CN114480238A - 用于多环芳烃菲降解的人工混菌体系及其工程改造方法和应用 - Google Patents

用于多环芳烃菲降解的人工混菌体系及其工程改造方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于多环芳烃降解的人工体系及其工程改造方法和应用，人工混菌体系包括E.coli M123+P.putida KT‑159、E.coli M123+P.putida KT‑AB或E.coli M123+P.putida KT‑ABRI。E.coli M123负责对多环芳烃菲的降解，P.putida KT‑159、P.putida KT‑AB和P.putida KT‑ABRI的功能均为产生生物表面活性剂——鼠李糖脂，鼠李糖脂可以使菲的水溶性和生物可利用性增加，从而使该混菌体系可以对多环芳烃菲污染物进行更高效率地降解。为多环芳烃污染物的降解修复提供了新方法。

Description

用于多环芳烃菲降解的人工混菌体系及其工程改造方法和 应用
技术领域
本发明涉及一种用于多环芳烃降解的人工体系及其工程改造方法和应用，属于生物降解领域和基因工程领域。
背景技术
多环芳烃是一类具有两个或两个以上的有机化合物，如萘、蒽、菲、芘、联苯、三联苯等。环境中的多环芳烃主要来源于不完全燃烧的有机化合物，它们广泛存在于土壤、水体和空气中，而且其中相当的一部分都具有慢性毒性和致癌、致畸、致突变的“三致”作用，对人类健康和生态环境造成了巨大危害，是环境中一类危险而需重点研究的化合物。多环芳烃的修复方法包括物理方法、化学方法以及生物方法等。物理方法例如热脱附法等，只能将环境中的多环芳烃进行空间上的转移而不能改变芳环的结构，无法将多环芳烃彻底去除修复；化学方法修复效果较好，但是成本高，而且化学处理过程中所需的试剂以及过程的中间产物等都有可能对环境造成二次污染；生物修复法相对于前两种方法来说，具有修复彻底、成本低廉及绿色无污染的优点，因此成为近些年来多环芳烃污染治理的研究热点。
生物法修复多环芳烃污染实质上是利用微生物的代谢来将多环芳烃转变成二氧化碳和水的过程。这就导致了一个潜在的问题，虽然微生物可以利用多环芳烃作为生长代谢的底物，但是在环境体系中 (水环境、土壤环境等)，由于多环芳烃水溶性差、疏水性高以及对土壤或空气颗粒有较强的吸附性等特点，使得多环芳烃的生物可利用性很低。针对多环芳烃生物利用性低这个问题，研究人员提出了多种针对多环芳烃的不同修复方法。其中，表面活性剂增强修复是一种有效的手段。表面活性剂由两性分子组成，包括亲水头部和疏水尾部。表面活性剂可以显著提高多环芳烃在水相中的溶解度，以促进多环芳烃的微生物降解。鼠李糖脂是表征最好的生物表面活性剂之一，具有低毒性、高度的生物相容性及生态友好可持续性等优点。
然而，人为地外源添加鼠李糖脂会造成材料成本和人工成本的大大增加，并且鼠李糖脂的原始产生菌——铜绿假单胞菌是条件致病菌，对生态环境和人类健康造成威胁。
发明内容
综上考虑以上内容，我们设计并构建了可以异源表达鼠李糖脂的工程恶臭假单胞菌，并且用该工程菌与我们实验室之前构建的可以降解多环芳烃的工程菌组成了混菌体系(该混菌体系由三种功能不同的工程大肠杆菌组成，分别为E.coli M1、E.coli M2、E.coliM3(相关论文已发表于ACS期刊，可在各大数据库搜索查看，论文题目为：ArtificialConsortium of Three E.coli BL21 Strains with Synergistic Functional Modulesfor Complete Phenanthrene Degradation)，以下将E.coli M1、E.coli M2、 E.coli M3这三种工程菌简称为E.coli M123。该混菌体系可以实现多环芳烃的高效降解。
本发明的技术方案如下：
一类用于多环芳烃降解的人工混菌体系；具体包括三种：
一是E.coli M123+P.putida KT-159；
二是E.coli M123+P.putida KT-AB；
三是E.coli M123+P.putida KT-ABRI。
本发明用于多环芳烃降解的人工混菌体系工程改造方法，人工混菌体系包括E.coli M123、P. putida KT2440、转入P.putida KT2440的三种表达载体p2-rhlABRI、p2-rhlAB-Tac及p2-rhlABRI-Tac、相关启动子、参与多环芳烃降解和产表面活性剂的关键基因；三种表达载体p2-rhlABRI、p2-rhlAB-Tac 及p2-rhlABRI-Tac是经人工设计后交由生物工程有限公司合成；将公司合成的上述三个表达载体 p2-rhlABRI、p2-rhlAB-Tac及p2-rhlABRI-Tac分别转化至P.putida KT2440中得到三种产鼠李糖脂的基因工程菌——P.putida KT-159、P.putida KT-AB及P.putida KT-ABRI。
所述的方法包括如下步骤：
1)通过文献调研确定与合成鼠李糖脂的相关基因的核苷酸序列，包括rhlA、rhlB、rhlR和rhlI，对应的基因序列如SEQ ID No.1-4所示；
2)选择广宿主质粒pBBR1MCS-2质粒作为载体，在软件上将相关基因和质粒连接，得到表达载体 p2-rhlABRI、p2-rhlAB-Tac及p2-rhlABRI-Tac质粒，相对应的核苷酸序列如SEQ ID No.5-7所示；
3)通过电击法将公司合成的上述三个表达载体p2-rhlABRI、p2-rhlAB-Tac及p2-rhlABRI-Tac转入P. putida KT2440中，分别得到具有鼠李糖脂合成功能的三种基因工程菌——P.putida KT-159、P.putida KT-AB及P.putida KT-ABRI(命名原则是：借鉴原始菌株P.putida KT2440的命名，159为随机数字， AB和ABRI分别代表基因rhlA、rhlB以及rhlA、rhlB、rhlR和rhlI)。
其中p2-rhlABRI是质粒pBBR1MCS-2上连接有rhlA、rhlB、rhlR和rhlI四个基因；p2-rhlAB-Tac 是质粒pBBR1MCS-2上连接有rhlA和rhlB这两个基因和Tac启动子；p2-rhlABRI-Tac是质粒 pBBR1MCS-2上连接有rhlA、rhlB、rhlR和rhlI四个基因和Tac启动子。
具体说明如下：
本发明的目的是提供一类用于多环芳烃降解的人工混菌体系；具体包括三种：一是E.coli M123 +P.putida KT-159；二是E.coli M123+P.putida KT-AB；三是E.coli M123+P.putida KT-ABRI；
其中，E.coli M123负责对多环芳烃菲的降解，P.putida KT-159、P.putida KT-AB和P.putida KT-ABRI的功能均为产生生物表面活性剂——鼠李糖脂，鼠李糖脂可以使菲的水溶性和生物可利用性增加，从而使该混菌体系可以对多环芳烃菲污染物进行更高效率地降解。
E.coli M123相关基因序列在上述提及的已发表论文中均可以查到，P.putidaKT-159、P.putida KT-AB、P.putida KT-ABRI基因组序列与原始菌株P.putida KT2440相同(可在网站上查到)，上述三种工程菌中所含的质粒分别为p2-rhlABRI、p2-rhlAB-Tac及p2-rhlABRI-Tac，其相对应的核苷酸序列如SEQ ID No.5-7所示。E.coli M123的功能为降解多环芳烃菲，其可以表达三种酶，分别为环羟基化双加氧酶、水杨酸羟化酶和邻苯二酚1，2-双加氧酶，这三种酶是降解菲过程中的三种酶。P.putida KT-159、P.putida KT-AB、P.putidaKT-ABRI三种工程菌中涉及四个基因rhlA、rhlB、rhlR和rhlI，其中rhlA编码的蛋白RhlA是酞基转移酶，负责β-羟基烷酸(HAAs)的合成，而基因rhlB编码的蛋白RhlB则负责催化HAAs和TDP-鼠李糖以合成鼠李糖脂。rhlR和rhlI这两个基因编码的蛋白RhlR， RhlI负责对鼠李糖脂合成的自体调控。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了三种用于多环芳烃降解的人工混菌体系，涉及到的人工混菌体系包括E.coli M123、 P.putida KT2440、转入P.putida KT2440的三种表达载体p2-rhlABRI、p2-rhlAB-Tac及p2-rhlABRI-Tac、相关启动子、产表面活性剂的关键基因。
三种表达载体p2-rhlABRI、p2-rhlAB-Tac及p2-rhlABRI-Tac是经人工设计后交由武汉金开瑞生物工程有限公司合成的。将公司合成的上述三个表达载体p2-rhlABRI、p2-rhlAB-Tac及p2-rhlABRI-Tac 分别转化至P.putida KT2440中得到三种产鼠李糖脂的基因工程菌——P.putida KT-159、P.putida KT-AB及P.putida KT-ABRI。其中，原始底盘细胞是恶臭假单胞菌KT2440，购买自美国模式培养物研究所。
本发明还提供了所述人工混菌体系中工程恶臭假单胞菌的具体设计方法：
首先，通过文献调研确定与合成鼠李糖脂的相关基因的核苷酸序列，包括rhlA、rhlB、rhlR和rhlI，对应的基因序列SEQ ID No.1-4所示。
