CN106167773A - 一株高效降解吡啶甲酸的金黄杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株高效降解吡啶甲酸的金黄杆菌及其应用,属于生物工程技术领域。本发明分离筛选出一株吡啶甲酸降解菌,金黄杆菌,其分类命名为Chryseobacterium sp.保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC NO.10699。本发明的优点是该金黄杆菌能够在pH值范围较宽或温度范围较宽,以及pH值范围较宽并且温度范围较宽的条件下有效降解吡啶甲酸;该金黄杆菌能够作为生物强化制剂应用于弱碱至弱酸性、较宽温度范围内的吡啶甲酸废水的好氧生物治理,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,具体涉及一株高效降解吡啶甲酸的金黄杆菌及其应用。
背景技术
吡啶甲酸及其衍生物广泛用于医药、农药以及日用化学品的生产中,吡啶甲酸的广泛应用导致其污染环境。吡啶甲酸废水可通过好氧生物法进行处理。目前,好氧降解吡啶甲酸的微生物资源主要有节杆菌、分枝杆菌和链霉菌等。关于其它属种的菌株报道尚不多见。
吡啶甲酸在工业中最重要的用途是生产医药和农药,所产生的废水酸度较高,pH值基本在4~6之间。在酸性较强的条件下,目前文献所报道的吡啶甲酸降解菌生长受到明显抑制,因此无法有效去除吡啶甲酸。此外,文献所报道的吡啶甲酸降解菌通常在25~30℃之间表现出较高的活性,而在低温条件下即温度≤20℃时菌株活性受到显著抑制。因此,目前文献所报道的吡啶甲酸降解菌难以用于低温环境中。
发明内容
本发明的目的在于提供一株高效降解吡啶甲酸的金黄杆菌及其应用,能够在较宽pH值范围以及较宽温度范围内高效去除吡啶甲酸。
为达到上述目的,本发明采用的技术方案为:
一株高效降解吡啶甲酸的金黄杆菌,其分类命名为Chryseobacterium sp.,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC NO.10699。
所述的高效降解吡啶甲酸的金黄杆菌在降解吡啶甲酸方面的应用。
所述的高效降解吡啶甲酸的金黄杆菌在制备生物菌制剂或生物强化制剂方面的应用。
所述的高效降解吡啶甲酸的金黄杆菌作为生物菌制剂或生物强化制剂在吡啶甲酸废水处理中的应用。
在吡啶甲酸为唯一碳源、氮源及能源、pH为7、温度为30℃的条件下,金黄杆菌能够对吡啶甲酸浓度≤800mg/L的废水进行降解。
在吡啶甲酸为唯一碳源、氮源及能源、温度为30℃、pH为3~7的条件下,金黄杆菌能够对吡啶甲酸浓度≤200mg/L的废水进行降解。
在吡啶甲酸为唯一碳源、氮源及能源、pH为7、温度为4~30℃的条件下,金黄杆菌能够对吡啶甲酸浓度≤200mg/L的废水进行降解。
在吡啶甲酸为唯一碳源、氮源及能源、温度为4~30℃、pH为3~7的条件下,金黄杆菌能够对吡啶甲酸浓度≤200mg/L的废水进行降解。
相对于现有技术,本发明的有益效果为:
本发明针对以往文献报道的吡啶甲酸降解菌存在的问题,通过科学方法驯化、筛选出一株新的吡啶甲酸降解菌—金黄杆菌,其分类命名为Chryseobacterium sp.,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC NO.10699。该金黄杆菌能够在较宽pH值范围以及较宽温度范围内高效去除吡啶甲酸,从而适用于实际吡啶甲酸工业废水中降解处理吡啶甲酸。本发明提供的金黄杆菌可作为生物菌制剂投加到现有的吡啶甲酸废水处理系统中,增强原处理系统的处理能力;本发明提供的金黄杆菌能够作为生物强化制剂应用于弱酸至弱碱性及较宽温度范围内的吡啶甲酸废水的好氧生物治理,在吡啶甲酸废水的处理中有着广阔的应用潜力。
进一步的,通过实验发现,本发明提供的金黄杆菌在pH=7、温度30℃、吡啶甲酸初始浓度≤800mg/L的条件下,能够完全降解吡啶甲酸;另外,在pH为3~7,吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源,温度30℃,且吡啶甲酸初始浓度≤200mg/L的条件下,该金黄杆菌能够完全降解吡啶甲酸;同时该金黄杆菌在温度范围为4~30℃,pH=7,吡啶甲酸浓度≤200mg/L的条件下,能够完全降解吡啶甲酸;并且该金黄杆菌在pH为3~7,温度范围为4~30℃,吡啶甲酸初始浓度≤200mg/L的条件下,能够完全降解吡啶甲酸。
保藏说明
