CN101974445A

CN101974445A - 高分子量多环芳烃降解菌株及其混合菌系

Info

Publication number: CN101974445A
Application number: CN 201010187985
Authority: CN
Inventors: 王红旗; 李晓斌; 孙寓姣
Original assignee: Beijing Normal University
Current assignee: Beijing Normal University
Priority date: 2010-05-26
Filing date: 2010-05-26
Publication date: 2011-02-16
Anticipated expiration: 2030-05-26
Also published as: CN101974445B

Abstract

本发明涉及四种高分子量多环芳烃高效降解菌株以及其混合菌系，该四种菌株包括Methylobacterium sp.lxb-3、Burkholderia sp.lxb-5、Rhodococcussp.lxb-6和Phyllobacterium sp.lxb-9四株纯菌，保藏编号分别为CGMCCNo.3713，CGMCC No.3714，CGMCC No.3715，CGMCC No.3716。本发明还涉及该高分子量多环芳烃降解菌系在土壤或废水的生物处理和环境污染修复的应用。利用本发明的菌可实现对五种高分子量PAHs的有效降解，利用该混合菌系可实现对高分子量PAHs的高效降解，并且该菌系在受污染的土壤或水体中可有效实施修复。

Description

高分子量多环芳烃降解菌株及其混合菌系

技术领域

本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及高分子量多环芳烃降解菌株及其混合菌系，本发明还涉及该些菌株以及其混合菌系的应用。

背景技术

多环芳烃(PAHs)是一种由两个或两个以上的苯环以线状、角状和簇状排列的稠环型化合物。由于多环芳烃具有毒性、生物蓄积性和半挥发性，并能在环境中持久存在，被列入典型持久性有机污染物(POPs)，受到国际上科学界的广泛关注。PAHs在其生成、迁移、转化和降解过程中，通过呼吸道、皮肤、消化道进入人体，极大地威胁着人类的健康。微生物降解被认为是PAHs污染土壤修复的重要途径，具有成本低、效率高、不易造成二次污染等优点。但PAHs随着分子量的增加，其水溶性急剧减小，毒性也越来越高，研究发现苯环数量越多越难被微生物所降解利用。从受污染的地区土壤中筛选分离出PAHs的降解优势菌株，再将其投回到污染环境，是进行修复多环芳烃污染土壤的关键环节。

近几年随着城市化进程发展迅速，许多城市的发展极为迅速，原先位于郊区的一些化工类企业周围都逐渐成为人口聚集的市区，例如北京市在最近几年将五环内的工业企业都进行了搬迁，这些工业用地都将进行二次开发转变为居住、商业或娱乐用地，但由于其过去生产过程中的废水、废渣及化学品的影响，其厂区或附近区域的土壤受到了严重的污染，在开发过程或开发后带来了一系列环境和健康风险问题，因此，有必要对其污染进行必要的评估和修复。调查研究发现，焦化煤气、有机化工、石油工业、炼钢炼铁等工业所排放的废弃物中有相当高浓度的多环芳烃，其中焦化厂是多环芳烃污染排放最严重的一类企业。

近年来，能够降解低分子量PAHs的微生物被大量报道，如假单胞菌属、分枝杆菌属、芽孢杆菌属等，但关于高分子量PAHs降解菌的报道还相对较少。事实上，环境中PAHs通常以多种组分同时存在，呈现为复合污染现象，其中包含大量难降解的高分子量PAHs，因此，筛选能同时降解多种高分子量PAHs的微生物具有十分重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有的降解高分子量多环芳烃存在的难题，提供一种高效的降解菌系及其应用，主要是在土壤或废水的生物处理和环境污染修复中用于降解高分子量多环芳烃的应用。

本发明所提供的降解菌系从受多环芳烃污染的土壤中经过人工富集培养、分离纯化得到，来源于北京焦化厂厂区内受多环芳烃污染的土壤。

该混合菌系包括四株不同种属的纯菌Methylobacterium sp.lxb-3、Burkholderia sp.lxb-5、Rhodococcus sp.lxb-6、Phyllobacterium sp.lxb-9。

