CN116731944A

CN116731944A - 一种耐盐对硝基苯酚矿化菌株及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN116731944A
Application number: CN202310723544.XA
Authority: CN
Inventors: 刘瑞华; 杨超; 赵婉婉
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2023-06-19
Filing date: 2023-06-19
Publication date: 2023-09-12

Abstract

本发明属于基因工程菌构建技术领域，涉及一种耐盐对硝基苯酚矿化菌株及其构建方法和应用。本发明提供了一种耐盐对硝基苯酚矿化菌株，所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株为基因组中upp基因缺失且插入强启动子和PNP矿化途径基因的渴望盐单胞菌(Halomonascupida)J9菌株。本发明所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株不仅能够高效修复PNP环境污染，而且对高盐极端环境胁迫有很好的耐受能力。

Description

一种耐盐对硝基苯酚矿化菌株及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程菌株构建技术领域，具体涉及一种耐盐对硝基苯酚矿化菌株及其构建方法和应用。

背景技术

启动子已经成为代谢工程及合成生物学的重要工具，利用不同的启动子对代谢途径中关键基因的转录水平进行调节，优化关键酶的表达，能够提高微生物合成重要生物基化学品的能力。通过构建启动子文库的启动子工程已经成为获得和筛选启动子的重要手段。

越来越多微生物的全基因组及其在不同培养条件下的转录组得以完成测序。基于这些测序数据中包含有许多有价值的遗传元件和信息，比如：内源性启动子。微生物基因组可以被视为庞大的天然启动子储存文库，而转录组测序(RNA-seq)数据可以作为从中进行内源启动子初步筛选的重要依据，提供一种可供选择的策略来进行不同类型的内源启动子的筛选，用于代谢途径的改造和优化。

但目前并没有一种基于启动子工程构建的能够高效修复PNP环境污染且对高盐极端环境胁迫有耐受能力的菌株。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐盐对硝基苯酚矿化菌株及其构建方法和应用。本发明所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株不仅能够高效修复PNP环境污染，而且对高盐极端环境胁迫有很好的耐受能力。

本发明提供了一种耐盐对硝基苯酚矿化菌株，所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株为基因组中upp基因缺失且插入强启动子和PNP矿化途径基因的渴望盐单胞菌(Halomonascupida)J9菌株。

优选的是，所述强启动子包括P15或P8_KT；所述P15的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述P8_KT的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的是，所述PNP矿化途径基因包括pnpA、pnpB、pnpC、pnpD、pnpE和pnpF基因。

优选的是，所述渴望盐单胞菌J9U菌株的基因组中还插入gfp基因。

本发明还提供了上述技术方案所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株的构建方法，包括以下步骤：

将H.cupidaJ9中完整的反向筛选标记基因upp进行敲除，获得H.cupidaJ9U；

将H.cupidaJ9中完整的反向筛选标记基因upp连接到pK18mobSacB上，得到pKJU质粒载体；

利用所述pKJU质粒载体，将强启动子与PNP矿化途径基因通过无痕基因编辑方法整合至H.cupidaJ9U无痕基因编辑菌株的基因组中，获得耐盐对硝基苯酚矿化菌株。

优选的是，还包括利用所述pKJU质粒载体，将gfp基因通过无痕基因编辑方法整合至H.cupidaJ9U无痕基因编辑菌株的基因组中。

本发明还提供了一种耐盐对硝基苯酚矿化菌株J9U-P8_KTPNP或J9U-P15PNP，所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株J9U-P8_KTPNP为基因组中upp基因缺失且插入强启动子P8_KT和PNP矿化途径基因pnpA、pnpB、pnpC、pnpD、pnpE和pnpF以及插入启动子P_lac和gfp基因的渴望盐单胞菌J9菌株；

缺失的upp基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

插入强启动子P8_KT和PNP矿化途径基因pnpA、pnpB、pnpC、pnpD、pnpE和pnpF以及插入启动子P_lac和gfp基因包括在基因组中插入P8_KT-pnpAB&P_lac-gfp、P8_KT-pnpCD、P8_KT-pnpE和P8_KT-pnpF；所述P8_KT-pnpAB&P_lac-gfp的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述P8_KT-pnpCD的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述P8_KT-pnpE的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述P8_KT-pnpF的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株J9U-P15PNP为基因组中upp基因缺失且插入强启动子P15和PNP矿化途径基因pnpA、pnpB、pnpC、pnpD、pnpE和pnpF以及插入启动子P_lac和gfp基因的渴望盐单胞菌J9菌株；