其次，广宿主质粒pBBR1MCS-2(该质粒序列公知)可以在P.putida中可以稳定存在并复制，因此选择该质粒作为载体；之后，在软件上将相关基因和质粒连接，得到表达载体p2-rhlABRI、 p2-rhlAB-Tac及p2-rhlABRI-Tac的图谱；质粒图谱如图1-3所示，相对应的核苷酸序列如SEQ ID No.5-7 所示。
其中，p2-rhlABRI是质粒pBBR1MCS-2上连接有rhlA、rhlB、rhlR和rhlI四个基因；p2-rhlAB-Tac 是质粒pBBR1MCS-2上连接有rhlA和rhlB这两个基因和Tac启动子；p2-rhlABRI-Tac是质粒 pBBR1MCS-2上连接有rhlA、rhlB、rhlR和rhlI四个基因和Tac启动子。其中，质粒载体为自己命名，命名原则是：p2代表pBBR1MCS-2广宿主质粒，rhlAB和rhlABRI为质粒上插入的目的基因，Tac 为启动子。
最后，通过电击法将公司合成的上述三个表达载体p2-rhlABRI、p2-rhlAB-Tac及p2-rhlABRI-Tac 转入P.putida KT2440中，分别得到具有鼠李糖脂合成功能的三种基因工程菌——P.putida KT-159、P. putida KT-AB及P.putida KT-ABRI(命名原则是：借鉴原始菌株P.putida KT2440的命名，159为随机数字，AB和ABRI分别代表基因rhlA、rhlB以及rhlA、rhlB、rhlR和rhlI)。
本发明还提供了所述人工混菌体系在多环芳烃菲污染物降解中的应用，所述应用方法：
(1)将工程菌E.coli M123与工程菌P.putida KT-159、P.putida KT-AB及P.putida KT-ABRI分别以三种组合E.coli M123+P.putida KT-159、E.coli M123+P.putida KT-AB、E.coli M123+P.putida KT-ABRI分别接种到三瓶相同的含有多环芳烃菲的培养基中进行降解。其中培养基成分为普通的无机盐培养基(MSM培养基)中额外加入菲，且菲在培养基中的终浓度为100mg/L。
(2)降解7天后，分析混菌体系对多环芳烃菲污染物的降解情况。
本发明还提供了所述人工混菌体系在多环芳烃菲污染物降解中的应用，所述应用方法：
(1)取样武清某地10cm深的土壤，用筛网初步过滤大颗粒杂质；
(2)将上述取样的土壤配制为终浓度分别是100mg菲/kg土壤和300mg菲/kg土壤的实验土壤样品；
(3)用不同的修复策略(表1)来处理实验土壤样品，降解45天后测量土壤中多环芳烃菲的剩余含量来分析降解率(表2)。
表1模拟多环芳烃污染场地降解实验的不同策略
Figure BDA0003519033490000041
注：表中字母为策略英文Strategy的首字母S。表中所有菌液均为处于对数生长期的菌体，用量均为1ml；每份污染土壤为150g。
本发明的优点表现为：产鼠李糖脂的原始菌株铜绿假单胞菌为条件致病菌，因此将鼠李糖脂合成相关基因在非条件致病菌恶臭假单胞菌中异源表达，具有生态友好性；人工混菌体系中工程恶臭假单胞菌底物为甘油，工程大肠杆菌底物为菲，避免了底物竞争(图4)；人工混菌体系中由工程恶臭假单胞菌产生鼠李糖脂，体系中鼠李糖脂的产生可以有效促进多环芳烃的降解，加入P.putida KT-ABRI 后的混菌体系对100mg/L菲的7天降解率为73.86％，比单独的E.coli M123提高了12.71％(图5)，经过进一步条件优化后降解率最终可达到85.73％(图6)；混菌体系不仅在摇瓶中可以有效降解菲，对人为设置的多环芳烃菲污染土壤也有显著的修复作用，在最优条件下(S4，见表1)，混菌体系对 100mg菲/kg土壤的45天降解率为86.52％(表2)。这为以后多环芳烃污染物的降解修复提供了新方法，为人工混菌体系的进一步开发和改造提供了实验基础。
附图说明
图1是重组载体p2-rhlABRI构建示意图。
图2是重组载体p2-rhlAB-Tac构建示意图。
图3是重组载体p2-rhlABRI-Tac构建示意图。
图4是混菌体系示意图。
图5是不同混菌体系组合对菲的降解率。
图6是对混菌体系进行条件优化的降解率。(a)IPTG诱导剂含量；(b)甘油添加量；(c)接种顺序。
图7是P.putida KT-AB和P.putida KT-ABRI的相对基因表达倍数。
图8是原始菌株和工程菌的鼠李糖脂产量。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明：
实施例1重组表达载体p2-rhlABRI、p2-rhlAB-Tac及p2-rhlABRI-Tac的设计构建
(1)经过大量文献调研，作为优选，选取与鼠李糖脂合成相关的rhlA、rhlB、rhlR和rhlI四个基因。鼠李糖脂的生物合成过程中鼠李糖基转移酶I是合成鼠李糖脂所必需的关键酶。这种酶是一种复合酶，是由rhlAB操纵子来编码该酶的合成。其中基因rhlA编码的蛋白RhlA是酞基转移酶，负责β-羟基烷酸(HAAs)的合成，而基因rhlB编码的蛋白RhlB则负责催化HAAs和TDP-鼠李糖合成单糖型鼠李糖脂。在操纵子rhlAB的下游，还存在着两个调节基因rhlR和rhlI，这两个基因与rhlA、 rhlB同时被贯穿在一个基因簇中，其编码的蛋白RhlR，RhlI负责对鼠李糖脂合成的自体调控。由于 pBBR1MCS-2质粒为广宿主质粒，而且实验证明可以在恶臭假单胞菌中稳定存在，因此选取该质粒作为载体、上述四个基因为目的基因设计了p2-rhlABRI重组载体，在Snapgene软件上设计完成质粒图谱如图1所示。后交由武汉金开瑞生物工程有限公司合成表达载体p2-rhlABRI。
(2)经过大量文献调研，设计rhlA、rhlB两个基因(基因的核苷酸序列依次为SEQID No.1-2 所示)的上游通过同源重组的方式加上Tac启动子，相应地在rhlB基因下游加一个Tac终止子，在 Snapgene软件上设计完成质粒图谱如图2所示。后交由武汉金开瑞生物工程有限公司合成表达载体 p2-rhlAB-Tac。
(3)经过大量文献调研，设计rhlA、rhlB、rhlR和rhlI基因(基因的核苷酸序列依次为SEQ ID No.1-4所示)的上游通过同源重组的方式加上Tac启动子，相应地在每两个基因下游加一个Tac终止子，在Snapgene软件上设计完成质粒图谱如图3所示。后交由武汉金开瑞生物工程有限公司合成表达载体p2-rhlABRI-Tac。
实施例2重组表达载体转化至恶臭假单胞菌KT2440中
重组表达载体p2-rhlABRI、p2-rhlAB-Tac及p2-rhlABRI-Tac(这三种表达载体的核苷酸序列依次为SEQ ID No.5-7所示)转化到恶臭假单胞菌KT2440中的详细构建步骤如下：
(1)分别将重组表达载体p2-rhlABRI、p2-rhlAB-Tac及p2-rhlABRI-Tac 1μL，加入到50μL恶臭假单胞菌KT2440感受态细胞中，轻轻吹打混匀；
(2)将混合物加入1mm的电转杯中，1.8KV电击5-6ms。然后迅速加入1mLSOC培养基中， 30℃，200rpm复苏1h后涂布卡那霉素抗性的LB固体培养基平板，30℃过夜培养；
(3)挑选菌落PCR验证的阳性转化子到5mL LB培养基中过夜培养，分别在各个卡那霉素抗性平板上得到工程菌P.putida KT-159、P.putida KT-AB和P.putida KT-ABRI，于-80℃超低温冰箱中保存菌株。
实施例3工程恶臭假单胞菌基因表达验证
为检验工程恶臭假单胞菌是否能够按照预期转录表达，测定其鼠李糖脂合成相关基因的相对基因表达量(图7)。
相对基因表达量测定结果为：工程恶臭假单胞菌KT-AB中鼠李糖脂合成相关的基因rhlA、rhlB 的相对表达倍数比工程恶臭假单胞菌KT-159分别提高了3.56倍和7.21倍。而KT-ABRI中鼠李糖脂合成相关的基因rhlA、rhlB、rhlR和rhlI的相对表达倍数比工程恶臭假单胞菌KT-159分别提高了6.27 倍、9.53.倍、3.21倍和4.58倍。
以上结果表明，携带含有Tac启动子和rhlA、rhlB、rhlR和rhlI基因的表达载体p2-rhlABRI-Tac 的工程恶臭假单胞菌具有更高的产鼠李糖脂活性，说明Tac启动子有效增强了rhlA、rhlB、rhlR和rhlI 四个基因在工程菌株的表达。
实施例4工程恶臭假单胞菌鼠李糖脂产量检验
以3％甘油为碳源，将1mL菌液接种在30℃下培养5天，之后将900mL发酵菌液在4℃8000rpm 条件下离心25分钟，取上清发酵液并进行过滤后，利用6M HCI调节其pH值为3，并在4℃的条件下使其静置12小时后得到沉淀。然后在4℃下以8000rpm离心20分钟以倒掉上清，得到沉淀物。用有机溶剂乙酸乙酯来溶解该沉淀物，用pH＝3值的强酸性水洗涤该物质，通过离心回收有机相并旋转蒸发。将蒸发后剩下的物质溶解在0.05M NaHCO3中，用有机试剂乙酸乙酯洗3次后通过离心回收水相。最后用12M HCl将水溶液调节至pH值为3，然后用乙酸乙酯再次萃取，最后将得到的油状物真空干燥。
HPLC条件：C18反相柱(150mm×46mm×5um)，采用梯度洗脱法，流动相为乙腈水溶液，具体的洗脱方法：用10％的乙腈处理1分钟，乙腈含量在20分钟内从10％增加到60％，并保持10 分钟后，乙腈含量在10分钟内从60％下降到10％。将样品溶于含2mM醋酸铵的10％的乙腈水溶液中，用2μL作为上样量，流速设置为0.3mL/min。