其中，Methylobacterium sp.lxb-3为甲基杆菌属，在牛肉膏蛋白胨平板上菌落较小，呈淡粉色，表面光滑不透明，边缘整齐；其16S rDNA的GenBank登录号为GQ249213，序列如SEQ ID NO：1所示；该菌株于2010年4月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)保藏，编号为CGMCCNo.3713，其分类学命名为甲基杆菌(Methylobacterium sp.)。

Burkholderia sp.lxb-5为伯克霍尔德氏菌属，在牛肉膏蛋白胨平板上菌落呈白色，半透明，边缘不整齐，不易挑取；其16S rDNA的GenBank登录号为GQ249215，序列如SEQ ID NO：2所示；该菌株于2010年4月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC No.3714，其分类学命名为伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)。

Rhodococcus sp.lxb-6为红球菌属，在牛肉膏蛋白胨平板上菌落呈红色，边缘整齐，菌落较大，湿润；其16S rDNA的GenBank登录号为GQ249216，序列如SEQ ID NO：3所示；该菌株于2010年4月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC No.3715，其分类学命名为红球菌(Rhodococcus sp.)。

Phyllobacterium sp.lxb-9为叶杆菌属，在牛肉膏蛋白胨平板上菌落呈乳白色，不透明，边缘整齐；其16S rDNA的GenBank登录号为GQ249219，序列如SEQ ID NO：4所示；该菌株于2010年4月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC No.3716，其分类学命名为叶杆菌(Phyllobacterium sp.)。

该四株单菌均对五种高分子量多环芳烃，即苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘和茚并[1，2，3-cd]芘具有降解作用。

包括该四株单菌的混合菌系对这五种PAHs有更好的降解效果，其中Methylobacterium sp.lxb-3、Burkholderia sp.lxb-5、Rhodococcus sp.lxb-6和Phyllobacterium sp.lxb-9四株纯菌的混合比例可优选1～2∶1～2∶1～2∶1～2，更优选1∶1∶1∶1。

该混合菌系的制备方法包括：将Methylobacterium sp.lxb-3、Burkholderiasp.lxb-5、Rhodococcus sp.lxb-6和Phyllobacterium sp.lxb-9分别接种至牛肉膏蛋白胨液体培养至对数期，离心后弃去上清液，加入磷酸盐缓冲液洗涤，再次离心后弃上清液，收获菌体，然后将四种菌悬液混合制得菌系。

该混合菌系在土壤中的最适宜降解条件为：温度20～30℃，土壤含水率15％～35％，营养盐比例(C∶N∶P)为100～120∶10∶1。

该混合菌系还有较强的环境适应能力，可用于修复受高分子量PAHs污染的土壤或水体。

附图说明

图1为菌系BJH1对土壤中PAHs的降解率。

具体实施方式

实施例1Methylobacterium sp.lxb-3、Burkholderia sp.lxb-5、Rhodococcussp.lxb-6、Phyllobacterium sp.lxb-9的分离与降解高分子量PAHs的性能

现场采集北京焦化厂厂区内某车间附近受PAHs污染较严重处土壤，称取10g新鲜土壤样品，加入装有100ml无机盐液体培养基中，在室温下振荡一周，取10mL土壤溶液转接至新鲜的含PAHs的选择性无机盐培养基中。驯化时采用定时定量转接、间歇式逐步提高PAHs浓度的方法(苯并[a]芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、茚并[1，2，3-cd]芘的初始浓度均为1mg·L^-1)，室温下150rpm培养一周，按10％的接种量转接到新鲜的选择性无机盐培养基中，每转接一次，各PAHs的浓度提高1mg·L^-1，如此反复5次，最后各PAHs的浓度提高至5mg·L^-1。