缺失的upp基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

插入强启动子P15和PNP矿化途径基因pnpA、pnpB、pnpC、pnpD、pnpE和pnpF以及插入启动子P_lac和gfp基因包括在基因组中插入P15-pnpAB&P_lac-gfp、P15-pnpCD、P15-pnpE和P15-pnpF；所述P15-pnpAB&P_lac-gfp的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述P15-pnpCD的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述P15-pnpE的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述P15-pnpF的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

本发明还提供了上述技术方案所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株J9U-P8_KTPNP或J9U-P15PNP的构建方法，所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株J9U-P8_KTPNP的构建方法包括以下步骤：

将P8_KT-pnpAB&P_lac-gfp、P8_KT-pnpCD、P8_KT-pnpE及P8_KT-pnpF基因及各基因插入位点的上、下游同源臂分别与pKJU质粒载体进行连接，获得基因插入载体，通过接合转化的方法将基因插入载体转化入H.cupidaJ9U中，使用卡那霉素抗性筛选得到发生第一次单交换的重组子，重组子在含有5-Fu培养基再次筛选得到经过第二次交换的目标基因插入菌株，最终获得耐盐对硝基苯酚矿化菌株，命名为J9U-P8_KTPNP；

所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株J9U-P15PNP的构建方法保护以下步骤：

将P15-pnpAB&P_lac-gfp、P15-pnpCD、P15-pnpE及P15-pnpF基因及各基因插入位点的上、下游同源臂分别与pKJU质粒载体进行连接，获得基因插入载体，通过接合转化的方法将基因插入载体转化入H.cupida J9U中，使用卡那霉素抗性筛选得到发生第一次单交换的重组子，重组子在含有5-Fu培养基再次筛选得到经过第二次交换的目标基因插入菌株，最终获得耐盐对硝基苯酚矿化菌株，命名为J9U-P15PNP。

本发明还提供了上述技术方案所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株或上述技术方案所述构建方法构建得到的耐盐对硝基苯酚矿化菌株或上述技术方案所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株J9U-P8_KTPNP或J9U-P15PNP或上述技术方案所述构建方法构建得到的耐盐对硝基苯酚矿化菌株J9U-P8_KTPNP或J9U-P15PNP在制备高盐浓度下降解PNP的产品中的应用。

本发明还提供了强启动子P15或P8_KT在构建耐盐对硝基苯酚矿化菌株中的应用；所述P15的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述P8_KT的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了一种耐盐对硝基苯酚矿化菌株。本发明所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株不仅能够高效修复PNP环境污染，而且对高盐极端环境胁迫有很好的耐受能力。本发明具体分别以P8_KT和P15作为启动子，转入PNP矿化途径基因和GFP基因，构建得到工程菌株J9U-P8_KT PNP和J9U-P15PNP，首次证明了以嗜盐菌H.cupida J9U作为底盘细菌，并结合合成生物学和启动子工程策略构建既耐盐又能高效矿化对硝基苯酚的工程菌。此外，工程菌株J9U-P8_KT PNP和J9U-P15PNP中引入GFP蛋白为菌株在环境修复中的监测提供了可能。因此，GFP标记的工程菌株J9U-P8_KT PNP和J9U-P15PNP释放到污染的环境中进行生物修复时，可以通过荧光对其进行追踪。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的J9的5-FU敏感性测试结果图；

图2为本发明提供的upp基因敲除过程示意图；

图3为本发明提供的底盘菌株J9U验证结果图；

图4为本发明提供的J9U的5-FU敏感性测试结果图；

图5为本发明提供的启动子表征载体的构建结果图；

图6为本发明提供的基因插入载体构建示意图；

图7为本发明提供的在线启动子预测软件的预测界面结果图；

图8为本发明提供的启动子表征载体的PCR验证电泳图；

图9为本发明提供的启动子表征载体的PCR验证电泳图；

图10为本发明提供的启动子表征载体的PCR验证电泳图；

图11为本发明提供的构建的所有工程菌株的生长曲线结果图；

图12为本发明提供的GFP在各种内源启动子作用下的转录水平结果图；

图13为本发明提供的gfp在各个启动子下表达荧光蛋白的相对荧光强度结果图；

图14为本发明提供的pnpAB基因过表达工程菌株的电泳图；

图15为本发明提供的RT-qPCR分析五株过表达工程菌中pnpA和pnpB基因的转录情况结果图；

图16为本发明提供的GC分析结果图；

图17为本发明提供的GC测定不同时间点PNP降解情况图；

图18为本发明提供的7个外源基因的组装示意图；

图19为本发明提供的H.cupida J9U中PNP生物降解过程示意图；

图20为本发明提供的工程菌J9U-P8_KTPNP(A)和J9U-P15PNP(B)基因组中PNP降解基因及gfp的电泳检测图；

图21为本发明提供的RT-PCR检测H.cupida J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP中7个外源基因的转录结果图；

