CN117004546A - 一种多环芳烃的降解组合物与多环芳烃的降解方法 - Google Patents
一种多环芳烃的降解组合物与多环芳烃的降解方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及环境治理领域，具体涉及一种多环芳烃的降解组合物与多环芳烃的降解方法。一种多环芳烃的降解组合物，包括供能菌和降解菌。所述供能菌为工程菌Bacillus subtilis RH 33；所述降解菌包括工程菌E.coli M01、E.coli M2与E.coli M3。将活化后上述菌株制成各菌株的菌悬液；将各菌株的菌悬液接种于含多环芳烃的待处理液中能够对多环芳烃进行降解。本发明通过在能够降解多环芳烃的降解菌的基础上，增加了为降解过程提供能量的供能菌，以提高多环芳烃的降解率。
Description
技术领域
本发明涉及环境治理领域，具体涉及一种多环芳烃的降解组合物与多环芳烃的降解方法。
背景技术
多环芳烃（PAHs）代表一类分子结构中含有两个或以上芳环的难降解有机化合物，它们在环境中有多种存在形式，分布广泛，对环境保护和人体健康都有不利的影响。因此，寻找高效处理多环芳烃污染问题的方法是全球瞩目的课题之一。目前，对于PAHs的修复方法主要可分为传统的基于物理和化学方法在内的修复方法和以微生物为主的生物修复措施。大多数物理方法只能实现转移PAHs的目的，PAHs本身的结构并没有发生变化，只是将污染问题转移到不同的地点，对PAHs的修复效果具有不彻底性，需要进一步的污染物管理。利用化学方法去除PAHs时需要额外添加化学氧化剂，添加量过少会导致中间产物产生抵抗降解作用，同时中间产物会造成二次污染，而添加量过多同样也存在二次污染的问题。生物修复可以克服上述物理和化学修复的缺点，具有安全性、经济型和生态环境友好性等优点。
黄素类化合物是一种主要由异咯嗪环衍生出的一系列有机化合物的泛称，主要有核黄素、黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）等。在厌氧条件下，培养基中存在合适的电子受体，例如电极、铁矿物等不溶性电子受体等，微生物可以将电子传递链上的电子经过一些特殊载体的协助传递到胞外的电子受体上。而核黄素就能够以电子穿梭载体的形式加速EET过程。而菲降解率最终的提升同样离不开电子传递的供应。
现有技术通常采用微生物菌剂对多环芳烃进行降解，但在实际应用中，采用微生物菌剂对多环芳烃降解，由于降解过程中能量失衡，导致存在底物残留的问题，使得对多环芳烃的降解率低。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的对多环芳烃降解处理中能量失衡导致降解率低缺陷，从而提供一种多环芳烃的降解组合物与多环芳烃的降解方法，能够在好氧的条件下，提高对多环芳烃的降解率。
本发明提供一种多环芳烃的降解组合物，包括，供能菌和降解菌。
所述供能菌为工程菌Bacillus subtilisRH 33。
所述降解菌包括工程菌E. coliM01、E. coliM2与E. coliM3。
所述工程菌E. coliM01的基因组合物包括基因nidA、nidB，当宿主细胞为大肠杆菌时，所述基因组合物还包括nidD、phdE、phdF、phdG以及phnD。
所述基因组合物中的基因经过密码子优化，包括：所述nidA优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述nidB优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述nidD优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述phdE优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述phdF优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述phdG优化后的核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示；所述phnD优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
所述供能菌和降解菌的体积比为0.9-1.1:2.7-3.3。所述降解菌中E. coliM01、E. coliM2与E. coliM3的体积比为0.9-1.1：0.9-1.1：0.9-1.1。
所述多环芳烃的降解组合物还包括产表活菌，所述产表活菌为工程菌P. putidaKTRL02。
所述工程菌P. putidaKTRL02含有基因rhlA和rhlB，所述工程菌P. putidaKTRL02含有基因rhlA和rhlB。所述基因rhlA经过密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。所述基因rhlB经过密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
所述供能菌、降解菌和产表活菌的体积比为0.9-1.1:2.7-3.3:0.9-1.1。