本发明所述的高效降解吡啶甲酸的金黄杆菌进行了下述保藏:
保藏时间:2015年4月9日,保藏地点:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,CGMCC;保藏号为CGMCC NO.10699。
附图说明
图1是本发明提供的金黄杆菌在以吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源且吡啶甲酸初始浓度为100mg/L的琼脂固体培养基中的菌落形态特征:30℃下培养3天后,菌落为金黄色圆点,表面隆起、湿润、光滑,边缘整齐且半透明,容易挑起。
图2是本发明提供的金黄杆菌在以吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源(初始浓度100mg/L)的液体培养基、30℃下培养10h后的扫描电镜图,细胞为杆状,长度尺寸最大可达3.95μm。
图3是本发明提供的金黄杆菌在以吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源,pH为7、温度30℃、吡啶甲酸质量浓度为800mg/L的液体培养基中生长与吡啶甲酸降解曲线图。
图4是本发明提供的金黄杆菌在不同pH值下、温度30℃、吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源且吡啶甲酸初始浓度为200mg/L时,吡啶甲酸的降解曲线图。
图5是本发明提供的金黄杆菌在不同温度下、pH=7、吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源且吡啶甲酸初始浓度为200mg/L时,吡啶甲酸的降解曲线图。
图6是本发明提供的金黄杆菌在4℃、pH=3、吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源且吡啶甲酸初始浓度为200mg/L时,吡啶甲酸的降解紫外图。
具体实施方式
下面结合技术方案和附图对本发明进行进一步详细说明。
1、本发明提供的金黄杆菌,其筛选步骤如下:
从西安某医药厂的曝气池中采集好氧活性污泥样品,作为菌源进行驯化、培养。将50mL活性污泥,加入0.2%的焦磷酸钠作为解絮凝剂,在振荡器上振荡5~10min打碎活性污泥絮体后,取5mL活性污泥,加入含95mL无机盐培养基的摇瓶中,再加入吡啶甲酸作为唯一碳、氮、能源,其中吡啶甲酸的浓度为100mg/L,进行摇床培养,温度30℃、转速180r/min。无机盐培养基成分:Na2HPO4·12H2O,7g/L;KH2PO4,1g/L;CaCl2·2H2O,10mg/L;FeCl3,2mg/L;MgSO4·7H2O,20mg/L。当菌液变得混浊,吡啶甲酸检测不到,进行下一次转接;经过不断地驯化培养,最终得到以吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源的稳定菌液。将稳定菌液稀释,在以吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源的固体培养基上进行涂布。固体培养基成分:Na2HPO4·12H2O,7g/L;KH2PO4,1g/L;CaCl2·2H2O,10mg/L;FeCl3,2mg/L;MgSO4·7H2O,20mg/L;吡啶甲酸,100mg/L;琼脂2%。将该固体培养基放入光照培养箱中,30℃、培养4~5天,挑单菌落;分离筛选出一株以吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源的金黄杆菌;该菌株通过16S rDNA序列进行鉴定,于2015年4月9日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”,其保藏号为CGMCCNo.10699,分类命名为Chryseobacterium sp.。地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮编:100101。