图22为本发明提供的共聚焦扫描显微镜下观察结果图；

图23为本发明提供的工程菌株生长情况图；

图24为本发明提供的J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP在培养20代后菌株中PNP降解基因的PCR检测情况结果图；

图25为本发明提供的J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP菌株的降解基因转录及PNP矿化的验证图；

图26为本发明提供的同位素分析证实J9U-P8KTPNP和J9U-P15PNP对13C-PNP的矿化作用；

图27为本发明提供的J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP中PNP的C代谢流分析图。

具体实施方式

本发明提供了一种耐盐对硝基苯酚矿化菌株，所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株为基因组中upp基因缺失且插入强启动子和PNP矿化途径基因的渴望盐单胞菌(Halomonascupida)J9菌株。本发明对所述渴望盐单胞菌(Halomonas cupida)J9菌株的来源没有特殊限定，选用常规已报道的渴望盐单胞菌(Halomonas cupida)J9菌株即可，如保藏编号为CGMCC No.24707的渴望盐单胞菌(Halomonas cupida)J9菌株。

在本发明中，所述强启动子包括P15或P8_KT；所述P15的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述P8_KT的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明中，所述PNP矿化途径基因包括pnpA、pnpB、pnpC、pnpD、pnpE和pnpF基因。

在本发明中，所述渴望盐单胞菌J9U菌株的基因组中还插入gfp基因。

将H.cupida J9中完整的反向筛选标记基因upp进行敲除，获得H.cupida J9U；

将H.cupida J9中完整的反向筛选标记基因upp连接到pK18mobSacB上，得到pKJU质粒载体；

利用所述pKJU质粒载体，将强启动子与PNP矿化途径基因通过无痕基因编辑方法整合至H.cupida J9U无痕基因编辑菌株的基因组中，获得耐盐对硝基苯酚矿化菌株。

本发明将H.cupida J9中完整的反向筛选标记基因upp进行敲除，获得H.cupidaJ9U。本发明对所述upp基因的敲除方法没有特殊限定，采用本领域技术人员公知的常规基因敲除方法进行敲除即可，如采用无痕基因编辑方法对upp基因进行敲除即可。

本发明将H.cupida J9中完整的反向筛选标记基因upp连接到pK18mobSacB上，得到pKJU质粒载体。本发明对所述连接方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的基因和载体的连接方法即可。

本发明利用所述pKJU质粒载体，将强启动子与PNP矿化途径基因通过无痕基因编辑方法整合至H.cupida J9U无痕基因编辑菌株的基因组中，获得耐盐对硝基苯酚矿化菌株。本发明对所述整合的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规无痕基因编辑方法将强启动子与PNP矿化途径基因整合到H.cupida J9U无痕基因编辑菌株的基因组中即可。

在本发明中，优选还包括利用所述pKJU质粒载体，将gfp基因通过无痕基因编辑方法整合至H.cupida J9U无痕基因编辑菌株的基因组中。菌株中引入的GFP蛋白为工程菌株在环境修复中的监测提供了可能。

缺失的upp基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

将P8_KT-pnpAB&P_lac-gfp、P8_KT-pnpCD、P8_KT-pnpE及P8_KT-pnpF基因及各基因插入位点的上、下游同源臂分别与pKJU质粒载体进行连接，获得基因插入载体，通过接合转化的方法将基因插入载体转化入H.cupida J9U中，使用卡那霉素抗性筛选得到发生第一次单交换的重组子，重组子在含有5-Fu培养基再次筛选得到经过第二次交换的目标基因插入菌株，最终获得耐盐对硝基苯酚矿化菌株，命名为J9U-P8_KTPNP；