所述工程菌P. putidaKTRL02中含有基因rhlA和rhlB的表达载体的启动子为tac强启动子。
所述工程菌P. putidaKTRL02中含有基因rhlA和rhlB的表达载体中 RBS核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
所述工程菌P. putidaKTRL02的宿主为P. putidaKT2440。
本发明还提供一种多环芳烃的降解方法，包括，S1，将活化后各菌株制成各菌株的菌悬液；S2，将各菌株的菌悬液和诱导剂接种于含多环芳烃的待处理液中；
其中，所述各菌株为上述的多环芳烃的降解组合物中的各工程菌。
步骤S2中，各菌株的接种顺序为先接种产表活菌后，将降解菌和供能菌同时接种于含多环芳烃的待处理液中。
所述步骤S2中产表活菌与降解菌和供能菌接种时间间隔为10-14h。
所述步骤S2的各菌株的菌悬液总接种量为多环芳烃待处理液体积的4.5-5.5%。
所述多环芳烃的待处理液中含有4.5-5.5g/L的葡萄糖。
步骤S1菌悬液的制备方法为，将活化后的各菌株扩大培养后，离心，洗涤，浓缩的各菌株的菌悬液。所述步骤S1中扩大培养时间为2.5-3.5h。离心速率为8000-9000rpm，温度为3.5-4℃。洗涤采用MSN培养基。菌悬液的菌活为1×109-1×1010CFU/mL。以菌悬液和多环芳烃待处理液总体积计，所述诱导剂的注入量为0.9-1.1mmol/L。
诱导剂注入时间与降解菌和/或供能菌的接种时间间隔为5.5-6.5h。所述诱导剂为IPTG。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的多环芳烃的降解组合物，包括，供能菌和降解菌。本发明通过在能够降解多环芳烃的降解菌的基础上，增加了为降解过程提供能量的供能菌，以提高多环芳烃的降解率。
2.本发明提供的多环芳烃的降解组合物，所述供能菌为工程菌Bacillus subtilisRH 33，所述降解菌为工程菌E. coliM01、E. coliM2与E. coliM3组合而成。本发明首次采用在好氧条件下，通过工程菌Bacillus subtilisRH 33产生核黄素为降解菌对多环芳烃的降解提供能量，工程菌Bacillus subtilisRH 33产生的核黄素在降解菌细胞膜上的电子传递起到促进作用，同时，核黄素与降解菌细胞膜上的电子传递相关跨膜蛋白结合而发挥作用，通过加速电子传递提高了降解菌对菲的降解速度。除此之外，由于增加了供能菌，尤其是在多环芳烃的降解前期，增加了胞内还原力水平，使得降解速率加快，不仅提高了最终的降解率，还就解决了多环芳烃降解的底物残留问题。
3.本发明提供的多环芳烃的降解组合物，降解菌中的工程菌E. coliM01的基因组合物包括基因nidA、nidB，当宿主细胞为大肠杆菌时，所述基因组合物还包括nidD、phdE、phdF、phdG以及phnD。本发明对编码双加氧酶的和nidB基因进行优化，利用其得到的降解工程菌能够有效的实现芳环的裂解开环，以降解多环芳烃；同时，本发明结合phdE、nidD、phdF、phdG和phnD基因，实现了对多环芳烃上游模块的降解路线优化，通过nidA和nidB编码的环羟基化双加氧酶将多环芳烃转化为顺式结构，顺式结构被phdE、phdF、phnD和phdG编码的酶催化，转化为多环醛类，随后，多环醛类通过由nidD编码的脱氢酶的催化转化为多环酸类。因此，利用优化后的基因组得到的降解工程菌能够更为有效的实现芳环的裂解开环和对多环芳烃的初步降解。
4.本发明提供的多环芳烃的降解组合物，还包括产表活菌，所述产表活菌为P. putidaKTRL02。本发明通过优化与合成鼠李糖脂的相关基因rhlA和rhlB，提高了工程菌利用葡萄糖生产鼠李糖脂的合成效率，将含有基因rhlA和rhlB的工程菌P. putidaKTRL02与本发明提供的多环芳烃降解组合物相结合，在降解过程中，通过提高鼠李糖脂的含量，降低了多环芳烃的疏水性，进而提高多环芳烃的溶解度，实现多环芳烃的降解率的提升。
同时，本发明通过对负载基因rhlA和rhlB表达载体进行优化，尤其是选用tac强启动子控制两个基因的转录表达和对连接基因rhlA和rhlB的RBS序列进行优化，提高了工程菌P. putidaKTRL02的稳定性，减少了工程菌P. putidaKTRL02传代过程中质粒片段丢失的情况，加强了工程菌P. putidaKTRL02对基因rhlA和rhlB表达。
5.本发明提供的多环芳烃的降解方法，将活化后各菌株制成各菌株的菌悬液；将各菌株的菌悬液接种于含多环芳烃的待处理液中。本发明通过将各菌株制成菌悬液与含有多环芳烃的待处理液进行处理以降解多环芳烃，本发明提供的降解方法简便易操作，且对多环芳烃的降解率高。
6.本发明提供的多环芳烃的降解方法，包括，各菌株的接种顺序为先接种产表活菌后，将降解菌和供能菌同时接种于含多环芳烃待处理液中。由于产表活菌相比较于其他菌生长慢，而供能菌跟降解菌在生长繁殖速率上也不占优势，但是能量需求通常在降解处理的2-3天后才开始出现，但是晚于降解菌接种又会导致产表活菌繁殖困难，因此，优先接种产表活菌，12h后同时接种供能菌和降解菌的人工五菌体系降解率最高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明制备例1中质粒构建示意图；
