CN108658245A - 一种处理铅锌废水微生物絮凝剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种处理铅锌废水微生物絮凝剂的制备方法。（1）从铅锌污染的土壤中分离出有絮凝能力的菌株Chryseobacterium sp；（2）将单菌株接种于种子培养基中，制得种子培养液；（3）将步骤（2）所制得的种子培养液接种于发酵培养基中，培养，制得发酵培养液；（4）将步骤（3）所制得的发酵培养液离心，得到的上清液或上清液提取物即为微生物絮凝剂。本发明工艺简单、成本低，制得的絮凝剂对于铅锌废水的处理效果较好，且无二次污染。

Description

一种处理铅锌废水微生物絮凝剂的制备方法
技术领域
本发明属于废水处理技术领域，涉及一种铅锌废水的处理方法，特别是一种用于处理铅锌废水的微生物絮凝剂的制备方法。
背景技术
我国有色金属资源丰富，其中铅锌矿产居世界第三位，铅锌被应用于电气、石油、化工等行业，是重要的战略资源，污染环境，影响人们的身体健康。如铅在人和动物体内蓄积，不仅影响身体健康甚至会致命；锌的摄入，过量会造成肠胃不适，严重的对肝功能有一定程度的损害。
絮凝法在铅锌金属浮选选矿污水处理上被广泛应用。其中铝盐、铁盐及等无机絮凝剂有处理效果好，成本低的优点，但易造成二次污染且产生含有大量铝、铁的污泥处理难度大。此外，铝盐铝盐类中的铝离子与老年痴呆的病发有一定的关系；铁盐絮凝剂不仅使出水带有颜色，还具有较强的腐蚀性；因此无机絮凝剂不利于长期的使用。有机高分子絮凝剂如聚丙烯酰胺成本较高，而且在自然环境中难以自行降解，形成二次污染，所以有机絮凝剂的使用也受到一定程度上的制约。
微生物絮凝剂是一类由微生物产生的，具有良好絮凝活性的高分子物质。因其特定的结构和组成，使其具有安全、无毒、可生物降解和无二次污染的优点，并广泛应用于给水处理、城市生活污水处理和各类工业废水处理。
发明内容
本发明的目的是针对常规絮凝剂技术的不足，提供一种处理铅锌废水微生物絮凝剂的制备方法。
本发明从受污染的土壤中分离出对铅锌有一定抗性并且有絮凝能力的产絮微生物，用于含铅锌废水的处理；经16sRNA鉴定该细菌与Chryseobacterium sp.同源性为99%，命名为Chryseobacterium sp. ZW5。
具体步骤为：
（1）在受铅锌污染的土壤中筛选出具有絮凝能力的最强菌株，菌株经16sRNA鉴定与Chryseobacterium sp.同源性为99%，命名为Chryseobacterium sp. ZW5。
（2）将3.0~5.0 g牛肉膏、5.0~10.0 g蛋白胨、5.0 g氯化钠和1 L蒸馏水混合，并将所得溶液pH值调至7.0~7.5之间，制得种子培养基。
（3）将步骤（1）所选菌株接种于步骤（2）所得种子培养基中，在温度为30 ℃条件下，培养24~48 小时，制得种子培养液。
（4）将15.0~30.0 g葡萄糖、1.0~3.0 g磷酸二氢钾、2.0~5.0 g磷酸氢二钾、0.1~0.5 g硫酸铵、0.1~0.5 g氯化钠、0.5~1.0 g尿素、0.5~1.0 g酵母膏和0.2~1.0 g硫酸镁和1L蒸馏水混合，并将所得溶液pH值调至6.0~7.0之间，制得发酵培养基。
（5）将步骤（3）所制得的种子培养液以质量百分比浓度为0.5~5%的接种量接种于步骤（4）所得发酵培养基中，在温度为25~35 ℃、转速为120~200 r/min条件下，培养24~36小时，即制得发酵培养液。