本发明将P8_KT-pnpAB&P_lac-gfp、P8_KT-pnpCD、P8_KT-pnpE及P8_KT-pnpF基因及各基因插入位点的上、下游同源臂分别与pKJU质粒载体进行连接，获得基因插入载体，通过接合转化的方法将基因插入载体转化入H.cupida J9U中，使用卡那霉素抗性筛选得到发生第一次单交换的重组子，重组子在含有5-Fu培养基再次筛选得到经过第二次交换的目标基因插入菌株，最终获得耐盐对硝基苯酚矿化菌株，命名为J9U-P8_KTPNP。在本发明中，所述连接优选通过限制性内切酶EcoRⅠ进行连接。在本发明中，P8_KT-pnpAB&P_lac-gfp、P8_KT-pnpCD、P8_KT-pnpE及P8_KT-pnpF各基因插入位点情况优选如表6所示，即gfp在AB基因和CD基因之间，排列顺序是AB-GFP-CD，插入HC-3617(phbC)；E基因在前，F基因在后，顺序为E-F，插入HC-2958；整体基因排列顺序为：A-B-GFP-C-D-E-F，A-B-GFP构建到一个质粒中进行后续的转化，C-D构建到一个质粒中进行后续的转化，E构建到一个质粒中进行后续的转化，F构建到一个质粒中进行后续的转化。本发明pnpA、pnpB、pnpC、pnpD、pnpE和pnpF基因以及gfp基因优选融合成四段基因，进行载体的构建，并构建入H.cupida J9U中。即如上文所述，本发明优选先获得P8_KT-pnpAB&P_lac-gfp、P8_KT-pnpCD、P8_KT-pnpE及P8_KT-pnpF各基因，之后将这些基因转化入pKJU质粒载体中，再进行后续转化，筛选。本发明优选采用常规方法，扩增得到H.cupidaJ9U的HC-3617(phbC)第759个碱基位点的上下游同源臂序列，之后将此同源臂序列连接到P8_KT-pnpAB&P_lac-gfp基因的上下游，并构建到的pKJU质粒上，之后转入H.cupida J9U中，筛选，获得含pnpA、pnpB和gfp基因的J9U菌株；之后再以上述工程菌株中gfp基因最末端碱基位点为基准，扩增此新的插入位点的上下游同源臂序列，连接到P8_KT-pnpCD的上下游，并构建到pKJU质粒上，之后转入含pnpA、pnpB和gfp基因的J9U菌株中，筛选，获得含pnpA、pnpB、pnpC、pnpD和gfp基因的J9U菌株；随后，再以上一步获得工程菌的HC-2958基因的第231个碱基位点为基准，扩增此插入位点的上下游同源臂序列，连接到P8_KT-pnpE的上下游，并构建到pKJU质粒上，之后转入含pnpA、pnpB、pnpC、pnpD和gfp基因的J9U菌株中，筛选，获得含pnpA、pnpB、pnpC、pnpD、pnpE和gfp基因的J9U菌株；最后，再以上述工程菌的pnpE基因最末端碱基位点为基准，扩增此插入位点的上下游同源臂序列，连接到P8_KT-pnpF的上下游，并构建到pKJU质粒上，之后转入含pnpA、pnpB、pnpC、pnpD、pnpE和gfp基因的J9U菌株中，筛选，获得含pnpA、pnpB、pnpC、pnpD、pnpE、pnpF和gfp基因的J9U菌株。

本发明将P15-pnpAB&P_lac-gfp、P15-pnpCD、P15-pnpE及P15-pnpF基因及各基因插入位点的上、下游同源臂分别与pKJU质粒载体进行连接，获得基因插入载体，通过接合转化的方法将基因插入载体转化入H.cupida J9U中，使用卡那霉素抗性筛选得到发生第一次单交换的重组子，重组子在含有5-Fu培养基再次筛选得到经过第二次交换的目标基因插入菌株，最终获得耐盐对硝基苯酚矿化菌株，命名为J9U-P15PNP在本发明中，所述连接优选通过限制性内切酶EcoRⅠ进行连接。在本发明中，P15-pnpAB&P_lac-gfp、P15-pnpCD、P15-pnpE及P15-pnpF各基因插入位点情况优选如表6所示，即gfp在AB基因和CD基因之间，排列顺序是AB-GFP-CD，插入HC-3617(phbC)；E基因在前，F基因在后，顺序为E-F，插入HC-2958；整体基因排列顺序为：A-B-GFP-C-D-E-F，A-B-GFP构建到一个载体中进行后续的转化，C-D构建到一个质粒中进行后续的转化，E构建到一个质粒中进行后续的转化，F构建到一个质粒中进行后续的转化。P15-pnpAB&P_lac-gfp、P15-pnpCD、P15-pnpE及P15-pnpF基因的连接和转入方法同上文，在次不再赘述，将上述P8_KT替换为P15即可。

本发明构建得到的H.cupida J9U无痕基因编辑菌株(盐单胞菌J9U)对高盐极端环境胁迫具有较高的耐受能力和竞争力、显著的生物降解能力和具有巨大的原位生物修复潜力。以J9U为宿主菌来构建高效矿化PNP的工程菌株并将其应用于环境修复，能够实现PNP环境污染的高效修复。