该金黄杆菌的生长pH范围较宽,在3.0~7.0的pH范围内均有较好的生长,最适pH值为7.0;生长温度范围较宽,在4~30℃范围内具有较好的生长,最适温度为30℃;其形态特征:在以吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源的液体培养基,30℃下培养10h后,如图2所示,细胞为杆状,长度尺寸最大可达3.95μm;在以吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源的琼脂固体培养基上,30℃下培养3天后,如图1所示,菌落为金黄色圆点,表面隆起、湿润、光滑,边缘整齐且半透明,容易挑起。该金黄杆菌既可在富营养培养基LB中生长,也可在葡萄糖、蔗糖、淀粉等小分子有机物为唯一碳源的无机盐培养基中生长。
本发明提供的金黄杆菌的16S rDNA扩增:通过扩增该菌株的16S rDNA,得到了长度为1431bp的16S rDNA序列。PCR引物采用16S rDNA的通用引物27F(5’-AGT TTG ATC MTGGCT CAG-3’)和1492R(5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)。用PCR仪(AppliedBiosystems,2720thermal cycler)进行扩增反应。表1和2分别显示了PCR反应体系以及反应条件。
表1 PCR反应体系
表2反应条件
取PCR产物1μL进行1%琼脂糖凝胶电泳,用DNA回收试剂盒(SK8131胶回收试剂盒)回收目的片段,将PCR产物克隆到pGEM-T载体上,转化大肠杆菌感受态细胞。在Genbank中进行BLAST比对。用MEGA 5.1软件构建系统发育树,采用Neighbo-Joining法分析菌株亲缘关系(Bootstrap value=1000)。在Genbank中登录的序列号为KP900020,与Chryseobacterium sp.P9同源性达99%,推断该菌株属于金黄杆菌属(Chryseobacterium)。
2、制备金黄杆菌的细胞液体培养物:
挑取在吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源的固体培养基上的金黄杆菌单菌落,装入灭菌的以吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源的液体培养基中,其中吡啶甲酸的浓度为100mg/L,于30℃、pH=7.0、180r/min,进行好氧培养12~30小时,取培养好的菌液1mL接种在100mL含吡啶甲酸(200mg/L)的无机盐培养基中,30℃、pH=7.0、180r/min、进行好氧培养20小时,得到金黄杆菌的细胞液体培养物。
3、关于金黄杆菌对吡啶甲酸好氧降解的研究,其步骤如下:
[1]在250mL锥形瓶中加入90mL无机盐培养基,再加入800mg/L的吡啶甲酸作为唯一碳、氮、能源,121℃下灭菌;
[2]将制备好的10mL金黄杆菌的细胞液体培养物加入上述90mL培养基中,30℃、pH=7、180r/min,好氧培养,结果如图3所示。
图3是本发明提供的金黄杆菌在以吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源,pH为7、温度30℃、吡啶甲酸质量浓度为800mg/L的液体培养基中生长与吡啶甲酸降解曲线图,表明了金黄杆菌的生长与吡啶甲酸降解情况,图3中横坐标h表示时间,单位为小时,左侧纵坐标表示吡啶甲酸的浓度,单位为mg/L,右侧纵坐标表示菌体干重,单位为mg/L;—■—代表吡啶甲酸浓度,—□—代表菌体生长量。从图3中可以看出,金黄杆菌在pH为7、温度30℃、吡啶甲酸质量浓度≤800mg/L的条件下能够完全降解吡啶甲酸,因此能够作为生物强化制剂对吡啶甲酸浓度≤800mg/L的吡啶甲酸废水进行处理。
4、关于金黄杆菌在酸性条件下对吡啶甲酸好氧降解的研究,其步骤如下:
[1]分别配制pH值为2、3、5、7和8的无机盐培养基,加入200mg/L的吡啶甲酸作为唯一碳、氮、能源,121℃下灭菌;
[2]将制备好的10mL金黄杆菌的细胞液体培养物分别加入上述不同pH值的90mL培养基中,30℃、180r/min,好氧培养,结果如图4所示。
图4是本发明提供的金黄杆菌在不同pH值下,温度30℃,吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源且吡啶甲酸初始浓度为200mg/L时,吡啶甲酸的降解曲线图,表明了金黄杆菌在不同pH值下的生长与吡啶甲酸降解情况,图4中横坐标h表示时间,单位为小时,纵坐标表示吡啶甲酸的降解率,单位为%;—▼—代表pH=2,—■—代表pH=3,—□—代表pH=5,—○—代表pH=7,—●—代表pH=8。从图4中可以看出:金黄杆菌在pH值为3~7,温度30℃,吡啶甲酸浓度≤200mg/L的条件下能够完全降解吡啶甲酸,因此能够作为生物强化制剂对较宽pH值的吡啶甲酸废水进行降解处理。