图2是本发明制备例2中质粒构建示意图；
图3是本发明实施例1和对比例1-3多环芳烃的降解方法对菲的降解率；
图4是本发明对比例3多环芳烃的降解方法处理过程中胞外腺苷含量变化示意图；
图5是本发明实施例1和对比例3多环芳烃的降解方法处理过程中胞外腺苷和胞内的NADH/NAD+含量；
图6是本发明实施例1-3多环芳烃的降解方法对菲的降解率；
图7是本发明实施例1的多环芳烃的降解方法对不同浓度的菲的降解率。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
现有研究基于中间代谢物鉴定、底物利用和基因注释，提出了戈多尼亚属降解菲的水杨酸代谢途径。通过nidA和nidB编码的环羟基化双加氧酶将菲转化为顺式-3，4-二氢二羟基菲，顺式-3，4-二氢二羟基菲被phdE、phdF、phnD和phdG编码的酶催化，转化为1-羟基-2-萘甲醛，随后，1-羟基-2-萘甲醛通过由nidD编码的脱氢酶的催化转化为1-羟基-2-萘甲酸，1-羟基-2-萘甲酸被phdI和phdJ编码的酶催化，转化为2-羧基苯甲醛，进一步，2-羧基苯甲醛脱羧成1-萘酚，最后，将1-萘酚转化为水杨酸。这与先前关于水杨酸可进一步转化为儿茶酚的研究一致。儿茶酚被之后的一系列酶降解，最终参与到TCA循环中，实现将菲最终完全矿化为二氧化碳和水的目的。
但上述降解路线形成的工程菌对多环芳烃的初步降解效率不高，分析是由于现有降解路线对环的裂解效果差，因此，本发明在上述降解路线的基础上，增加了编码双加氧酶的nidA和nidB，强化了裂解开环过程，还补充了可以催化转化顺式-3，4-二氢二羟基菲的phdE，同时删除了新通路上不需要的phnF基因。
本发明实施例、应用例和实验例中涉及的质粒提取、PCR产物纯化、琼脂糖凝胶回收等操作按照上海赛默飞世尔公司提供的对应试剂盒说明进行，无缝克隆操作按照北京全式金生物技术公司无缝克隆试剂盒说明进行，使用的限制性内切酶均购自南京诺维赞公司，含有目的基因nidA、nidB和phdE的质粒、含有目的基因rhlA和rhlB的质粒均由上海生工生物工程有限公司合成。
本发明实施例底盘细胞E. coliBL21-M1，E. coliBL21-M1的质粒、基因序列nidD、 phdF、phnD和phdG以及工程菌E. coliM2、E. coliM3来自文献Artificial Consortium ofThree E. coli BL21 Strains with Synergistic Functional Modules for CompletePhenanthrene Degradation。
本发明实施例中工程菌Bacillus subtilisRH 33来自文献，陈涛. 基于基因组重排的产核黄素枯草芽孢杆菌的代谢工程 [D]; 天津大学， 2004。
降解工程菌P. putidaKT-AB的来自文献：Ruolin Qin， Tao Xu， Xiaoqiang Jia.Engineering Pseudomonas putida to produce rhamnolipid biosurfactants forpromoting phenanthrene biodegradation by a two-species microbial consortium[J]. Microbiol Spectr， 2022， 10(4): e0091022。
底盘细胞P. putidaKT2440来自文献：杨运文，蒋伏欢，宋杰，等.重组工程法敲除恶臭假单胞菌KT2440的染色体基因[J].南京师大学报：自然科学版， 2011， 34(4):6.DOI:10.3969/j.issn.1001-4616.2011.04.018。
本发明质粒pBBR1MCS-2和本发明底盘细胞E. coliBL21-M1、P. putidaKT2440均可市售购买。
本发明中底盘菌株感受态制备方法：10 mL摇管中活化平板上的对应菌株单菌落，过夜后转接至装有100 mL LB的摇瓶中。参数设定为30°C， 220 rpm摇床中培养约3 h，使OD600值为0.6-0.8。于超净台将其分装至50 mL离心管中并冰置15 min。4°C，8000 rpm离心10 min，去上清并用冰预冷的无菌水重悬菌体，重复上述操作2次。之后用冰预冷的30%甘油重悬菌体，重复2次。最后于超净中用移液枪取1 mL 30%甘油重悬离心后的菌体，轻轻吹吸混匀后分装并储存于无菌的1.5 mL离心管中，迅速转移至-80℃冰箱中保存。
本发明制备例使用的引物序列及功能见表一。
表一 本发明制备例使用的引物
本发明实施例中对菌株扩大培养时的培养基的制备方法为，将胰蛋白栋 1%，氯化钠 1%，酵母提取物 0.5%，抗性物质为0或50μg/ml，其余为水，混合，调节pH为 7.0，在121℃灭菌 20min。
制备例1
本制备例提供工程菌E. coliM01的制备方法，具体的步骤和参数如下：