为了提高工程菌株的PNP矿化能力，本发明实施例通过结合转录组数据分析、启动子预测软件预测及报告基因表征通过对J9U的在不同盐浓度下(6％、10％、15％NaCl)转录组分析和强度表征，从H.cupida J9U中鉴定出5个强启动子，并将每个强启动子携带pnpAB基因独立插入J9U基因组的phbC位点。最终选择P8_KT和P15启动子的突变株的PNP降解效率最高，在最短的时间内对高浓度PNP(200mg/L)具有较强的耐受性。

本发明将Pseudomonas sp.WBC-3完整的PNP生物降解途径以及绿色荧光蛋白GFP通过合成生物学的方法引入到H.cupida J9U的基因组中。6个PNP降解基因在J9U菌株中成功转录。通过GC验证了PNP降解酶pnpAB初步降解PNP的功能以及pnpCD降解中间产物对苯酚HQ的功能。构建的工程菌株J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP具有良好的生长性能及降解基因的遗传稳定性，可以在6.5h完全矿化25mg/L的污染物PNP。菌株中引入的GFP蛋白为菌株在环境修复中的监测提供了可能。

此外，本发明进行了稳定同位素¹³C标记的PNP转化实验，证明了菌株J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP的PNP高效矿化，达到了6.5小时即可矿化25mg/L PNP的降解率。这种结合途径构建和启动子工程的策略为创造高效的生物修复降解菌株开辟新的途径。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种耐盐对硝基苯酚矿化菌株及其构建方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

实验材料

工具酶及试剂

主要使用的药品及试剂见表1。

表1药品及试剂

培养基、溶液和抗生素

培养基、溶液

MM60培养基(L)：60g NaCl、30g葡萄糖、1g酵母膏、2gNH₄Cl、0.2g MgSO₄、9.65gNa₂HPO₄.12H₂O、1.5g KH₂PO₄、10ml微量元素Ⅰ、1ml微量元素Ⅱ。

MMG60培养基(L)：在MM60培养基的基础上加0.4％Glu溶液。

微量元素溶液Ⅰ的组成为：5g/L柠檬酸铁铵、2g/L CaCl₂，用1M HCl配制。

微量元素溶液Ⅱ的组成为(L)：100mg七水硫酸锌、30mg四水氯化锰、300mg硼酸、200mg六水氯化钴、10mg五水硫酸铜、20mg六水氯化镍，30mg二水铝酸钠，溶于1M HCl，用0.22μm注射过滤器过滤除菌。用10MNaOH溶液调至pH为9.0。

20％葡萄糖溶液(L)：称200g葡萄糖在ddH₂O中溶解完全于115℃、30min灭菌。

PNP母液(10g/L)：称0.1g PNP，于10mL色谱级甲醇溶液中充分溶解,放在小棕瓶中密封保存。

PNP-¹³C6母液(10g/L)：向250μl色谱级甲醇溶液中添加2.5mg PNP-¹³C6，使其充分溶解，放在小棕瓶中密封保存。

仪器设备

仪器、设备如表2。

表2主要仪器设备

实验方法

1.H.cupida J9U的构建

1)野生型Halomonas cupida J9对于5-FU敏感性测试

将保存于-80℃甘油管中的Halomonas cupida J9划线于LB60固体培养基，37℃培养过夜。从固体平板上挑取单菌落，分别接种于含有20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL5-氟尿嘧啶的5ml LB60液体培养基中，置于37℃，180rpm摇床中，振荡培养过夜后测定OD₆₀₀，最终确定100μg/mL的5-氟尿嘧啶浓度为J9的致死浓度(图1为J9的5-FU敏感性测试)，用于后续双交换的筛选。

2)野生型Halomonas cupida J9基因组的提取

依照Vazyme公司的试剂盒说明书对H.cupida J9的基因组进行提取。

3)DNA片段的扩增与纯化

使用Vazyme高保真聚合酶PCR扩增upp基因的上下游同源臂。

PCR扩增体系如下：2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)25μL，上游引物(F)2μL，下游引物(R)2μL，模板2μL和ddH₂O补足至50μL。

融合PCR反应体系：DNA聚合酶Mix 25.0μL，引物F12μL，引物R22μL，模板-片段1(指的是上游同源臂)2μL，模板-片段2(指的下游同源臂)2μL和ddH₂O17μL。

反应条件：94℃10min，94℃30s，55℃30s，72℃X(1kb/min)，72℃10min，16℃，∞。

将PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶(琼脂糖含量0.8％～1.0％)电泳，以Marker III作为衡量DNA分子量大小的工具。DNA片段回收使用Vazyme的产物纯化试剂盒，具体的提取信息可参考说明书。