5、关于金黄杆菌在低温下对吡啶甲酸好氧降解的研究,其步骤如下:
[1]在100mL的无机盐培养基中加入200mg/L的吡啶甲酸,121℃下灭菌;
[2]将制备好的10mL金黄杆菌的细胞液体培养物加入上述90mL培养基中,pH为7、0~40℃、180r/min,结果如图5所示。
图5是本发明提供的金黄杆菌在不同温度下,pH=7,吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源且吡啶甲酸初始浓度为200mg/L时,吡啶甲酸的降解曲线图,表明了金黄杆菌在低温下的生长与吡啶甲酸降解情况,图5中横坐标h表示时间,单位为小时,纵坐标表示吡啶甲酸的降解率,单位为%;—●—代表40℃,—○—代表30℃,—□—代表20℃,—■—代表4℃,—▼—代表0℃。从图5中可以看出:金黄杆菌在温度4~30℃,pH=7,吡啶甲酸浓度范围为50~200mg/L的条件下能够完全降解吡啶甲酸,因此能够作为生物强化制剂对较宽温度下的吡啶甲酸废水进行降解处理。
6、关于金黄杆菌在低温和酸度较高的条件下对吡啶甲酸好氧降解的研究,其步骤如下:
[1]在100mL的无机盐培养基中加入200mg/L的吡啶甲酸,121℃下灭菌;
[2]将制备好的10mL金黄杆菌的细胞液体培养物加入上述90mL的培养基中,pH为2~8、0~40℃、180r/min,结果如图6所示。
图6是本发明提供的金黄杆菌在4℃、pH=3,吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源且吡啶甲酸初始浓度为200mg/L时,吡啶甲酸的降解紫外图,表明了金黄杆菌在低温和酸度较高情况下的生长与吡啶甲酸降解情况;图6中的d表示时间,单位为天。从图6中可以看出,当吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源,温度4℃,pH为3时,金黄杆菌能够完全降解浓度≤200mg/L的吡啶甲酸。综上所述,金黄杆菌在温度4~30℃,pH为3~7,吡啶甲酸浓度≤200mg/L的条件下,能够完全降解吡啶甲酸,因此能够作为生物强化制剂对较低温度下,且酸度较高的吡啶甲酸废水进行降解处理。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例,并非对本发明作任何限制,凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变换,均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
Claims (8)
1.一株高效降解吡啶甲酸的金黄杆菌,其特征在于:其分类命名为Chryseobacteriumsp.,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC NO.10699。
2.权利要求1所述的高效降解吡啶甲酸的金黄杆菌在降解吡啶甲酸方面的应用。
3.权利要求1所述的高效降解吡啶甲酸的金黄杆菌在制备生物菌制剂或生物强化制剂方面的应用。
4.权利要求1所述的高效降解吡啶甲酸的金黄杆菌作为生物菌制剂或生物强化制剂在吡啶甲酸废水处理中的应用。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于:在吡啶甲酸为唯一碳源、氮源及能源、pH为7、温度为30℃的条件下,金黄杆菌能够对吡啶甲酸浓度≤800mg/L的废水进行降解。
6.如权利要求4所述的应用,其特征在于:在吡啶甲酸为唯一碳源、氮源及能源、温度为30℃、pH为3~7的条件下,金黄杆菌能够对吡啶甲酸浓度≤200mg/L的废水进行降解。
7.如权利要求4所述的应用,其特征在于:在吡啶甲酸为唯一碳源、氮源及能源、pH为7、温度为4~30℃的条件下,金黄杆菌能够对吡啶甲酸浓度≤200mg/L的废水进行降解。
8.如权利要求4所述的应用,其特征在于:在吡啶甲酸为唯一碳源、氮源及能源、温度为4~30℃、pH为3~7的条件下,金黄杆菌能够对吡啶甲酸浓度≤200mg/L的废水进行降解。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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