获取目的基因：按照核苷酸序列SEQ ID NO：1合成nidA、按照核苷酸序列SEQ IDNO：2合成目的基因nidB，按照核苷酸序列SEQ ID NO：4合成目的基因phdE。按照扩增反应体系为2×Phanta Max Buffer 25 μL，模板 1 μL（含有各目的基因nidA、nidB和phdE的质粒，浓度为100 ng/µl），Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL，dNTP Mix 1 μL，正向引物2 μL（浓度为10 µmol/L），反向引物 2 μL（浓度为10 µmol/L），ddH2O 18 μL，共50μL，扩增反应程序为预变性95℃ 2 min，变性95℃ 15sec，退火45-70℃ 15sec，35 cycles，延伸72℃ 15 s/kb，彻底延伸72℃ 5min，扩增目的基因nidA（引物为SEQ ID NO：11-12）、nidB（引物为SEQ ID NO：13-14）和phdE（引物为SEQ ID NO：15-16）。对扩增的各目的基因进行二次扩增，扩增反应体系为2×Phanta Max Buffer 25 μL，模板 1 μL（含有各扩增后的目的基因nidA、nidB和phdE，浓度为100 ng/µl），Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase 1 μL，dNTP Mix 1 μL，正向引物2 μL（浓度为10 µmol/L），反向引物 2 μL（浓度为10 µmol/L），ddH2O 18 μL，共50 μL，扩增反应程序为预变性95℃ 2 min，变性95℃15sec，退火45-70℃ 15sec，35 cycles，延伸72℃ 15 s/kb，彻底延伸72℃ 5min，得到二次扩增的目的基因nidA（引物为SEQ ID NO：20-21）、nidB（引物为SEQ ID NO：19、22）和phdE（引物为SEQ ID NO：23-24），使各目的基因产生与相邻位置重合的序列。
重组质粒的建立：通过对工程菌E. coliBL21-M1的质粒进行双酶切，删掉质粒上phnF基因，保留nidD、phdF、phnD和phdG基因，按照图1所示的质粒图谱将二次扩增的目的基因nidA、nidB和phdE与经双酶切的质粒载体进行连接，按照ABclonal爱博泰克公司无缝克隆试剂盒说明进行操作，其中，质粒载体双酶切体系为，限制性内切酶EcoR I（酶活2000 U）和限制性内切酶Hind III（酶活2000 U）各2.5 μL，质粒（出发质粒载体为降解工程菌E. coliBL21-M1的质粒，质粒浓度100ng/µl）40 μL，Fast digest Buffer 5 μL，酶切反应程序为37℃，45 min，将双酶切的质粒载体按照天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作步骤对双酶切的质粒载体纯化得到连接体系的质粒载体，质粒与三个二次扩增的目的基因的连接体系为：2×Basic Assembly Mix 5 μL，质粒载体0.5μL（质粒浓度80ng/µl），各目的基因1μL（目的基因浓度80ng/µl），去离子水定容至10 μL，连接反应条件为50℃，30min，连接步骤进行2次，将目的基因nidA、nidB、和phdE与质粒载体连接构建重组质粒（先将二次扩增的目的基因nidA和nidB与质粒载体连接，得到连接产物1，在将连接产物1与二次扩增的目的基因phdE连接得到重组质粒），反应结束后置于冰上并立即转化。
转化：将重组质粒转化至感受态细胞E. coliDH5α中，挑取在链霉素抗性平板上生长出的单菌落进行菌落PCR，筛选出正确转入构建质粒的菌株。从正确导入构建质粒的E. coliDH5α中提取质粒，导入底盘细胞E. coliBL21(DE3)中，通过菌落PCR筛选正确转入质粒的菌株，筛选出的菌株过夜培养后送至测序公司进行序列比对，序列正确的菌株即为所构建的降解工程菌E. coliM01。
制备例2
本制备例提供一种产表活的工程菌P. putidaKTRL02的制备方法，具体步骤和参数如下：
获取目的基因：以实验室保存的降解工程菌P. putidaKT-AB的质粒为基础，按照上海赛默飞世尔公司提供的对应试剂盒说明进行质粒提取，并扩增出核苷酸序列如SEQ IDNO：8所示的目的基因rhlA和核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的目的基因rhlB，再按照扩增体系为2×Phanta Max Buffer 25 μL，模板1 μL（目的基因rhlA或rhlB），Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase 1 μL，dNTP Mix 1 μL，正向引物2 μL（浓度为10 µmol/L），反向引物（浓度为10 µmol/L）2 μL，ddH2O 18 μL，共50 μL，反应程序为预变性95℃ 2min，变性95℃ 15sec，退火45-70℃ 15sec，35 cycles，延伸72℃ 15 s/kb，彻底延伸72℃5min，得到二次扩增的目的基因rhlA（引物序列为SEQ ID NO：31、34）和rhlB（引物序列为SEQ ID NO：32-33），使各目的基因产生与相邻位置重合的序列。
