得的菌剂颗粒1800g，平均分成18份，每份100g，置于耐压厌氧培养瓶中，每份菌剂添加天然海水200ml，首先使耐压厌氧培养瓶抽真空，排出空气后充入氮气，使压力达到1个大气压，然后将耐压厌氧培养瓶置于15℃低温培养箱内培养，分别于第1周-第5周每周取3瓶，按照梯度稀释法在LB培养基上进行活菌数计数，计算每周菌株AH07的繁殖情况。以原始菌剂中的活菌数作对照。

实验结果

如图5所示，随着培养时间的延长，AH07活菌数逐渐呈上升趋势，到第四周时趋于稳定，说明菌剂载体能够为菌株AH07提供生长所需的营养。

附件：

序列表

SEQ ID No.1(菌株AH07(Ochrobactrum cytisi)的16S rRNA序列)：

TGAGTAACGCGTGGGAACGTACCTTTTGCTACGGAATAACTCAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATGTGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGGCAAAGGATCGGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGACTTTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTTGATACTGGAAGTCTTGAGTATGGTAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGACCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGTTAGCCGTTGGGGAGTTTACTCTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTGACATACCGGTCGCGGACACAGAGATGTGTCTTTCAGTTCGGCTGGACCGGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCGAGCACGCGAGTGTGAGCTAATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCA

<110> 大连民族学院

<120> 一株具有石油降解功能的细菌AH07和其用途以及海底沉降石油降解菌剂

<160> 1

<210> 1

<211> 1261

<212> rDNA

<213> Ochrobactrum cytisi

<400> 1

Claims

1.一株具有石油降解功能的细菌AH07，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.10349，其16SrRNA序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述的一株具有石油降解功能的细菌AH07，形态及生理生化特征：在LB培养基上培养7天后，呈乳白色，菌落较小，表面略有光泽，光滑，菌落边缘光滑整齐，革兰氏阴性好氧细菌，色氨酸酶阴性，过氧化氢酶阳性，无色素产生，产生H₂S，菌体杆状，0.8-2.0*0.3-0.4μm，在NaCl浓度0-20％范围内均能生长，最适NaCl浓度3％，生长的温度范围4-50℃，最适温度范围25-30℃，pH范围5-10.5，最适pH7.0-8.5，水解明胶和淀粉，不能利用葡萄糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、果糖、木糖、棉籽糖、甘露糖、山梨糖醇、甘油。

3.如权利要求1所述的一株具有石油降解功能的细菌AH07在以石油降解的方式进行石油污染的治理的用途。

4.一种海底沉降石油降解菌剂，是将权利要求1所述的一株具有石油降解功能的细菌AH07的发酵料与石油降解微生物载体的制备原料按照1:5-15的质量比，优选1:10的质量比混合后造粒烘干而得；

所述的石油降解微生物载体的制备原料及其配比包括：

腐殖酸 50-80wt％花生饼粉 2-5wt％麸皮 2-5wt％膨润土 15-39wt％ Na₂HPO₄ 0.5-0.7wt％ KH₂PO₄ 0.1-0.2wt％ NH₄NO₃ 0.2-0.3wt％

。

5.如权利要求4所述的海底沉降石油降解菌剂，其特征在于：细菌AH07的发酵料是将活化好的细菌AH07培养料与繁殖培养基按照1:5-10质量比，优选1:10的质量比混合；于20～50℃、优选37℃下固体发酵3～7天，优选发酵5天而得细菌AH07发酵料；

所述的活化好细菌AH07培养料是在LB斜面挑取待活化细菌AH07的菌株接入活化液体LB培养基中25-50℃下、优选37℃进行活化而得；从而得到活化后菌体浓度为10¹⁰cfu/ml的的培养料；所述活化液体LB培养基为：蛋白胨10g/L,NaCl 10g/L,酵母膏5g/L，pH 7.0～7.5；121℃,30min灭菌；

所述的繁殖培养基固态原料及配比：

腐殖酸 50-80wt％花生饼粉 2-5wt％麸皮 3-8wt％膨润土 15-37wt％

繁殖培养基成品的湿度优选55％。

6.如权利要求4所述的海底沉降石油降解菌剂，其特征在于：所述的造粒烘干是将混合料加入搅拌机中并加入粘结剂搅拌，加水充分混合使含水量低于25wt％，挤压造粒，80℃以下顺流烘干10min以下；冷却后即得菌剂，保证菌剂中活菌数达到10⁹cfu/ml。

7.如权利要求6所述的海底沉降石油降解菌剂，其特征在于：所述的顺流烘干是将湿颗粒通过烘干机前部的中间仓进入烘干筒内，与此同时热风以顺流方式进入烘干筒，在旋转筒体的内抄板带动下，物料被抄起，形成分撒均匀的较密集的料幕。

8.如权利要求4所述的海底沉降石油降解菌剂，其特征在于：所述的石油降解微生物载体的制备原料均为20目以下的细粉。

9.如权利要求4所述的海底沉降石油降解菌剂，其特征在于：所述繁殖培养基的制备原料均为20目以下的细粉。