4)upp基因打靶载体pK18mobsacB-Δupp的构建

upp基因敲除过程示意图如图2所示。

4.1pK18mobsacB-Δupp敲除质粒的构建

将融合PCR得到的上下游同源臂，整合到自杀质粒pK18mobsacB的EcoRⅠ位点。如图2所示。先用限制性内切酶EcoRⅠ对质粒pK18mobsacB进行酶切，得到线性化质粒。

酶切体系：质粒DNA约1000ng，限制性内切酶EcoRⅠ1μL，10×CutSmartBuffer2μL，ddH₂O补足至50μL。上述的酶切体系吹打混匀后放置37℃水浴45min。

重组连接体系：线性化载体XμL，插入片段Y(上下游同源臂)，5×CE II Buffer4.0μL，Exnase II 2.0μL，ddH₂O补足至20.0μL。

将上述体系吹打混匀，放置在37℃反应30min，将连接产物化转至E.coli Trans-T1感受态中，通过菌落PCR对阳性克隆子进行验证。

4.2质粒DNA化学转化与阳性克隆子的鉴定

1).将储存于-80℃的E.coli感受态放置冰上融化；

2).在无菌条件下取10μl获得的连接产物轻柔地加到刚融化E.coli感受态细胞中，冰浴30min；

3).将上步体系放入42℃金属浴中热激30s，取出后立即冰浴2min；

4).无菌条件下在上部体系中加入1mL LB液体培养基，37℃，180r/min复苏1h；

5).复苏好的产物4℃，5000r/min，在无菌条件下弃去上清，保留菌体，留约100μl上清液将菌体重悬，涂布于含有50μg/mL kan的LB平板上，37℃恒温培养箱中过夜培养；

6).在平板上挑取单菌落于含有相应抗性的LB液体培养基中，37℃，180r/min复苏3h后进行菌液PCR鉴定阳性克隆转化子。

PCR体系如下：2×Rapid Master Mix 10μL，上游引物F1μL，下游引物R1μL，菌液模板2μL，ddH₂O补足至20μL。

菌液PCR反应条件：95℃10min；95℃15s，55℃15s，72℃X(1kb/15s)，30个循环；72℃10min，16℃∞。

通过0.8％琼脂糖凝胶电泳来检测PCR条带大小，将条带大小正确的阳性克隆子转接到含相应抗性的5ml LB液体培养基中，37℃，180r/min过夜培养。

4.3质粒DNA提取

使用Vazyme公司的FastPure Plasmid Mini Kit试剂盒进行提取。将提取的质粒(pK18mobsacB-Δupp)测序比对无误后，利用上述的化学转化方法转化到大肠杆菌E.coliS17-1λpir中。

5)接合转化

接合转化是一种将质粒转入H.cupida J9的有效方法。具体转化方法如下：

1).将-80℃保存的含有质粒pK18mobsacB-Δupp的E.coli S17-1λpir在LB平板上划线活化，将H.cupida J9菌株在LB60平板上划线活化；

2).将含有质粒pK18mobsacB-Δupp的大肠杆菌E.coli S17-1λpir接种至LB液体培养基中，将H.cupida J9菌株接种至LB60液体培养基中，分别37℃，180r/min培养16h；

3).各取步骤2)中经过培养的菌液，以2％的比例分别转接至新的LB和LB60液体培养基中，37℃，180r/min培养6h；

4).步骤3)中经过培养的含有质粒pK18mobsacB-Δupp的大肠杆菌E.coli S17-1λpir和H.cupida J9菌液，分别加到1.5mL无菌EP管中，5000r/min，离心5min，弃尽上清，留下菌体细胞；

5).向步骤4)中含有质粒pK18mobsacB-Δupp的大肠杆菌E.coli S17-1λpir和H.cupida J9的菌体细胞中分别加入1mL10mmol MgSO₄和60-10mmol MgSO₄(含有60g/LNaCl的10mmol MgSO₄溶液)洗液，轻柔地吹洗以重悬菌体，5000r/min，离心5min，弃尽上清；

6).重复步骤5)，充分洗涤菌体；

7).分别加入80μL的MgSO₄液体，轻柔地吹吸以重悬菌体，将含有质粒pK18mobsacB-Δupp的大肠杆菌E.coli S17-1λpir和H.cupida J9菌液轻柔混合，滴加于LB60固体平板上，静置等待菌液晾干；