产鼠李糖脂测定结果(图8)为：工程菌株P.putida KT-159、P.putida KT-AB和P.putida KT-ABRI 在前3天鼠李糖脂的浓度随着时间不断增加，其中在第3天三株工程菌均达到最大值，分别为505.04 mg/L，439.85mg/L，601.7mg/L。P.putida KT-AB的最高产量比P.putida KT-159低，而P.putida KT-ABRI的最高产量比P.putida KT-159高96.66mg/L。这说明rhlR和rhlI这两个调控基因和Tac启动子在鼠李糖脂的合成中发挥关键性作用。
实施例5利用工程恶臭假单胞菌和大肠杆菌组成的混菌体系对多环芳烃菲进行降解
(1)将E.coli M123、P.putida KT-159、P.putida KT-AB及P.putida KT-ABRI分别以1％的体积比接种于100mL液体LB培养基中，30℃下220rpm培养至对数生长期。之后将上述四种菌液分别在 10000rpm的高速离心机下离心10mim，弃掉上清以收集菌体，最后用灭菌的磷酸盐缓冲液洗涤菌体三次并重悬，制备得到E.coli M123、P.putida KT-159、P.putida KT-AB及P.putida KT-ABRI四种用于后续降解的菌悬液。
(2)设计三种混菌体系，分别为：E.coli M123+P.putida KT-159，E.coli M123+P.putida KT-AB， E.coli M123+P.putida KT-ABR，将上述三种混菌体系分别同时接种到含有100mg/L菲的100mL无机盐培养基中，进行混菌体系对多环芳烃菲的降解实验(菌种之间的体积比为1：1。以E.coli M123+P. putida KT-159为例：100mL的无机盐培养基中同时加入1mL E.coli M123和1mL P.putida KT-159)。将2mL新鲜菌液加入到摇瓶中，在30℃，200rpm摇床中培养7天。
(3)培养7天后，用正己烷萃取培养基中底物，在萃取前，在每个摇瓶中加入芘作为内标，每瓶萃取2次，萃取液取至烧杯中，烧杯放在通风橱中等待正己烷挥发完全。待正己烷完全挥发，用色谱纯二氯甲烷稀释至1000-5000ppm，无水Na2SO4干燥，并通过0.22μm有机系膜过滤，之后装入2 mL进样瓶中，待测。
(4)使用气相色谱测定工程铜绿假单胞菌对多环芳烃菲的降解率。
降解率测定结果(图5)为：E.coli M123+P.putida KT-159，E.coli M123+P.putida KT-AB，E.coli M123+P.putida KT-ABRI在7天后的降解率分别为69.02％，66.54％和73.86％，相比于单独的E.coli M123对菲的降解率61.15％，双菌体系对菲的降解率均有了提升。其中E.coli M123+P.putida KT-ABRI 对菲的提高最多，在原来基础上提高了12.71％。
实施例6对混菌体系降解菲进行条件优化
作为优选，选择工程恶臭假单胞菌KT-ABRI探究混菌体系中IPTG含量、甘油添加量和接种时间及顺序对降解率的影响。在100mg/L的菲降解培养基中，以不加IPTG组为对照组，其它组分别在接种后添加终浓度为0.4mM，0.6mM，0.8mM，1mM，1.5mM，2mM的IPTG进行诱导。向体系中添加甘油作为假单胞菌产鼠李糖脂的营养物，甘油的添加量分别为0、0.5％、1％、2％、3％。降解菌E.coli M123和产表活菌P.putida KT-ABRI的接种时间和顺序分别按照同时接种；先接种大肠杆菌，24h后接种假单胞菌；先接种假单胞菌，24h后接种大肠杆菌。培养7天，每天进行菲的降解率测定。
降解率测定结果(图6)为：对菌株E.coli M123和P.putida KT-ABRI双菌体系的IPTG诱导浓度进行优化，双菌体系在IPTG浓度为0.8mM时降解率最高76.28％；在E.coliM123和P.putida KT-ABRI组成的双菌体系中不同添加量的甘油对菲降解效果的影响，在0.5％、1％、2％、3％甘油的培养基中100mg/L的实验组菲的降解率分别为75％，80.02％，73.51％和73.86％，均比不添加甘油的对照组均要有提升；降解7天后测得同时接种、先接种大肠杆菌，24h后接种假单胞菌、先接种假单胞菌，24h后接种大肠杆菌的最大降解率分别达到了78.22％，80.02％，85.73％。
实施例7模拟污染场地利用混菌体系对菲污染土壤的修复
土壤取样来自天津市武清区前沿技术研究院实验楼的一侧农田土。采取表面0～10cm的土壤。土壤的初步处理：将采样的土样经0.5mm孔径的筛网去除砂砾等大颗粒杂物后混合。
污染土壤的配制：向小花盆中加入150g土壤，准确称取0.54g的菲，将其溶解在54mL的正己烷中，配成100mg/L的溶液，在通风橱中，向12个装有150g土壤的小花盆中每个加入菲溶液5.4mL，使终浓度300mg/kg；如图4所示，同样准确称取0.18g的菲，将其溶解在18mL的正己烷中，配成 100mg/L的溶液，在通风橱中，向12个装有150g土壤的小花盆中每个加入菲溶液1.5mL，使终浓度100mg/kg。搅拌均匀，通风使正己烷挥发除去，定期翻动土壤，喷洒无菌水保证各组土壤中湿度约为15％。
将上述配制的污染土壤以表1所示的策略来进行模拟污染场地的修复实验，降解率测定结果(表 2)为S0条件下的去除效率最低，表明土著微生物在极度缺乏水分、营养物质的环境中很难将菲降解。和S0条件相比，S1修复条件下菲降解率有所提高，这说明，土壤种适当的含水率可增加污染土壤中氧气含量，从而促进土著微生物代谢难降解物质。当利用修复条件S2处理100mg/kg，300mg/kg的污染土壤时，45d其降解率分别可达56.04％，49.43％。利用修复条件S3和修复条件S4处理土壤时，去除菲的效率均显著提高，其中修复条件S3处理100mg/kg，300mg/kg的污染土壤时，45d其降解率分别可达83.84％，76.49％。其中S4条件下土壤菲的去除效率可达到86.52％和80.67％显著高于其他修复条件。
表1模拟多环芳烃污染场地降解实验的不同策略
Figure BDA0003519033490000081
表2不同修复策略的45天降解效果
Figure BDA0003519033490000082
以上内容是结合具体的/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 天津大学
<120> 用于多环芳烃菲降解的人工混菌体系及其工程改造方法和应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 888
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcgtcgcg agagcctgct ggtgagcgtg tgcaaaggcc tgcgcgtgca cgtggaacgc 60
gtcggccaag atccgggtcg cagcaccgtg atgctggtga acggtgccat ggccaccacc 120
gccagcttcg cccgtacctg caagtgcctg gccgagcact tcaacgtggt gctgttcgac 180
ctgccgttcg ccggtcagag ccgtcagcac aacccgcagc gtggcctgat caccaaggac 240
gacgaggtgg aaatcctgct ggccctgatc gagcgcttcg aggtgaacca cctggtgtcg 300
gccagctggg gtggcatcag caccctgctg gcgctgtcgc gtaacccacg tggcatccgc 360
agcagcgtgg tgatggcctt cgcgccaggt ctgaaccagg ccatgctgga ctacgtgggt 420
cgtgcccagg cgctgatcga actggacgac aagagcgcca tcggccatct gctgaacgaa 480
accgtgggca agtacctgcc accgcgtctg aaggccagca accatcagca catggcctcg 540
ctggccaccg gtgagtacga gcaagcccgt ttccacatcg accaggtcct ggcgctgaac 600
gaccgtggct acctggcctg cctggaacgc atccagtcgc acgtgcactt catcaacggc 660
agctgggacg agtacaccac cgcggaggat gcccgtcagt tccgcgacta cctgccgcac 720
tgcagcttca gccgtgtgga aggtaccggt cacttcctgg acctggaaag caagctggcc 780
gccgtgcgcg tccatcgtgc cctgctggaa catctgctga agcagccgga accgcagcgt 840
gccgaacgtg ccgccggttt ccacgaaatg gccatcggct acgcctga 888
<210> 2
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgcacgcca tcctgatcgc catcggcagc gccggtgacg tgttcccgtt catcggtctg 60
gcgcgtaccc tgaagctgcg tggccaccgt gtgagcctgt gcaccatccc ggtgttccgc 120
gacgccgtgg aacagcacgg tatcgccttc gtgccgctga gcgacgagct gacctaccgt 180