无机盐培养基(MSM)成分：KH₂PO₄ 5.5g、K₂HPO₄ 6.0g、KCl 2.0g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、Na₂SO₄ 2.0g、微量金属盐1.0ml(MnSO₄ 39.9mg，ZnSO₄·H₂O 42.8mg，(NH₄)MoO₂₄·4H₂O 34.7mg，蒸馏水1000ml)、琼脂15g(固体培养基)、蒸馏水1000ml、pH7.0。

经过五个阶段的培养驯化，将驯化的最后一阶段的培养液稀释至不同的梯度，涂布于表面涂有该五种PAHs的选择性无机盐固体培养基平板上，培养后挑取单菌落至牛肉膏蛋白胨固体平板，经反复划线分离得到多株纯菌，纯菌经过接种至液体培养基中验证其降解五种高分子量PAHs的能力，最终得到四株高分子量PAHs的降解菌lxb-3、lxb-5、lxb-6、lxb-9。经过16S rDNA鉴定，菌株lxb-3属于甲基杆菌属(Methylobacterium sp.)，lxb-5属于伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp.)，lxb-6属于红球菌属(Rhodococcus sp.)，lxb-9属于叶杆菌属(Phyllobacterium sp.)。

牛肉膏蛋白胨固体培养基成分：牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、琼脂15g、蒸馏水1000ml、pH7.0。

将Methylobacterium sp.lxb-3、Burkholderia sp.lxb-5、Rhodococcussp.lxb-6、Phyllobacterium sp.lxb-9分别接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基培养至对数期，离心后弃去上清液，加入20ml磷酸盐缓冲液洗涤2次，再次离心后弃去上清液，收获菌体，将其菌悬液在600纳米的吸光度值(OD₆₀₀)均调整成为0.5-1之间的数值，以使四种菌悬液中的菌浓度达到几乎相同的数量级。此处的浓度并没有限制，将四种菌悬液调整成近似浓度，仅仅是为了方便菌系的配制。将所得纯菌种的菌悬液分别接种于含苯并[a]芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、茚并[1，2，3-cd]芘的MSM液体培养基中，接种量为10％，每个测定设两个重复，同时做对照样只加PAHs不加菌液。培养基中茚并[1，2，3-cd]芘的初始浓度为2mg·L^-1，苯并[a]芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽的初始浓度为3mg·L^-1。摇瓶避光振荡培养12天后测试残余PAHs的浓度，计算降解率。降解率测试结果见表1。

将摇瓶中的整瓶样品进行提取残留的多环芳烃，加入等体积的丙酮和二氯甲烷溶液(体积比为1∶1)，用超声波清洗器超声萃取20min，静置分层后用分液漏斗进行分离有机相，共萃取两次后，合并萃取液并用旋转蒸发仪浓缩，用甲醇定容至1mL，过滤后待HPLC测定。分析仪器为德国戴安公司U3000液相色谱仪(配有自动进样器)，采用多环芳烃专用液相色谱分析柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇/水(90∶10)，流速为1mL·min^-1，检测波长254nm，柱温30℃，进样体积为20μL。

表1各菌株对五种高分子量PAHs的12天降解率

本实施例说明分离所得的四株高效PAHs降解菌Methylobacteriumsp.lxb-3、Burkholderia sp.lxb-5、Rhodococcus sp.lxb-6、Phyllobacterium sp.lxb-9可以利用五种高分子量的多环芳烃苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘和茚并[1，2，3-cd]芘为唯一碳源和能源进行生长繁殖，并且具有同时降解五种高分子量PAHs的能力。

实施例2混合菌系的构建和降解高分子量PAHs的性能

试验1

将Methylobacterium sp.lxb-3、Burkholderia sp.lxb-5、Rhodococcussp.lxb-6、Phyllobacterium sp.lxb-9按照实施例1的方法制备菌悬液，并按照体积比1∶1∶1∶1的比例将Methylobacterium sp.lxb-3、Burkholderia sp.lxb-5、Rhodococcus sp.lxb-6和Phyllobacterium sp.lxb-9菌悬液混合，组合构建混合菌系BJH1，以10％的接种量将混合菌系BJH1的菌悬液接种至含五种高分子量PAHs的无机盐培养基中，苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘和茚并[1，2，3-cd]芘的初始浓度设为3mg/L，室温下摇瓶避光振荡12天后测定其降解率，降解率测试结果表明，混合菌系BJH1对五种高分子量PAHs(苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘和茚并[1，2，3-cd]芘)的降解率分别可达49.86％、47.54％、35.56％、44.23％、39.85％，相对于单菌的降解率均有较大的提高；该菌系对五种高分子量PAHs30天之后降解率分别可达68.32％、70.35％、68.89％、68.29％、69.37％。