8).刮取培养所得菌苔，溶于1ml LB60液体培养基后涂布于含有硫酸卡那霉素抗性的LB60平板上，37℃倒置置培养24h，待平板中长出菌落。

9).挑取单菌落至400μL含有100-Kan的LB60液体培养基中，37℃，180rpm，培养约6h，进行菌液PCR验证，进行单交换的筛选。具体步骤见6)。

6)单双交换的筛选

本实施例用的自杀质粒pK18mobSacB是一种具有卡那霉素抗性的穿梭型自杀质粒，这种质粒可以在大肠杆菌中自由复制，但当宿主菌为假单胞菌时，则不具备独立复制的能力，只能定点整合插入到宿主菌的染色体中，否则将被宿主菌株作为外源片段切割与降解。当H.cupida J9自身基因组中的upp基因被成功敲除后，突变菌株具有了5-FU抗性。因此，可以利用上述这种反向筛选标记，对接合子进行筛选，从而得到upp基因缺失的Halomonas cupida J9U。原理如图2所示。操作步骤如下所述：

1).将upp基因打靶载体pK18mobsacB-Δupp通过接合转化的方法转化进入H.cupida J9菌株，并涂布于含有100μg/mL Kan抗性LB60培养基平板上，37℃，培养36h；

2).无菌条件下，在平板上挑取单菌落于含有100μg/mLKan抗性的LB60液体培养基中进行培养，通过菌液PCR验证单交换；

3).将验证为双层条带的菌株转接至无抗性的LB60试管中，37℃，180r/min培养24h促进双交换的发生，使自杀质粒丢失；

4).取培养后的菌液100μL，用LB60液体培养基稀释1000倍后涂布于含有100μg/mL5-Fu抗性的LB60液体培养基中进行培养，通过菌液PCR验证双交换，将双交换菌株的PCR产物进行测序；

5).将测序正确的敲除菌株保存于-80℃的甘油管中。

图3为底盘菌株J9U验证结果图，泳道M为MarkerIII；泳道1-2分别为天然J9和J9-△upp。可见，利用基因组检测引物△upp-JF/△upp-JR对J9和J9-△upp菌株进行PCR检测，upp长度为630bp，根据PCR检测条带大小，泳道2比泳道1大大小正好相差630bp；同时利用这对引物对J9-△upp菌株的基因组进性测序，结果未检测到upp序列，说明upp基因成功敲除。

7)J9△upp(J9U)的5-氟尿嘧啶敏感性测试

将划线活化后的J9U和对照菌株J9分别划线于含200μg/mL 5-氟尿嘧啶的LB60平板上，对构建完成的upp基因缺失型菌种进行5-FU敏感性的验证。

图4为J9U的5-FU敏感性测试结果图。根据图4可知，J9U(J9△upp)可在含5-Fu抗生素的平板中生长。本发明后续能够基于自杀质粒Pk18mobSacB和反向筛选标记upp的基因组无痕编辑策略来对J9U基因组进行基因的插入获得突变株。upp基因编码的尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRTase)可催化尿嘧啶类似物5-氟尿嘧啶(5-Fu)转化最终生成5-氟脱氧尿嘧啶单磷酸，该产物可通过阻断胸腺嘧啶的合成导致细胞死亡，因此，J9中upp基因缺失菌株J9U具有5-Fu抗性，因此能够在含5-Fu抗性平板中生长。Upp基因的敲除对菌株J9耐盐性不会产生任何影响，Upp基因的敲除对菌株J9进行基因编辑提供了一种筛选标记。

2.H.cupida J9U转录组数据分析及启动子预测

菌株J9U在6％、10％、15％不同盐浓度下，37℃、180rpm/min培养，分别在对数期对其细胞进行取样，分别用于提取总RNA(菌株J9U在高盐条件下(6％、10％、15％)能够生长，具有耐盐性能)。将质量合格的RNA样本提交到美吉进行转录组测序，获得三组比较转录组测序数据(RNA-seq)。

在对三个不同盐浓度处理下获得的RNA-seq进行分析，不同盐浓度下所表达的全部基因通过FPKM值来表示每个基因的相对水平，RPKM值与其转录水平成正相关。按照FPKM值对H.cupida J9U的所有基因从高到低进行排序，选取FPKM值较高的基因的上游序列作为启动子筛选的首要目标。接着，利用在线启动子预测平台预测所选序列中的启动子(NeuralNetwork Promoter Prediction,http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)，对可以预测出启动子序列，用于进一步的克隆和表征。