cgcaccatgg gcgatccgcg tctgtgggac cccaagacca gcttcggcgt gctgtggcag 240
gcgatcgcgg gtatgatcga gccggtgtac gagtacgtga gcgcccagcg ccacgacgac 300
atcgtggtgg tgggcagcct gtgggccctg ggtgcccgta tcgcccacga gaagtacggc 360
atcccgtacc tgtcggccca ggtgagccca agcaccctgc tgagcgcgca tctgccaccg 420
gtgcacccga agttcaacgt gcccgagcag atgccgctgg ccatgcgcaa actgctgtgg 480
cgctgcatcg agcgcttcaa gctggaccgt acctgcgcgc cagagatcaa cgccgtgcgt 540
cgcaaggtcg gcctggaaac cccagtgaag cgcatcttca cccagtggat gcacagccca 600
cagggcgtcg tgtgcctgtt cccagcctgg ttcgccccac cgcagcagga ttggccacag 660
ccgctgcaca tgaccggctt cccgctgttc gacggcagca tcccaggcac cccactggac 720
gacgaactgc agcgcttcct ggaccagggc agccgtccgc tggtgttcac ccagggtagc 780
accgagcatc tgcagggcga cttctatgcc atggcgctgc gtgccctgga acgcctgggt 840
gcgcgtggca tcttcctgac cggtgccggt caagagccgc tgcgtggtct gccgaaccac 900
gtgctgcagc gtgcctatgc gccactgggt gccctgctgc cgagctgcgc cggtctggtg 960
catccaggtg gcatcggtgc catgtcgctg gccctggccg ccggtgtgcc gcaagtgctg 1020
ctgccgtgcg cgcatgacca gttcgacaac gccgagcgcc tggtgcgtct gggctgcggc 1080
atgcgcctgg gcgtgccact gcgcgagcaa gaactgcgtg gtgccctgtg gcgtctgctg 1140
gaagatccag ccatggccgc cgcctgccgt cgcttcatgg aactgagcca gccgcactcg 1200
atcgcctgcg gcaaagccgc gcaagtggtg gaacgctgcc accgcgaagg tgatgcccgt 1260
tggctgaaag ccgccagctg a 1281
<210> 3
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgcgcaacg acggtggctt cctgctgtgg tgggatggcc tgcgcagcga gatgcagccg 60
atccacgata gccagggcgt gttcgccgtg ctggaaaaag aggtgcgtcg cctgggcttc 120
gactactacg cctacggcgt gcgccacacc atcccgttca cccgtccgaa aaccgaggtg 180
cacggcacct atccgaaggc ctggctggaa cgctaccaga tgcagaacta cggtgcggtg 240
gacccagcca tcctgaacgg cctgcgctcg tcggagatgg tggtgtggtc ggactcgctg 300
ttcgaccaga gccgcatgct gtggaacgaa gcccgtgact ggggtctgtg cgtgggtgcg 360
accctgccaa tccgtgcgcc aaacaacctg ctgagcgtgc tgtcggtggc ccgtgaccag 420
cagaacatca gcagcttcga gcgcgaggaa atccgcctgc gcctgcgctg catgatcgag 480
ctgctgaccc agaagctgac cgacctggaa cacccgatgc tgatgagcaa cccggtgtgc 540
ctgagccacc gcgagcgcga aatcctgcag tggaccgccg acggcaagag cagcggtgag 600
atcgccatca tcctgagcat cagcgagagc accgtgaact tccaccacaa gaacatccag 660
aaaaagttcg atgccccaaa caagaccctg gccgccgcct atgccgccgc gctgggtctg 720
atctga 726
<210> 4
<211> 606
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgatcgagc tgctgagcga gagcctggaa ggcctgagcg ccgccatgat cgccgagctg 60
ggtcgctacc gccaccaggt gttcatcgag aagctgggct gggacgtcgt gagcaccagc 120
cgtgtgcgcg accaagaatt cgaccagttc gaccatccgc agacccgcta catcgtggcc 180
atgggtcgcc agggcatctg cggttgcgcc cgtctgctgc caaccaccga cgcctacctg 240
ctgaaggacg tgttcgcgta cctgtgcagc gaaaccccac cgagcgaccc gagcgtgtgg 300
gagctgagcc gctatgccgc ctcggccgcc gatgatccgc agctggcgat gaaaatcttc 360
tggtcgagcc tgcagtgcgg ctggtatctg ggtgccagca gcgtggtggc cgtgaccacc 420
accgccatgg aacgctactt cgtgcgcaac ggcgtgatcc tgcagcgcct gggtccgcca 480
cagaaggtga agggcgaaac cctggtggcc atcagcttcc cagcctacca agagcgtggc 540
ctggaaatgc tgctgcgcta ccatccggaa tggctgcagg gcgtgccgct gagcatggcc 600
gtgtga 606
<210> 5
<211> 9548
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
accttcggga gcgcctgaag cccgttctgg acgccctggg gccgttgaat cgggatatgc 60
aggccaaggc cgccgcgatc atcaaggccg tgggcgaaaa gctgctgacg gaacagcggg 120
aagtccagcg ccagaaacag gcccagcgcc agcaggaacg cgggcgcgca catttccccg 180
aaaagtgcca cctgggatga atgtcagcta ctgggctatc tggacaaggg aaaacgcaag 240
cgcaaagaga aagcaggtag cttgcagtgg gcttacatgg cgatagctag actgggcggt 300
tttatggaca gcaagcgaac cggaattgcc agctggggcg ccctctggta aggttgggaa 360
gccctgcaaa gtaaactgga tggctttctt gccgccaagg atctgatggc gcaggggatc 420
aagatctgat caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca 480
cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac 540
aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt 600
tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc 660
gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg 720
aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc 780
tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc 840
ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat 900
ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc 960
cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca 1020
tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga 1080
ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat 1140
tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc 1200
tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagcgggact 1260
ctggggttcg aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc 1320
accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg 1380
atcctccagc gcggggatct catgctggag ttcttcgccc acccccatgg gcaaatatta 1440
tacgcaaggc gacaaggtgc tgatgccgct ggcgattcag gttcatcatg ccgtttgtga 1500
tggcttccat gtcggcagaa tgcttaatga attacaacag tttttatgca tgcgcccaat 1560
acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt 1620
tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta 1680
ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg 1740
ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcgcg caattaaccc 1800
tcactaaagg gaacaaaagc tgggtaccgg gccccccctc gaggtcgacg gtatcgataa 1860
gcttttcgac accggaaacc gggcctggcg cccggttttt tcatgccttt tccgccaacc 1920
cctcgctgtt ccccgccggc cgctctggca cgccttatcg cgggcgggca ggggcttatg 1980
cgcaggcgac cgcccgtcct gtgaaatctg gcagttaccg ttagctttcg aattggctaa 2040
aaggcgttca tcggctacgc gtgaacacgg acgccaatcg tttgcgcagg ccgatctgca 2100
agacccacac aagcccctcg cctgaagggg tacgcatccg ccgtggctgg tccgcgcgga 2160
tggccgctga gttacttgtc tgccgttcga acaataagaa cgaactctac gtaatgccgg 2220
gatacccgtg gcagcgatag ctgtttgcct gttcgaaaat ttttgggagg tgtgagatgc 2280
ggcgcgaaag tctgttggta tcggtttgca agggcctgcg ggtacatgtc gagcgcgttg 2340
ggcaagatcc cgggcgcagc acggtgatgc tggtcaacgg cgcgatggcg accaccgcct 2400
cgttcgcccg gacctgcaag tgcctggccg aacatttcaa cgtggtgctg ttcgacctgc 2460
ccttcgccgg gcagtcgcgg cagcacaacc cgcagcgcgg gttgatcacc aaggacgacg 2520
aggtggaaat cctcctggcg ctgatcgagc gcttcgaggt caatcacctg gtctccgcgt 2580
cctggggcgg tatctccacg ctgctggcgc tgtcgcgcaa tccgcgcggt atccgcagct 2640
cggtggtgat ggcattcgcc cctggactga accaggcgat gctcgactac gtcgggcggg 2700
cgcaggcgct gatcgagctg gacgacaagt cggcgatcgg ccatctgctc aacgagaccg 2760
tcggcaaata cctgccgccg cgcctgaaag ccagcaacca tcagcacatg gcttcgctgg 2820
ccaccggcga atacgagcag gcgcgctttc acatcgacca ggtgctggcg ctcaacgatc 2880
ggggctacct ggcttgcctg gagcggatcc agagccacgt gcatttcatc aacggcagct 2940
gggacgagta caccaccgcc gaggacgccc gccagttccg cgactacctg ccgcactgca 3000
gtttctcgcg ggtggagggc accgggcatt tcctcgacct ggagtccaag ctggccgcgg 3060
tacgcgtgca ccgcgccctg ctcgagcacc tgctgaagca accggagccg cagcgggcgg 3120
aacgcgcggc gggattccac gagatggcca tcggctacgc ctgaaccctt gacctgcgaa 3180
gacccggcct ggccgggctt tgcggtcgca taacgcacgg agtagcccca tgcacgccat 3240
cctcatcgcc atcggctcgg ccggcgacgt atttcccttc atcggcctgg cccggaccct 3300
gaaactgcgc gggcaccgcg tgagcctctg caccatcccg gtgtttcgcg acgcggtgga 3360
gcagcacggc atcgcgtttg tcccgctgag cgacgaactg acctaccgcc ggaccatggg 3420
cgatccgcgc ctgtgggacc ccaagacgtc cttcggcgtg ctctggcaag ccatcgccgg 3480
gatgatcgag ccggtctacg agtacgtctc ggcgcagcgc catgacgaca tcgtggtggt 3540
cggctcgcta tgggcgctgg gcgcacgcat cgctcacgag aagtacggga ttccctacct 3600
gtccgcgcag gtctcgccat cgaccctgtt gtcggcgcac ctgccgccgg tacaccccaa 3660
gttcaacgtg cccgagcaga tgccgctggc gatgcgcaag ctgctctggc gctgcatcga 3720
gcgcttcaag ctggatcgca cctgcgcgcc ggagatcaac gcggtgcgcc gcaaggtcgg 3780
cctggaaacg ccggtgaagc gcatcttcac ccaatggatg cattcgccgc agggcgtggt 3840
ctgcctgttc ccggcctggt tcgcgccgcc ccagcaggat tggccgcaac ccctgcacat 3900
gaccggcttc ccgctgttcg acggcagtat cccggggacc ccgctcgacg acgaactgca 3960
acgctttctc gatcagggca gccggccgct ggtgttcacc cagggctcga ccgaacacct 4020
gcagggcgac ttctacgcca tggccctgcg cgcgctggaa cgcctcggcg cgcgtgggat 4080
cttcctcacc ggcgccggcc aggaaccgct gcgcggcttg ccgaaccacg tgctgcagcg 4140
tgcctacgcg ccactgggag ccttgctgcc atcgtgcgcc gggctggtcc atccgggcgg 4200
tatcggcgcc atgagcctag ccttggcggc gggggtgccg caggtgctgc tgccctgtgc 4260
ccacgaccag ttcgacaatg ccgaacggct ggtccggctc ggctgcggga tgcgcctggg 4320
cgtgccgttg cgcgagcagg agttgcgcgg ggcgctgtgg cgcttgctcg aggacccggc 4380
catggcggcg gcctgtcggc gtttcatgga attgtcacaa ccgcacagta tcgcttgcgg 4440