试验2

用同样的方法构建混合菌系BJH2，并用同样的方法测试其降解率，不同的是Methylobacterium sp.lxb-3、Burkholderia sp.lxb-5、Rhodococcussp.lxb-6、Phyllobacterium sp.lxb-9菌悬液的混合体积比为1∶2∶2∶1。

试验3

用同样的方法构建混合菌系BJH3，并用同样的方法测试其降解率，不同的是Methylobacterium sp.lxb-3、Burkholderia sp.lxb-5、Rhodococcussp.lxb-6、Phyllobacterium sp.lxb-9菌悬液的混合体积比为2∶1∶1∶2。

三种混合菌系BJH1、BJH2、BJH3对五种高分子量PAHs的12天降解率对比如表2所示。

表2三种混合菌系BJH1、BJH2、BJH3对五种高分子量PAHs的12天降解率

注：BJH1中lxb-3、lxb-5、lxb-6、lxb-9的接种比例为1∶1∶1∶1；BJH2的接种比例为1∶2∶2∶1；BJH3的接种比例为2∶1∶1∶2；

以上试验和数据说明，构建所得的混合菌系可同时降解五种高分子量PAHs，具有更高的降解效率，并且四种细菌之间产生了协同作用，比单独使用单个细菌的效果要好。

实施例3混合菌系BJH1对污染土壤的适宜降解条件

实验土样取自北京焦化厂的污染原状土，将土样过筛后风干并混合均匀，经测试该土壤样品中16种PAHs均有检出。本实验选取了温度、土壤含水率、营养盐比例(C∶N∶P)、表面活性剂、Fenton试剂及植物油等因素，采用正交实验的方法对适宜降解的土壤环境条件和措施进行研究，分别在第14、28、52天取样进行土壤中PAHs残留量的测试，计算降解率。

准确称量2.0g冷冻干燥后的土壤样品于玻璃离心管中，加入2.0g无水硫酸钠和20mL丙酮与二氯甲烷(体积比为1∶1)，超声萃取30min，3000r/min 离心10min，如此反复萃取三次，合并萃取液；将萃取液在控制水温为36℃的旋转蒸发仪中浓缩至干，加入10mL环己烷溶解，过硅胶萃取柱净化后，用10mL正己烷与二氯甲烷(体积比为1∶1)混合液洗脱，收集洗脱液；用氮吹仪吹干并用色谱级甲醇定容至2mL，经0.45μm孔径滤膜过滤后装入进样瓶待HPLC测定。实验结果如图1所示。

经过52天的培养，菌系BJH1的最适宜降解条件为：接种量20％，温度30℃，土壤含水率15％，C∶N∶P为120∶10∶1，表面活性剂为1000mg/kg，Fenton试剂和植物油为0。

在培养14天后，菌系BJH1对土壤中三环及三环以下PAHs的降解率为64.02％，对四环及四环以上的高分子量PAHs的降解率为60.91％。经过28天的培养后，菌系BJH1对土壤中三环及三环以下PAHs的降解率为75.10％，对四环及四环以上的高分子量PAHs的降解率为80.55％；经过52天的培养后，菌系BJH1对土壤中三环及三环以下PAHs的降解率为79.17％，对四环及四环以上的高分子量PAHs的降解率为80.24％。