重组质粒的构建：按照图2所示的质粒图谱，将二次扩增的目的基因rhlA和rhlB与经双酶切的质粒载体进行连接，其中，质粒载体双酶切体系为：限制性内切酶EcoR I（酶活2000 U）和限制性内切酶Hind III（酶活2000 U）各2.5 μL，质粒（出发质粒载体为pBBR1MCS-2，质粒浓度150ng/µl）40 μL，Fast digest Buffer 5 μL，酶切反应程序为37℃，45 min，按照ABclonal爱博泰克公司无缝克隆试剂盒说明进行操作，其连接反应体系为：连接体系为2×Basic Assembly Mix 5 μL，质粒载体0.6μL（质粒浓度100 ng/µl），2μL目的基因rhlA、2μLrhlB（目的基因rhlA和rhlB的浓度60 ng/µl），去离子水定容至10 μL，反应条件为50℃，30min，将目的基因rhlA和rhlB与质粒载体连接构建重组质粒，反应结束后置于冰上并立即转化，其中，在二次扩增目的基因rhlB和rhlA连接时，通过二次扩增的目的基因rhlB和rhlA重合的序列将目的基因rhlA和rhlB间的RBS序列连接于载体上，RBS序列核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
转化：将重组质粒转化至P. putidaKT2440感受态细胞中，挑取在卡那霉素抗性平板上生长出的单菌落进行菌落PCR，筛选出正确转入构建质粒的菌株。筛选出的菌株过夜培养后送至测序公司进行序列比对，序列正确的菌株即为所构建的产表活的工程菌P. putidaKTRL02。
实施例1
本实施例提供一种多环芳烃的降解方法，具体步骤和参数如下：
将制备例1制备得到的工程菌E. coliM01与工程菌E. coli M2、E. coli M3、 Bacillus subtilisRH 33 以及制备例2制备得到的工程菌P. putidaKTRL02，分别在10mL反应管中过夜活化，分别将活化后的菌株在LB培养基中扩大培养3h，其中，工程菌E. coliM01、E. coli M2、E. coli M3在含有抗性物质链霉素的LB培养基中培养，工程菌Bacillus subtilisRH 33在不含有抗性物质的LB培养基中培养，工程菌P. putidaKTRL02在含有抗性物质卡那霉素的LB培养基中扩大培养。
分别取45 mL的制备例制得的各工程菌抗性培养后的培养液在无菌环境中倒入50 mL离心管中，在4℃，8000 rpm条件下，低温离心10分钟。在超净工作台中弃去上清液，用MSM培养基洗涤菌体2-3次，然后通过计算制备OD600约为3的各菌株的浓缩菌悬液，将各菌株的菌悬液稀释为菌活为1×1010CFU/mL。
按照无机盐培养基中葡萄糖浓度为5g/L，菲的浓度为100mg/L配置含菲的待处理液。
将制备例1制得的工程菌E. coliM01菌悬液与工程菌E. coliM2菌悬液、工程菌E. coliM3菌悬液按照体积比为1:1:1混合得到多环芳烃的降解菌M0123，备用；取制备例2制得的产表活的工程菌P. putidaKTRL02菌悬液1mL接种于上述含菲的待处理液中，待处理液为100mL，在30℃下，220rpm转速的摇床中培养，12h后，取3ml的降解菌M0123和1mL供能菌Bacillus subtilisRH33同时接种于待处理液中，继续在30℃下，220rpm转速的摇床中培养6h，向待处理液中加入诱导剂IPTG，使得诱导剂在待处理液和菌悬液的混合液中的浓度为1mM，继续在30℃下，220rpm转速的摇床中培养，以注入产表活的工程菌P. putidaKTRL02菌悬液开始计时，共计培养8天。
实施例2
本实施例提供一种多环芳烃的降解方法，具体步骤和参数与实施例1相同，不同之处在于，按照产表活的工程菌P. putidaKTRL02菌悬液、供能菌Bacillus subtilisRH33和降解菌M0123的顺序依次将上述菌悬液接种于实施例1制备得到的含菲的待处理液中，各工程菌的菌悬液接种时间间隔为12h，诱导剂IPTG在接种多环芳烃的降解菌M0123培养6h后接种，在30℃下，220rpm转速的摇床中培养，以注入产表活的工程菌P. putidaKTRL02菌悬液开始计时，共计培养8天。
实施例3
本实施例提供一种多环芳烃的降解方法，具体步骤和参数与实施例1相同，不同之处在于，按照产表活的工程菌P. putidaKTRL02菌悬液、降解菌M0123和供能菌Bacillus subtilisRH33的顺序依次将上述菌悬液接种于实施例1制备得到的含菲的待处理液中，各工程菌的菌悬液接种时间间隔为12h，诱导剂IPTG在接种多环芳烃的降解菌M0123培养6h后接种，在30℃下，220rpm转速的摇床中培养，以注入产表活的工程菌P. putidaKTRL02菌悬液开始计时，共计培养8天。
实施例4
本实施例提供一种多环芳烃的降解方法，具体步骤和参数与实施例1相同，不同之处在于，P. putidaKTRL02菌悬液、降解菌M0123和供能菌Bacillus subtilisRH33的接种体积比为0.9:3.3:1.1。
实施例5
本实施例提供一种多环芳烃的降解方法，具体步骤和参数与实施例1相同，不同之处在于，P. putidaKTRL02菌悬液、降解菌M0123和供能菌Bacillus subtilisRH33的接种体积比为1.1:2.7:0.9。