（6）将步骤（5）所制得的发酵培养液放入高速冷冻离心机内，在0~4 ℃条件下以8000~12000 r/min离心15~20 分钟得到上清液，向上清液加入2~4倍体积的预冷的无水乙醇，在4 ℃冰箱静止12~24小时，然后再放入高速冷冻离心机内，在0~4 ℃条件下以6000~8000 r/min离心10~15分钟，倒掉上清液，将沉淀再放入无水乙醇中，在以与第二次相同条件下离心，然后将沉淀物冷冻干燥，即得提取物质即Chryseobacterium sp. ZW5微生物絮凝剂。
将微生物絮凝剂用于铅锌废水处理：Pb2+的浓度为30 mg/L，Zn2+的浓度为20 mg/L；将所述微生物絮凝剂直接投加到铅锌废水中，投放量为每100 mL废水投放1~3 mL。
本发明工艺简单、成本低，制得的絮凝剂对于铅锌废水的处理效果较好，且无二次污染。
附图说明
图1为本发明实施例所制得的Chryseobacterium sp. ZW5微生物絮凝剂红外光谱图（FI-IR）。
图2为本发明实施例Chryseobacterium sp. ZW5微生物絮凝剂对于高岭土处理前后的扫描电子显微镜镜检图。其中a: 为用絮凝前高岭土颗粒的电镜图；b: 为用絮凝后高岭土颗粒的电镜图。
图3为本发明实施例不同投加量条件下，Chryseobacterium sp. ZW5微生物絮凝剂对于铅锌废水处理效率的变化。
图4为本发明实施例不同pH值条件下，Chryseobacterium sp. ZW5微生物絮凝剂对于铅锌废水处理效率的变化。
图5为本发明实施例不同铅锌重金属浓度条件下，所产Chryseobacterium sp.ZW5微生物絮凝剂絮凝率的变化。
具体实施方式
实施例：
一、Chryseobacterium sp. ZW5微生物絮凝剂的制备
（1）分离培养基：
牛肉膏蛋白胨培养基：3.0 g牛肉膏，10.0 g蛋白胨，5.0 g氯化钠，20.0 g琼脂，1 L蒸馏水，pH =7.0；
LB（Luria-Bertani）培养基：10.0 g蛋白胨，5.0 g酵母膏，6 g氯化钠，20.0 g琼脂，1 L蒸馏水，pH =7.0。
（2）发酵培养基：将20.0 g葡萄糖、2.0 g磷酸二氢钾、5.0 g磷酸氢二钾、0.2 g硫酸铵、0.1 g氯化钠、0.5 g尿素、0.5 g酵母膏、0.2 g硫酸镁和1 L蒸馏水混合，并将所得溶液pH值调为7.0。
（3）种子培养基：将3.0 g牛肉膏、5.0 g蛋白胨、5.0 g氯化钠和1 L蒸馏水混合，并将所得溶液pH值调为7.0。
（4）菌源准备：土壤采于桂林阳朔县思的村受铅锌污染土壤，在受污染的重、中、轻三个区域随机采集深度为5~10 cm土壤。
（5）将90 mL无菌水装入带有少量玻璃珠的无菌锥形瓶中，再称取10 g受铅锌污染土样加入其中，放入200 r/min的摇床中水平震荡20分钟，使水与土壤充分混匀，将细菌分散，即成体积百分比浓度为10%的土壤悬液。将该土壤悬液取出1 mL放入装有9 mL无菌水的离心管中，充分摇匀，即成体积百分比浓度为1%的土壤悬液，并以同样的方法逐级稀释成体积百分比浓度为0.1%~0.0001%浓度梯度的稀释液。
（6）分别取体积百分比浓度为0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%浓度梯度的稀释液，分别用经灭菌移液枪取0.1 mL稀释液分别放在牛肉膏蛋白胨平板培养基和LB平板培养基中心，后用涂布器涂布均匀，每个浓度梯度做三个平行样；涂布结束后将培养皿倒置，置于30℃恒温培养箱中培养72小时。