本实施例说明菌系BJH1对土壤中的PAHs具有较高的降解效率，降解底物范围广，不仅对低环的PAHs(如萘、菲、蒽、荧蒽、苊、芴等)具有较高的降解率，对高环的PAHs(如芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、二苯并[a，n]蒽、茚并[1，2，3-cd]芘等)也具有较高的降解率。

序列表

Methylobacterium sp.lxb-3菌16S rDNA序列SEQ ID NO：1：

(GenBank登录号为：GQ249213)

1 agaggggcta catcagtcga cgggcccttg gggtcagcgg tggagggtga tacgcgtggg

61 acgtgccttc tggttcggaa taaccctggg aaactagggc taataccgga tacccccttt

121 tggggaaagg tttactgccg gaagatctgc ccgcgtctga ttagttagtt gggggggtaa

181 cggcctacca aggcgactat cagtacctgg cctgagagga tgatcagcca cactgggact

241 gagacacggc ccacactcct gcgggaggca gcggtgggga atattggaca atgggcgcaa

301 gcctgatcca gccatgccgc gggagtgatg aaggccttag ggttgtaaag ctcttttatc

361 cgggacgata atgacggtcc ggaggaataa gccccggtta acttctggcc agcggccgcg

421 gtaatacgaa gggggctagc gttgctctca atcactgggc gtaaagggcg cgtaggcggc

481 gttttaagtc gggggtgaaa gcctgtggct caaccacaga atggccttcg atactgggac

541 gcttgagtat ggtagaggtt ggtggaactg cgagtgtaga ggtgaaattc gtagatattc

601 gcaagaacac cggtggcgaa ggcggccaac tggaccatca ctgacgctga ggcgcgaaag

661 cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgaatgccag

721 ctgttggggt gcttgcaccg cagtagcgca gctaacgctt tgagcattcc gcctggggag

781 tacggtcgca agattaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat

841 gtggtttaat tcgaagcaac gcgcagaacc ttaccatcct ttgacatggc gtgttaccca

901 gagagatctg gggtcccctt cgggggcgtg cacccaggtg ctgcatggct gttgtcagct

961 cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccacgtcc ttagttgcca

1021 tcattcagtt gggcactcta gggagactgc cggtgataag ccgcgaggaa ggtgtggatg

1081 acgtcaagtc ctcatggccc ttacgggatg ggctacaccc gtgctacaat ggcggtgaca

1141 gtgggaggcg aaggagcgat atggagcaaa tccccaaaag ccgtctcagt tcggattgca

1201 ctctgcaact cgagtgcatg aaggcggaat cgctagtaat cgtggatcag catgccccgg

1261 tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcaccc catgggagtt gtcttacccg

1321 acgccgctgc gccaacccca gaggagcgcc acgatactcc

Burkholderia sp.lxb-5菌16S rDNA序列SEQ ID NO：2：

(GenBank登录号为：GQ249215)

1 tatcttccat gcagtcgacg gcagcacggg ggcaaccctg gtggcgagtg gcgaacgggt

61 gagtaataca tcggaacgtg tcctgtagtg ggggatagcc cggcgaaagc cggattaata

121 ccgcatacgc tctacggagg aaaggggggg atcttaggac ctcccgctac aggggcggcc

181 gatggcagat tagctagttg gtggggtaaa ggcctaccaa ggcgacgatc tgtagctggt

241 ctgagaggac gaccagccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag

301 cagtggggaa ttttggacaa tgggggcaac cctgatccag caatgccgcg tgtgtgaaga

361 aggccttcgg gttgtaaagc acttttgtcc ggaaagaaaa cgccgtggtt aatacccgtg

421 gcggatgacg gtaccggaag aataagcacc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat

481 acgtagggtg caagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa gcgtgcgcag gcggtccgct

541 aagacagatg tgaaatcccc gggcttaacc tgggaactgc atttgtgact ggcgggctag

601 agtatggcag aggggggtag aattccacgt gtagcagtga aatgcgtaga gatgtggagg

661 aataccgatg gcgaaggcag ccccctgggc caatactgac gctcatgcac gaaagcgtgg

721 ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgcccta aacgatgtca actagttgtc