实施例6
本实施例提供一种多环芳烃的降解方法，具体步骤和参数如下：
将制备例1制备得到的工程菌E. coliM01和工程菌E. coli M2、E. coli M3、 Bacillus subtilisRH 33 以及制备例2制备得到的工程菌P. putidaKTRL02，分别在10mL反应管中过夜活化，分别将活化后的菌株在LB培养基中扩大培养2.5h，其中，工程菌E. coliM01、E. coli M2、E. coli M3在含有抗性物质链霉素的LB培养基中培养，工程菌Bacillus subtilisRH 33在不含有抗性物质的LB培养基中培养，工程菌P. putidaKTRL02在含有抗性物质卡那霉素的LB培养基中扩大培养。
分别取45 mL的制备例制得的各工程菌抗性培养后的培养液在无菌环境中倒入50 mL离心管中，在3.5℃，9000 rpm条件下，低温离心10分钟。在超净工作台中弃去上清液，用MSM培养基洗涤菌体2-3次，然后通过计算制备OD600约为3的各菌株的浓缩菌悬液，将各菌株的菌悬液稀释为菌活为1×109CFU/mL。
按照无机盐培养基中葡萄糖浓度为4.5g/L，菲的浓度为100mg/L配置含菲的待处理液，取100mL上述含菲待处理液进行本实施例的降解过程。
将制备例1制得的工程菌E. coliM01菌悬液、工程菌E. coliM2菌悬液、工程菌E. coliM3菌悬液按照体积比为0.9:1.1:0.9混合得到多环芳烃的降解菌M0123，备用；取制备例2制得的产表活的工程菌P. putidaKTRL02菌悬液1.1mL接种于上述含菲的待处理液中，在30℃下，220rpm转速的摇床中培养，14h后，取3.3ml的多环芳烃降解菌M0123和1.1mL供能菌Bacillus subtilisRH33同时接种于待处理液中，继续在30℃下，220rpm转速的摇床中培养5.5h，向待处理液中加入诱导剂IPTG，使得诱导剂在待处理液和菌悬液的混合液中的浓度为0.9mM，继续在30℃下，220rpm转速的摇床中培养，以注入产表活的工程菌P. putidaKTRL02菌悬液开始计时，共计培养8天。
实施例7
本实施例提供一种多环芳烃的降解方法，具体步骤和参数如下：
将制备例1制备得到的工程菌E. coliM01和工程菌E. coli M2、E. coli M3、 Bacillus subtilisRH 33 以及制备例2制备得到的工程菌P. putidaKTRL02，分别在10mL反应管中过夜活化，分别将活化后的菌株转移至含有相应抗性的LB培养基中，培养3.5h，其中，工程菌E. coliM01、E. coli M2、E. coli M3的抗性物质为链霉素，工程菌Bacillus subtilisRH 33的抗性物质为无，工程菌P. putidaKTRL02的抗性物质为卡那霉素。
分别取45 mL的制备例制得的各工程菌抗性培养后的培养液在无菌环境中倒入50 mL离心管中，在4℃，8500 rpm条件下，低温离心10分钟。在超净工作台中弃去上清液，用MSM培养基洗涤菌体2-3次，然后通过计算制备OD600约为3的各菌株的浓缩菌悬液，将各菌株的菌悬液稀释为菌活为1×1010CFU/mL。
按照无机盐培养基中葡萄糖浓度为5.5g/L，菲的浓度为100mg/L配置含菲的待处理液，取100mL上述含菲待处理液进行本实施例的降解过程。
将制备例1制得的工程菌E. coliM01菌悬液、工程菌E. coliM2菌悬液、工程菌E. coliM3菌悬液按照体积比为1.1:0.9:1.1混合得到多环芳烃的降解菌M0123，备用；取制备例2制得的产表活的工程菌P. putidaKTRL02菌悬液0.9mL接种于上述含菲的待处理液中，在30℃下，220rpm转速的摇床中培养，10h后，取2.7ml的多环芳烃降解菌M0123和0.9mL供能菌Bacillus subtilisRH33同时接种于待处理液中，继续在30℃下，220rpm转速的摇床中培养6.5h，向待处理液中加入诱导剂IPTG，使得诱导剂在待处理液和菌悬液的混合液中的浓度为1.1mM，继续在30℃下，220rpm转速的摇床中培养，以注入产表活的工程菌P. putidaKTRL02菌悬液开始计时，共计培养8天。
对比例1
取实施例1制备得到的工程菌E. coliM01菌悬液3mL，接种于实施例1制备的含菲的待处理液中， 待处理液为100mL，并在200rpm和30℃下于摇床中培养 8天。
对比例2
将实施例1制得的工程菌E. coliM01菌悬液、工程菌E. coliM2菌悬液和工程菌E. coliM3菌悬液按照体积比为1:1:1混合得到多环芳烃的降解菌M0123，取3mL多环芳烃的降解菌M0123接种于实施例1制备的含菲的待处理液中， 待处理液为100mL，并在200rpm和30℃下于摇床中培养8天。
对比例3
将实施例1制得的工程菌E. coliM01菌悬液、工程菌E. coliM2菌悬液和工程菌E. coliM3菌悬液按照体积比为1:1:1混合得到多环芳烃的降解菌M0123，取1ml实施例1制备得到的产表活工程菌P. putidaKTRL02菌悬液接种于上述含菲的待处理液中，待处理液100mL，在30℃下，220rpm转速的摇床中培养，12h后，取3ml降解菌M0123接种于实施例1制备的含菲的待处理液中，并在200rpm和30℃下于摇床中培养，以注入产表活的工程菌P. putidaKTRL02菌悬液开始计时，共计培养8天。