（7）将步骤（6）培养后生长出的单株菌落用接种环分别挑取少量细胞划线接种到与分离培养基成分对应的平板培养基，并于30 ℃恒温培养，培养72小时，观察菌落的形态特征是否相同，若发现有杂菌存在，则需进一步进行分离纯化，直至获得纯的菌落。将分离得到的纯菌株接种到试管斜面上，于30℃恒温培养，待长出菌落后放置于4 ℃冰箱下保存备用。
（8）初选：将分离到的纯种菌种接种到步骤（2）所得发酵培养基中，置于温度30℃转速为180 r/min的振荡培养箱内振荡培育48小时。再取浓度为4 g/L的高岭土悬液40 mL加入50 mL离心管中，加入培养好的发酵培养；并在摇床上以150 r/min振荡5分钟后静置10分钟观察是否有絮体产生，若发现有絮体团状物则表示该发酵液可以产生有絮凝作用的成分。
（9）复选：将初选出来的四株有絮凝能力的细菌接种到步骤（3）所得种子培养基，培养24小时后，以体积百分比浓度为1%的接种量将种子培养基接种步骤（2）所得发酵培养基中，置于温度30 ℃，转速为180r/min的振荡培养箱内振荡培育48 小时后，将3 mL发酵液置于浓度为4 g/L高岭土悬浊液的混凝搅拌机中，将2 mL质量百分比浓度为3% 的CaC12溶液加入其中，调节pH为7.0，先以200 r/min搅拌30秒，然后以转速为60 r/min搅拌4分钟后，静置10分钟取液面下2 cm左右处的水样在波长为550 nm的紫外分光光度计上测吸光值，并以加入CaC12溶液但不加絮凝剂的高岭土悬浮液作为空白对照组，计算其絮凝活性。公式如下所示：
其中：A——是空白对照组在波长为550 nm处的吸光值；
B——是待测样品在波长为550 nm处的吸光度；
C——为样品相对高岭土悬浮液的絮凝率。
重复测定三次絮凝率，取三次数据的平均值，最后由公式计算出样品絮凝率。选出最佳絮凝能力最强的菌株。
（10）将步骤（9）所选菌株接种于步骤（2）所得种子培养基中，在温度为30 ℃条件下，培养36 小时，制得种子培养液。
（11）将步骤（10）所制得的种子培养液以体积百分比浓度为3%的接种量接种于步骤（3）所得发酵培养基中，在温度为30 ℃条件下，转速为180 r/min的振荡培养箱内振荡培养36 小时，即制得发酵培养液。
（12）将步骤（11）所制得的发酵培养液放入高速冷冻离心机内，在4℃条件下以8000 r/min离心15分钟得到上清液，向上清液加入两倍体积的预冷的无水乙醇，在4 ℃冰箱静止12小时，然后再放入高速冷冻离心机内，在4℃条件下以6000 r/min离心15分钟，倒掉上清液，将沉淀再放入无水乙醇中，在以与第二次相同条件下离心，然后将沉淀物冷冻干燥，即得提取物质即Chryseobacterium sp. ZW5微生物絮凝剂。称重后，1 L发酵液能生产约1.25g微生物絮凝剂。图1为所制得的Chryseobacterium sp. ZW5微生物絮凝剂红外光谱图（FI-IR）。Chryseobacterium sp. ZW5微生物絮凝剂对高岭土处理前后扫描电子显微镜镜检图，如图2所示。
二、Chryseobacterium sp. ZW5微生物絮凝剂对铅锌废水的处理
（1）最佳投药量实验：制备Pb2+的浓度为30 mg/L，Zn2+的浓度为20 mg/L，pH值为7的废水；放入250 mL的烧杯中。分别量取1、2、3、4、5、6 mL的Chryseobacterium sp. ZW5微生物絮凝剂加入废水样品中先以200 r/min搅拌40秒，然后以转速为60 r/min搅拌4 分钟后，静置10分钟，取液面下2 cm左右处的水样，用原子火焰法测其处理后水中的浓度，并计算絮凝率。絮凝效果如图3所示。