taaagcggcc caggtggtcg aacgttgtca tagggagggg gatgctcggt ggctgaaggc 4500
tgcgtcctga acggtgctgg cataacagat agggttgcca tgattttgcc gtatcggcaa 4560
ggctgcgcgc ttgacagcgt cataccccgg gccaattctg ctgtgatgca ttttatcgat 4620
cagggcttac tgcaatgagg aatgacggag gctttttgct gtggtgggac ggtttgcgta 4680
gcgagatgca gccgatccac gacagccagg gcgtgttcgc cgtcctggaa aaggaagtgc 4740
ggcgcctggg cttcgattac tacgcctatg gcgtgcgcca cacgattccc ttcacccggc 4800
cgaagaccga ggtccatggc acctatccca aggcctggct ggagcgatac cagatgcaga 4860
actacggggc cgtggatccg gcgatcctca acggcctgcg ctcctcggaa atggtggtct 4920
ggagcgacag cctgttcgac cagagccgga tgctctggaa cgaggctcgc gattggggcc 4980
tctgtgtcgg cgcgaccctg ccgatccgcg cgccgaacaa tttgctcagc gtgctttccg 5040
tggcgcgcga ccagcagaac atctccagct tcgagcgcga ggaaatccgc ctgcggctgc 5100
gttgcatgat cgagttgctg acccagaagc tgaccgacct ggagcatccg atgctgatgt 5160
ccaacccggt ctgcctgagc catcgcgaac gcgagatcct gcaatggacc gccgacggca 5220
agagttccgg ggaaatcgcc atcatcctga gcatctccga gagcacggtg aacttccacc 5280
acaagaacat ccagaagaag ttcgacgcgc cgaacaagac gctggctgcc gcctacgccg 5340
cggcgctggg cctcatctga agcgtagggg cgccggccgg cgcgccctac cagatctggc 5400
aggttgcctg ccgttcatcc tcctttagtc ttccccctca tgtgtatgct ggtatgtcct 5460
ccgactgaga gggcccagga gtatcagggt agggatgccg cctttttttt ctcggccggc 5520
acgacacggg gacttggtca tgatcgaatt gctctctgaa tcgctggaag ggctttccgc 5580
cgccatgatc gccgagctgg gacgctaccg gcatcaagtc ttcatcgaga agctgggctg 5640
ggacgtggtc tccacctcca gggtccgcga ccaggaattc gaccagttcg accatccgca 5700
aacccgctac atcgtcgcca tgggccgcca gggcatctgc ggttgcgccc gcctgctgcc 5760
gacgaccgac gcctacctgc tcaaggacgt cttcgcctac ctgtgcagcg aaaccccgcc 5820
gagcgatccg tcggtctggg agctttcgcg ctacgccgcc agcgcggcgg acgatccgca 5880
gctggcgatg aagatattct ggtccagcct gcaatgcggc tggtacctgg gggccagttc 5940
ggtggtggcg gtgaccacca cggccatgga gcgctatttc gttcgcaacg gcgtgatcct 6000
ccagcgcctc ggcccgccgc agaaggtcaa gggcgagacg ctggtcgcga tcagcttccc 6060
ggcctaccag gagcgcggcc tggagatgct gttgcgctac cacccggaat ggctgcaggg 6120
tgtaccgctg tcgatggcgg tgtgaggtcg tcagccgttt cgcgcacttt tttccgcttc 6180
tcctgccgca tgctcggccc gcgccccggc gtcatcgggc gttcccctgc attccgggat 6240
ttggccgcgg ctgccgactt gcgtagtctc tctgcggtcc gccatcccga ggagtcgcca 6300
tgcctctaga gcggccgcca ccgcggtgga gctccaattc gccctatagt gagtcgtatt 6360
acgcgcgctc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc 6420
aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc 6480
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taatattttg ttaaaattcg cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata 6600
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gccaccggtg agtacgagca agcccgtttc cacatcgacc aggtcctggc gctgaacgac 2640
cgtggctacc tggcctgcct ggaacgcatc cagtcgcacg tgcacttcat caacggcagc 2700
tgggacgagt acaccaccgc ggaggatgcc cgtcagttcc gcgactacct gccgcactgc 2760
agcttcagcc gtgtggaagg taccggtcac ttcctggacc tggaaagcaa gctggccgcc 2820
gtgcgcgtcc atcgtgccct gctggaacat ctgctgaagc agccggaacc gcagcgtgcc 2880
gaacgtgccg ccggtttcca cgaaatggcc atcggctacg cctgacccgt tctggataat 2940
gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc tgaaatgagc tgttgacaat 3000
taatcatcgg ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac 3060
agaattcata cgtatttaaa tcaggagtgg aatactagat gcacgccatc ctgatcgcca 3120
tcggcagcgc cggtgacgtg ttcccgttca tcggtctggc gcgtaccctg aagctgcgtg 3180
gccaccgtgt gagcctgtgc accatcccgg tgttccgcga cgccgtggaa cagcacggta 3240
tcgccttcgt gccgctgagc gacgagctga cctaccgtcg caccatgggc gatccgcgtc 3300
tgtgggaccc caagaccagc ttcggcgtgc tgtggcaggc gatcgcgggt atgatcgagc 3360
cggtgtacga gtacgtgagc gcccagcgcc acgacgacat cgtggtggtg ggcagcctgt 3420
gggccctggg tgcccgtatc gcccacgaga agtacggcat cccgtacctg tcggcccagg 3480
tgagcccaag caccctgctg agcgcgcatc tgccaccggt gcacccgaag ttcaacgtgc 3540
ccgagcagat gccgctggcc atgcgcaaac tgctgtggcg ctgcatcgag cgcttcaagc 3600
tggaccgtac ctgcgcgcca gagatcaacg ccgtgcgtcg caaggtcggc ctggaaaccc 3660
cagtgaagcg catcttcacc cagtggatgc acagcccaca gggcgtcgtg tgcctgttcc 3720
cagcctggtt cgccccaccg cagcaggatt ggccacagcc gctgcacatg accggcttcc 3780
cgctgttcga cggcagcatc ccaggcaccc cactggacga cgaactgcag cgcttcctgg 3840