实验例1
采用正己烷萃取将实施例1和对比例1-3培养8天后培养基中的底物，在萃取前，在实施例1和对比例1-3的培养基中加入芘作为内标，萃取2次，萃取液取至烧杯中，烧杯放在通风橱中等待正己烷挥发完全。待正己烷完全挥发，用色谱纯二氯甲烷稀释至1000-5000ppm，无水Na2SO4干燥，并通过0.22 μm有机系膜过滤，之后装入2 mL进样瓶中，待测，并设置不添加降解组合物的实验组为对照组，对照组的实验操作与实验组相同。
使用气相色谱测定对多环芳烃菲的降解率。仪器：气相色谱仪：GC-430；FID检测器；色谱柱Rxi-1HT（30 m × 0.32 mm × 0.25 μm）。检测程序：进样口温度：280°C，检测器温度300°C。99.999%高纯氮气为流动相，流速1 mL/min，分流比为8。程序升温：80°C保持1min，以50°C/min的速率升温至210°C，再以5°C/min升至250°C。进样量为1.2 μL。菲的降解率计算方法：为了消除进样量的误差，采用内标法测试菲的含量。底物降解率的公式如下：AF是指残留底物的峰面积，AB是内标的峰面积。具体计算公式为：
请参阅图3，可知，降解持续八天后，实施例1对100 mg/L菲的降解率最高，达到81.62%，比仅含有降解菌的对比例2的多环芳烃降解组合物M0123增加了16.96%。
实验例2
在实施例1降解组合物对菲的待处理液进行降解时，每天取样2ml待处理液，对样品中胞内NADH/NAD+含量进行测定，在对比例3的降解组合物对菲的待处理液进行降解时，每天取样2ml待处理液，对样品中胞外腺苷和胞内NADH/NAD+含量进行测定。
腺苷含量测定：样品处理：取1mL降解培养液，8000 rpm离心10min后吸取600 μL上清液至新的离心管中，置于-80℃中备测。仪器：岛津LC-20AD。测定方法：色谱柱UltimatePlus LP-C18（4.6*150mm 5um）；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测波长：254 nm；进样量：10ul；流动相：10 mM磷酸二氢钾-甲醇（85：15）。
NADH/NAD+含量测定：
NAD+的提取：取1 mL降解培养液至1.5 mL离心管内，冷冻离心10 min后收集底部菌体，加入0.1 mm氧化锆研磨珠至0.5 mL刻度。 向离心管中加入0.5 mL 酸性提取液，将离心管膜封后于研磨机上破碎3 min，间隔1 min，重复3次。煮沸 5 min；冰浴冷却后，10000rpm， 4℃离心 10 min；取 200 μL 上清液，吸取相同体积的碱性提取液使之中和；混匀，10000 rpm， 4℃，离心 10 min，取上清，4℃保存待测。
NADH的提取：取1 mL降解培养液至1.5 mL离心管内，冷冻离心10 min后收集底部菌体，加入0.1 mm氧化锆研磨珠至0.5mL刻度。 向离心管中加入0.5 mL 碱性提取液，将离心管膜封后于研磨机上破碎3 min，间隔1 min，重复3次。煮沸 5 min；冰浴冷却后，10000rpm， 4℃离心 10 min；取 200 μL 上清液，吸取相同体积的酸性提取液使之中和；混匀，10000 grpm4℃离心 10 min，取上清，4℃保存待测。
其余测定步骤均按照索莱宝NADH/NAD+试剂盒说明书操作。
参阅图4和图5，实施例1的降解组合物降解的八天内的NADH/NAD+比值在均高于对比例3降解组合物，其中接种24h区别尤为明显，比值分别为0.918和0.453。这说明添加供能菌的降解组合物胞内整体还原力水平要高于仅含有降解工程菌的降解组合物。对比例3的降解组合物对菲的待处理液进行降解胞外腺苷浓度持续增加，可知仅含有降解菌的降解组合物出现底物残留的原因与能量失衡有关。对比例3降解组合物的NADH/NAD+比值在前四天有明显的上升趋势，这是降解过程中各菌之间的占比等逐渐趋于稳定。
实验例3
采用实验例1相同的方法对实施例1-3中菲的降解率进行检测，根据图6结果可知，实施例1先接种产表活菌，培养12h后，同时接种供能菌和降解菌的方式对菲的降解率表现更优，这是由于表活菌相较于其他菌生长慢，而供能菌跟降解菌也不占优势，但是能量需求通常在降解后期也就是2-3天后才开始出现，但是晚于降解菌接种又会导致产表活菌繁殖困难，因此，优先接种产表活菌，12h后同时接种供能菌和降解菌的人工五菌体系降解率最高。
实验例4
与实施例1的步骤和参数相同，不同之处在于含菲的待处理液中菲的浓度分别为100，200，300，400和500 mg/L菲的100 mL无机盐培养基。采用实验例1相同的方法对处理8天后的各待处理液中的菲的降解率进行测定。
参阅图7可知，实施例1的多环芳烃降解组合物对浓度在100-300 mg/L区间内菲的降解率有下降的趋势，对200 mg/L和300 mg/L菲的降解率分别为73.63%和68.98%，对400mg/L和500 mg/L菲的降解率又开始上升，降解率分别为75.69%和79.38%。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (14)