（2）pH值对絮凝效果的影响：
用HCl和NaOH溶液将制备的废水调其pH值为4、5、6、7、8、9、10，在投加量为4 mL，搅拌条件与上述条件相同，絮凝后测定其絮凝率。絮凝效果如图4所示。
三、铅锌重金属对产絮菌产Chryseobacterium sp. ZW5微生物絮凝剂的影响
将上述选出来絮凝能力最强的菌株的种子培养基以体积百分比浓度为1%的接种量分别接种到含有Pb2+、Zn2+浓度都为0、5、10、15、20 mg/L的发酵培养液，置于温度为30 ℃条件下，转速为180 r/min的振荡培养箱内振荡培养36小时后，将3 mL发酵液置于浓度为4 g/L高岭土悬浊液的混凝搅拌机中，将2 mL质量百分比浓度为3% 的CaC12溶液加入其中，调节pH为7.0，先以200 r/min搅拌30秒，然后以转速为60 r/min搅拌4 分钟后，静置10分钟取液面下2 cm左右处的水样在波长为550 nm的紫外分光光度计上测吸光值，并以加入CaC12溶液但不加絮凝剂的高岭土悬浮液作为空白对照组，计算其絮凝活性。公式如下所示：
其中：A——是空白对照组在波长为550 nm处的吸光值；
B——是待测样品在波长为550 nm处的吸光度；
C——为样品相对高岭土悬浮液的絮凝率。
结果如图5所示，本发明的产絮菌生产Chryseobacterium sp. ZW5微生物絮凝剂过程受铅锌离子的影响不大，说明该菌株能在含铅锌重金属废水中正常产絮凝剂，保证对铅锌废水的处理效果。

Claims (2)

1.一种处理铅锌废水微生物絮凝剂的制备方法，其特征在于具体步骤为：
（1）在受铅锌污染的土壤中筛选出絮凝能力最强的菌株，菌株经16sRNA鉴定与Chryseobacterium sp.同源性为99%，命名为Chryseobacterium sp. ZW5；
（2）将3.0~5.0 g牛肉膏、5.0~10.0 g蛋白胨、5.0 g氯化钠和1 L蒸馏水混合，并将所得溶液pH值调至7.0~7.5之间，制得种子培养基；
（3）将步骤（1）所选菌株接种于步骤（2）所得种子培养基中，在温度为30 ℃条件下，培养24~48 小时，制得种子培养液；
（4）将15.0~30.0 g葡萄糖、1.0~3.0 g磷酸二氢钾、2.0~5.0 g磷酸氢二钾、0.1~0.5 g硫酸铵、0.1~0.5 g氯化钠、0.5~1.0 g尿素、0.5~1.0 g酵母膏和0.2~1.0 g硫酸镁和1 L蒸馏水混合，并将所得溶液pH值调至6.0~7.0之间，制得发酵培养基；
（5）将步骤（3）所制得的种子培养液以质量百分比浓度为0.5~5%的接种量接种于步骤（4）所得发酵培养基中，在温度为25~35℃、转速为120~200 r/min条件下，培养24~36 小时，即制得发酵培养液；
（6）将步骤（5）所制得的发酵培养液在0~4 ℃条件下以8000~12000 r/min离心15~20分钟得到上清液，向上清液加入2~4倍体积的预冷的无水乙醇，在4 ℃冰箱静止12~24小时，然后在0~4 ℃条件下以6000~8000 r/min离心10~15分钟，倒掉上清液，将沉淀再放入无水乙醇中，在以与第二次相同条件下离心，然后将沉淀物冷冻干燥，所得提取物质即微生物絮凝剂。
2.根据权利要求1所述的微生物絮凝剂的应用，其特征在于所述微生物絮凝剂应用于铅锌废水的处理。
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