781 gggtcttcat tgacttggta acgtagctaa cgcgtgaagt tgaccgcctg gggagtacgg

841 tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg gggacccgca caagcggtgg atgatgtgga

901 ttaattcgat gcaacgcgaa aaaccttacc tacccttgac atgtatggaa tcctgctgag

961 aggtgggagt gcccgaaagg gagccataac acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt

1021 gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgtcccta gttgctacgc

1081 aagagcactc tagggagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaagt

1141 cctcatggcc cttatgggta gggcttcaca cgtcatacaa tggtcggaac agagggtcgc

1201 caacccgcga gggggagcca atcccagaaa accgatcgta gtccggatcg cactctgcaa

1261 ctcgagtgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg

1321 ttcccgggtc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag tgggttttac cagaagtggc

1381 tagtcaaccg cagagacgtc acacgagtag g

Rhodococcus sp.lxb-6菌16S rDNA序列SEQ ID NO：3：

(GenBank登录号为：GQ249216)

1 tagtcttctt tggttacaat cggttaacgg gtgattaaca cgtgggtgat ctgctctgca

61 ctctgggata agcctgggaa actgggtcta ataccggata tgacctttcc atgcatgtgg

121 ggtggtggaa agatttatcg gtgcaggatg ggcccgcggc ctatcagctt gttggtgggg

181 taatggccta ccaaggcgac gacgggtagc cgacctgaga gggtgaccgg ccacactggg

241 actgagacac ggcccatact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg

301 gaagcctgat gcagcgacgc cgcgtgaggg atgaaggcct tcgggttgta aacctctttc

361 agcagggact aagcgtgagt gacggtacct gcttaacaag caccggctaa ctacctgcca

421 ccagccgcgg caatacctag ggtgcgagcg ttgtccggaa ttactgggcg taaagagttc

481 gtaggcggtt tgtcccgtcg tttgtgaaaa cccggggctc aacttctggc ttgcaggcga

541 tacgggcaga cttcagtgtt tcaggggaga ctggaattcc tggtgtagcg gtgaaatgcg

601 cagatatcag gaggaacacc ggtggcgaag gcgggtctct gggaaacaac tgacgctgag

661 gaacgaaagc gtgggtagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacggt

721 gggcgctagg tgtgggttcc ttccacggga tctgtgccgt agctaacgca ttaagcgccc

781 cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag

841 cggcggagca tgtggattaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctggg tttgacatac

901 accagacagc tgtagagata cggtttccct tgtggttggt gtacaggtgg tgcatggctg

961 tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgtctt

1021 atgttgccag cacgtgatgg tggggactcg taagagactg ccggggtcaa ctcggaggaa

1081 ggtggggacg acgtcaagtc atcatgcccc ttatgtccag ggcttcacac atgctacaat

1141 ggccagtaca gagggctgcg agaccgtgag gtggagcgaa tcccttaaag ctggtctcag

1201 ttcggatcgg ggtctgcaac tcgaccccgt gaagtcggag tcgctagtaa tcgcagatca

1261 gcaacgctgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac gtcatgaaag

1321 tcggtaacac ccgaagccgg tggcctaacc cctttggagg agcctcgatg tt

Phyllobacterium sp.lxb-9菌16S rDNA序列SEQ ID NO：4：

(GenBank登录号为：GQ249219)

1 agcgccccgc aggggagcgg cagacgggtg agtaacgcgt gggaatctac cttttgctac

61 ggaataactc agggaaactt gtgctaatac cgtatgtgcc cttcggggga aagatttatc

121 ggcaaaggat gagcccgcgt tggattagct agttggtgag gtaaaggctc accaaggcga

181 cgatccatag ctggtctgag aggatgatca gccacactgg gactgagaca cggcccagac

241 tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc gcaagcctga tccagccatg