1.一种多环芳烃的降解组合物，其特征在于，包括供能菌和降解菌。
2.根据权利要求1所述的多环芳烃的降解组合物，其特征在于，所述供能菌为工程菌Bacillus subtilis RH 33；
和/或，所述降解菌包括工程菌E. coli M01、E. coli M2与E. coli M3。
3. 根据权利要求2所述的多环芳烃的降解组合物，其特征在于，所述工程菌E. coliM01的基因组合物包括基因nidA、nidB，当宿主细胞为大肠杆菌时，所述基因组合物还包括nidD、phdE、phdF、phdG以及phnD。
4. 根据权利要求3所述的多环芳烃的降解组合物，其特征在于，所述基因组合物中的基因经过密码子优化，包括：
所述nidA优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；和/或
所述nidB优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；和/或
所述nidD优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；和/或
所述phdE优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；和/或
所述phdF优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；和/或
所述phdG优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；和/或
所述phnD优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
5.根据权利要求1-4任一项所述的多环芳烃的降解组合物，其特征在于，所述供能菌和降解菌的体积比为0.9-1.1:2.7-3.3；和/或，
所述降解菌中E. coli M01、E. coli M2与E. coli M3的体积比为0.9-1.1：0.9-1.1：0.9-1.1。
6. 根据权利要求5所述的多环芳烃的降解组合物，其特征在于，还包括产表活菌，所述产表活菌为工程菌P. putida KTRL02。
7. 根据权利要求6所述的多环芳烃的降解组合物，其特征在于，所述工程菌P. putidaKTRL02含有基因rhlA和rhlB；和/或，
所述基因rhlA经过密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；和/或，
所述基因rhlB经过密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；和/或，
所述供能菌、降解菌和产表活菌的体积比为0.9-1.1:2.7-3.3:0.9-1.1。
8. 根据权利要求7所述的多环芳烃的降解组合物，其特征在于，所述工程菌P. putidaKTRL02中含有基因rhlA和rhlB的表达载体的启动子为tac强启动子；和/或，
所述工程菌P. putida KTRL02中含有基因rhlA和rhlB的表达载体中 RBS核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；
和/或，所述工程菌P. putida KTRL02的宿主为P. putida KT2440。
9.一种多环芳烃的降解方法，其特征在于，包括:
S1，将活化后各菌株制成各菌株的菌悬液；
S2，将各菌株的菌悬液和诱导剂接种于含多环芳烃的待处理液中；
其中，所述各菌株为权利要求1-8任一项所述的多环芳烃的降解组合物中的各工程菌。
10.根据权利要求9所述的降解方法，其特征在于，步骤S2中，各菌株的接种顺序为先接种产表活菌后，将降解菌和供能菌同时接种于含多环芳烃待处理液中。
11.根据权利要求10所述的降解方法，其特征在于，所述步骤S2中产表活菌与降解菌和供能菌接种时间间隔为10-14h；和/或，
各菌株的菌悬液总接种量为多环芳烃的待处理液的体积的4.5-5.5%；和/或，
所述多环芳烃的待处理液的中含有4.5-5.5g/L的葡萄糖。
12.根据权利要求9-11任一项所述的降解方法，其特征在于，步骤S1各菌株的菌悬液的制备方法为，将活化后的各菌株扩大培养后，离心，洗涤，浓缩制得各菌株的菌悬液。
13.根据权利要求12所述的降解方法，其特征在于，所述步骤S1中扩大培养时间为2.5-3.5h；和/或，
离心速率为8000-9000rpm，温度为3.5-4℃；和/或，
洗涤采用MSN培养基；和/或，
各菌株的菌悬液的菌活为1×109-1×1010 CFU/mL。
14.根据权利要求13所述的降解方法，其特征在于，以菌悬液和多环芳烃待处理液总体积计，所述诱导剂的注入量为0.9-1.1mmol/L；和/或，
诱导剂注入时间与降解菌和/或供能菌的接种时间间隔为5.5-6.5h；和/或，
所述诱导剂为IPTG。
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