accagggcag ccgtccgctg gtgttcaccc agggtagcac cgagcatctg cagggcgact 3900
tctatgccat ggcgctgcgt gccctggaac gcctgggtgc gcgtggcatc ttcctgaccg 3960
gtgccggtca agagccgctg cgtggtctgc cgaaccacgt gctgcagcgt gcctatgcgc 4020
cactgggtgc cctgctgccg agctgcgccg gtctggtgca tccaggtggc atcggtgcca 4080
tgtcgctggc cctggccgcc ggtgtgccgc aagtgctgct gccgtgcgcg catgaccagt 4140
tcgacaacgc cgagcgcctg gtgcgtctgg gctgcggcat gcgcctgggc gtgccactgc 4200
gcgagcaaga actgcgtggt gccctgtggc gtctgctgga agatccagcc atggccgccg 4260
cctgccgtcg cttcatggaa ctgagccagc cgcactcgat cgcctgcggc aaagccgcgc 4320
aagtggtgga acgctgccac cgcgaaggtg atgcccgttg gctgaaagcc gccagctgaa 4380
tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc 4440
ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg gatttgaacg ttgcgaagca 4500
acggcccgga gggtggcggg caggacgccc gccataaact gccaggcatc aaattaagca 4560
gaaggccatc ctgacggatg gccttttgga tcccccgttc tggataatgt tttttgcgcc 4620
gacatcataa cggttctggc aaatattctg aaatgagctg ttgacaatta atcatcggct 4680
cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag aattcatacg 4740
tatttaaatc aggagtggaa tactagatgc gcaacgacgg tggcttcctg ctgtggtggg 4800
atggcctgcg cagcgagatg cagccgatcc acgatagcca gggcgtgttc gccgtgctgg 4860
aaaaagaggt gcgtcgcctg ggcttcgact actacgccta cggcgtgcgc cacaccatcc 4920
cgttcacccg tccgaaaacc gaggtgcacg gcacctatcc gaaggcctgg ctggaacgct 4980
accagatgca gaactacggt gcggtggacc cagccatcct gaacggcctg cgctcgtcgg 5040
agatggtggt gtggtcggac tcgctgttcg accagagccg catgctgtgg aacgaagccc 5100
gtgactgggg tctgtgcgtg ggtgcgaccc tgccaatccg tgcgccaaac aacctgctga 5160
gcgtgctgtc ggtggcccgt gaccagcaga acatcagcag cttcgagcgc gaggaaatcc 5220
gcctgcgcct gcgctgcatg atcgagctgc tgacccagaa gctgaccgac ctggaacacc 5280
cgatgctgat gagcaacccg gtgtgcctga gccaccgcga gcgcgaaatc ctgcagtgga 5340
ccgccgacgg caagagcagc ggtgagatcg ccatcatcct gagcatcagc gagagcaccg 5400
tgaacttcca ccacaagaac atccagaaaa agttcgatgc cccaaacaag accctggccg 5460
ccgcctatgc cgccgcgctg ggtctgatct gacccgttct ggataatgtt ttttgcgccg 5520
acatcataac ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcggctc 5580
gtataatgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacaga attcatacgt 5640
atttaaatca ggagtggaat actagatgat cgagctgctg agcgagagcc tggaaggcct 5700
gagcgccgcc atgatcgccg agctgggtcg ctaccgccac caggtgttca tcgagaagct 5760
gggctgggac gtcgtgagca ccagccgtgt gcgcgaccaa gaattcgacc agttcgacca 5820
tccgcagacc cgctacatcg tggccatggg tcgccagggc atctgcggtt gcgcccgtct 5880
gctgccaacc accgacgcct acctgctgaa ggacgtgttc gcgtacctgt gcagcgaaac 5940
cccaccgagc gacccgagcg tgtgggagct gagccgctat gccgcctcgg ccgccgatga 6000
tccgcagctg gcgatgaaaa tcttctggtc gagcctgcag tgcggctggt atctgggtgc 6060
cagcagcgtg gtggccgtga ccaccaccgc catggaacgc tacttcgtgc gcaacggcgt 6120
gatcctgcag cgcctgggtc cgccacagaa ggtgaagggc gaaaccctgg tggccatcag 6180
cttcccagcc taccaagagc gtggcctgga aatgctgctg cgctaccatc cggaatggct 6240
gcagggcgtg ccgctgagca tggccgtgtg aatcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa 6300
gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat 6360
ccgccgggag cggatttgaa cgttgcgaag caacggcccg gagggtggcg ggcaggacgc 6420
ccgccataaa ctgccaggca tcaaattaag cagaaggcca tcctgacgga tggccttttg 6480
agctccaatt cgccctatag tgagtcgtat tacgcgcgct cactggccgt cgttttacaa 6540
cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct 6600
ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc 6660
agcctgaatg gcgaatggaa attgtaagcg ttaatatttt gttaaaattc gcgttaaatt 6720
tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgactg cgatgagtgg cagggcgggg 6780
cgtaattttt ttaaggcagt tattggtgcc cttaaacgcc tggtgctacg cctgaataag 6840
tgataataag cggatgaatg gcagaaattc gaaagcaaat tcgacccggt cgtcggttca 6900
gggcagggtc gttaaatagc cgcttatgtc tattgctggt ttaccggttt attgactacc 6960
ggaagcagtg tgaccgtgtg cttctcaaat gcctgaggcc agtttgctca ggctctcccc 7020
gtggaggtaa taattgacga tatgatcatt tattctgcct cccagagcct gataaaaacg 7080
gtgaatccgt tagcgaggtg ccgccggctt ccattcaggt cgaggtggcc cggctccatg 7140
caccgcgacg caacgcgggg aggcagacaa ggtatagggc ggcgaggcgg ctacagccga 7200
tagtctggaa cagcgcactt acgggttgct gcgcaaccca agtgctaccg gcgcggcagc 7260
gtgacccgtg tcggcggctc caacggctcg ccatcgtcca gaaaacacgg ctcatcgggc 7320