301 ccgcgtgagt gatgaaggcc ctagggttgt aaagctcttt caacggtgaa gataatgacg

361 gtaaccgtag aagaagcccc ggctaacttc gtgccagcag ccgcggtaat acgaaggggg

421 ctagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa gcgcacgtag gcggatcgat cagttagggg

481 tgaaatccca gggctcaacc ctggaactgc ctctaatact gtcgatctcg agttcgagag

541 aggtgagtgg aattccgagt gtagaggtga aattcgtaga tattcggagg aacaccagtg

601 gcgaaggcgg ctcactggct cgatactgac gctgaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca

661 ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatggaa gctagccgtc gggcagttta

721 ctgttcggtg gcgcagttaa cgcattaagc ttcccgcctg gggagtacgg tcgcaagatt

781 aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa

841 gcaacgcgca gaaccttacc agcccttgac atcccgatcg cggacagtgg agacattgtc

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Claims

1.Methylobacterium sp.lxb-3菌，为甲基杆菌属，在牛肉膏蛋白胨平板上菌落较小，呈淡粉色，表面光滑不透明，边缘整齐，保藏编号为CGMCCNo.3713。

2.Burkholderia sp.lxb-5菌，为伯克霍尔德氏菌属，在牛肉膏蛋白胨平板上菌落呈白色，半透明，边缘不整齐，不易挑取，保藏编号为CGMCCNo.3714。

3.Rhodococcus sp.lxb-6菌，为红球菌属，在牛肉膏蛋白胨平板上菌落呈红色，边缘整齐，菌落较大，湿润，保藏编号为CGMCC No.3715。

4.Phyllobacterium sp.lxb-9菌，为叶杆菌属，在牛肉膏蛋白胨平板上菌落呈乳白色，不透明，边缘整齐，保藏编号为CGMCC No.3716。

5.一种如权利要求1所述的Methylobacterium sp.lxb-3菌，其特征在于，其菌株的16S rDNA的序列如SEQ ID NO：1所示。

6.一种如权利要求2所述的Burkholderia sp.lxb-5菌，其特征在于，其菌株的16S rDNA的序列如SEQ ID NO：2所示。

7.一种如权利要求3所述的Rhodococcus sp.lxb-6菌，其特征在于，其菌株的16S rDNA的序列如SEQ ID NO：3所示。

8.一种如权利要求4所述的Phyllobacterium sp.lxb-9菌，其特征在于，其菌株的16S rDNA的序列如SEQ ID NO：4所示。

9.一种高分子量多环芳烃降解菌系，包括如权利要求1至4中的Methylobacterium sp.lxb-3、Burkholderia sp.lxb-5、Rhodococcus sp.lxb-6和Phyllobacterium sp.lxb-9四株纯菌。

10.一种如权利要求9所述的高分子量多环芳烃降解菌系，其特征在于，Methylobacterium sp.lxb-3、Burkholderia sp.lxb-5、Rhodococcus sp.lxb-6和Phyllobacterium sp.lxb-9四株纯菌的混合比例为1～2∶1～2∶1～2∶1～2，优选1∶1∶1∶1。

11.一种如权利要求9所述的高分子量多环芳烃降解菌系的制备方法包括：将Methylobacterium sp.lxb-3、Burkholderia sp.lxb-5、Rhodococcussp.lxb-6和Phyllobacterium sp.lxb-9分别接种至牛肉膏蛋白胨液体培养至对数期，离心后弃去上清液，加入磷酸盐缓冲液洗涤，再次离心后弃上清液，收获菌体，然后将四种菌悬液混合制得菌系。

12.一种如权利要求1至4、9中任一项所述的菌或菌系应用于同时降解五种高分子量多环芳烃：苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘和茚并[1，2，3-cd]芘。

13.一种如权利要求1至4、9中任一项所述的菌或菌系在土壤或废水的生物处理和环境污染修复的应用。

14.根据权利要求13所述的菌或菌系在降解受污染的土壤的应用，其特征在于，降解土壤的条件为：温度20～30℃，土壤含水率15％～35％，营养盐比例(C∶N∶P)为100～120∶10∶1。