atcggcaggc gctgctgccc gcgccgttcc cattcctccg tttcggtcaa ggctggcagg 7380
tctggttcca tgcccggaat gccgggctgg ctgggcggct cctcgccggg gccggtcggt 7440
agttgctgct cgcccggata cagggtcggg atgcggcgca ggtcgccatg ccccaacagc 7500
gattcgtcct ggtcgtcgtg atcaaccacc acggcggcac tgaacaccga caggcgcaac 7560
tggtcgcggg gctggcccca cgccacgcgg tcattgacca cgtaggccga cacggtgccg 7620
gggccgttga gcttcacgac ggagatccag cgctcggcca ccaagtcctt gactgcgtat 7680
tggaccgtcc gcaaagaacg tccgatgagc ttggaaagtg tcttctggct gaccaccacg 7740
gcgttctggt ggcccatctg cgccacgagg tgatgcagca gcattgccgc cgtgggtttc 7800
ctcgcaataa gcccggccca cgcctcatgc gctttgcgtt ccgtttgcac ccagtgaccg 7860
ggcttgttct tggcttgaat gccgatttct ctggactgcg tggccatgct tatctccatg 7920
cggtagggtg ccgcacggtt gcggcaccat gcgcaatcag ctgcaacttt tcggcagcgc 7980
gacaacaatt atgcgttgcg taaaagtggc agtcaattac agattttctt taacctacgc 8040
aatgagctat tgcggggggt gccgcaatga gctgttgcgt accccccttt tttaagttgt 8100
tgatttttaa gtctttcgca tttcgcccta tatctagttc tttggtgccc aaagaagggc 8160
acccctgcgg ggttccccca cgccttcggc gcggctcccc ctccggcaaa aagtggcccc 8220
tccggggctt gttgatcgac tgcgcggcct tcggccttgc ccaaggtggc gctgccccct 8280
tggaaccccc gcactcgccg ccgtgaggct cggggggcag gcgggcgggc ttcgccttcg 8340
actgccccca ctcgcatagg cttgggtcgt tccaggcgcg tcaaggccaa gccgctgcgc 8400
ggtcgctgcg cgagccttga cccgccttcc acttggtgtc caaccggcaa gcgaagcgcg 8460
caggccgcag gccggaggct tttccccaga gaaaattaaa aaaattgatg gggcaaggcc 8520
gcaggccgcg cagttggagc cggtgggtat gtggtcgaag gctgggtagc cggtgggcaa 8580
tccctgtggt caagctcgtg ggcaggcgca gcctgtccat cagcttgtcc agcagggttg 8640
tccacgggcc gagcgaagcg agccagccgg tggccgctcg cggccatcgt ccacatatcc 8700
acgggctggc aagggagcgc agcgaccgcg cagggcgaag cccggagagc aagcccgtag 8760
ggcgccgcag ccgccgtagg cggtcacgac tttgcgaagc aaagtctagt gagtatactc 8820
aagcattgag tggcccgccg gaggcaccgc cttgcgctgc ccccgtcgag ccggttggac 8880
accaaaaggg aggggcaggc atggcggcat acgcgatcat gcgatgcaag aagctggcga 8940
aaatgggcaa cgtggcggcc agtctcaagc acgcctaccg cgagcgcgag acgcccaacg 9000
ctgacgccag caggacgcca gagaacgagc actgggcggc cagcagcacc gatgaagcga 9060
tgggccgact gcgcgagttg ctgccagaga agcggcgcaa ggacgctgtg ttggcggtcg 9120
agtacgtcat gacggccagc ccggaatggt ggaagtcggc cagccaagaa cagcaggcgg 9180
cgttcttcga gaaggcgcac aagtggctgg cggacaagta cggggcggat cgcatcgtga 9240
cggccagcat ccaccgtgac gaaaccagcc cgcacatgac cgcgttcgtg gtgccgctga 9300
cgcaggacgg caggctgtcg gccaaggagt tcatcggcaa caaagcgcag atgacccgcg 9360
accagaccac gtttgcggcc gctgtggccg atctagggct gcaacggggc atcgagggca 9420
gcaaggcacg tcacacgcgc attcaggcgt tctacgaggc cctggagcgg ccaccagtgg 9480
gccacgtcac catcagcccg caagcggtcg agccacgcgc ctatgcaccg cagggattgg 9540
ccgaaaagct gggaatctca aagcgcgttg agacgccgga agccgtggcc gaccggctga 9600
caaaagcggt tcggcagggg tatgagcctg ccctacaggc cgccgcagga gcgcgtgaga 9660
tgcgcaagaa ggccgatcaa gcccaagaga cggcccgag 9699

Claims (5)

1.一类用于多环芳烃降解的人工混菌体系；其特征是，具体包括三种：
一是E.coli M123+P.putida KT-159；
二是E.coli M123+P.putida KT-AB；
三是E.coli M123+P.putida KT-ABRI。
2.用于多环芳烃降解的人工混菌体系工程改造方法，其特征是，人工混菌体系包括E.coli M123、P.putida KT2440、转入P.putida KT2440的三种表达载体p2-rhlABRI、p2-rhlAB-Tac及p2-rhlABRI-Tac、相关启动子、参与多环芳烃降解和产表面活性剂的关键基因；三种表达载体p2-rhlABRI、p2-rhlAB-Tac及p2-rhlABRI-Tac是经人工设计后交由生物工程有限公司合成；将公司合成的上述三个表达载体p2-rhlABRI、p2-rhlAB-Tac及p2-rhlABRI-Tac分别转化至P.putida KT2440中得到三种产鼠李糖脂的基因工程菌——P.putida KT-159、P.putida KT-AB及P.putida KT-ABRI。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是，包括如下步骤：
1)通过文献调研确定与合成鼠李糖脂的相关基因的核苷酸序列，包括rhlA、rhlB、rhlR和rhlI，对应的基因序列如SEQ ID No.1-4所示；
2)选择广宿主质粒pBBR1MCS-2质粒作为载体，在软件上将相关基因和质粒连接，得到表达载体p2-rhlABRI、p2-rhlAB-Tac及p2-rhlABRI-Tac质粒，相对应的核苷酸序列如SEQID No.5-7所示；
3)通过电击法将公司合成的上述三个表达载体p2-rhlABRI、p2-rhlAB-Tac及p2-rhlABRI-Tac转入P.putida KT2440中，分别得到具有鼠李糖脂合成功能的三种基因工程菌——P.putida KT-159、P.putida KT-AB及P.putida KT-ABRI(命名原则是：借鉴原始菌株P.putida KT2440的命名，159为随机数字，AB和ABRI分别代表基因rhlA、rhlB以及rhlA、rhlB、rhlR和rhlI)。
4.如权利要求3所述的方法，其特征是，p2-rhlABRI是质粒pBBR1MCS-2上连接有rhlA、rhlB、rhlR和rhlI四个基因；p2-rhlAB-Tac是质粒pBBR1MCS-2上连接有rhlA和rhlB这两个基因和Tac启动子；p2-rhlABRI-Tac是质粒pBBR1MCS-2上连接有rhlA、rhlB、rhlR和rhlI四个基因和Tac启动子。
5.权利要求1的用于多环芳烃降解的人工混菌体系在多环芳烃菲污染物降解中的应用。
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