3.H.cupida J9U基因组DNA的提取

依照Vazyme公司的试剂盒说明书对H.cupida J9U的基因组进行提取。

4.启动子DNA片段的PCR扩增

使用Vazyme高保真聚合酶分别对上述预测出的不同启动子DNA片段进行回收。

反应条件：94℃10min；94℃30s，55℃30s，72℃X(1kb/min)(30个循环)；72℃10min，16℃，∞。

5.DNA片段的回收

DNA片段回收使用Vazyme的产物纯化试剂盒，具体的提取信息可参考说明书，此处不再赘述。

6.启动子表征载体的构建

1)启动子表征载体构建

为了表征H.cupida J9U中所筛选出的强启动子强度，本发明使用表达载体pBBR1MCS-2和报告基因gfp来构建报告基因表征载体。通过PCR从J9U基因组和质粒pWH1520-gfp(采用常规方法，将gfp基因构建到pWH1520质粒上制备得到)中分别扩增启动子和报告基因gfp的DNA序列，并且在每个启动子序列末端引入相同的RBS序列(TAAGGAGGTTTTCTA，SEQ ID NO.12)。将克隆的启动子序列(含RBS序列)、gfp序列和线性化的pBBR1MCS-2载体以与载体上的lac启动子相反的方向利用同源重组法进行连接，得到表征载体pBBR1MCS-2-Px-gfp。此外，还将gfp基因以pBBR1MCS-2中lac启动子相同方向进行同源重组连接，得到启动子表征载体pBBR1MCS-2-gfp。启动子表征载体的构建如图5所示。

在构建启动子表征载体时，先用限制性内切酶HindⅢ对质粒pBBR1MCS-2进行酶切，得到线性化质粒。

酶切体系：质粒DNA约1000ng，限制性内切酶HindⅢ1μL，10×CutSmart Buffer2μL，ddH₂O补足至50μL，上述的酶切体系吹打混匀后放置37℃水浴45min。

将目的片段X(X代表Px-gfp)与线性化载体Y(Y代表被限制性内切酶切开的线性化质粒)连接采用的同源重组连接法，使用Vazyme公司的无缝克隆试剂盒进行启动子表征载体构建。

重组连接体系如下：目的片段X(Px-gfp)，线性化载体YμL，5×CE II Buffer4.0μL，Exnase II 2.0μL，dd H₂O补足至20.0μL。具体的计算方法如下：

X＝[0.04×克隆载体碱基对数]ng/[插入片段的浓度]ng/μL

Y＝[0.02×插入片段碱基对数]ng/[线性化载体的浓度]ng/μL

将上述体系吹打混匀，放置在37℃反应30min，将连接产物化转至E.coli Trans-T1感受态中，复苏后涂布在Kan抗性的平板上。通过挑菌PCR验证对克隆子进行验证，获得启动子表征载体。

2)基因插入载体的构建

在构建基因插入载体时，所述质粒载体命名为pKJU质粒载体，是以pK18mobSacB为出发载体(自身携带卡那霉素抗性基因)连接H.cupida J9中完整的反向筛选标记基因upp基因构建获得，利用该质粒可以在H.cupida J9中实现无痕插入外源基因片段。

首先用引物UF、UR及DF、DR(引物易获得)分别扩增基因组插入位点上下游同源臂UP和DN，接着通过同源重组的方法将待插入片段Z(指的本发明中涉及到的所有基因插入序列，包括P15-pnpAB&P_lac-gfp、P15-pnpCD、P15-pnpE、P15-pnpF及P8_KT-pnpAB&P_lac-gfp、P8_KT-pnpCD、P8_KT-pnpE、P8_KT-pnpF)及上、下游同源臂同时连接到自杀质粒pKJU的EcoRⅠ位点，构建得到基因插入载体。基因插入载体构建示意图如图6所示。

在基因插入载体过程中，先用限制性内切酶EcoRⅠ对质粒pKJU进行单酶切，获得线性化质粒。

酶切体系：质粒DNA约1000ng，限制性内切酶EcoRⅠ1μL，10×CutSmartBuffer2μL，ddH₂O补足至50μL，上述的酶切体系吹打混匀后放置37℃水浴45min。

重组连接体系如下：目的片段XμL(指的是UP-Z-DN)，线性化载体Y’μL，5×CE IIBuffer4.0μL，Exnase II 2.0μL，dd H₂O补足至20.0μL。具体的计算方法如下：

X＝[0.04×克隆载体碱基对数]ng/[插入片段的浓度]ng/μL

Y＝[0.02×插入片段碱基对数]ng/[线性化载体的浓度]ng/μL

将上述体系吹打混匀，放置在37℃反应30min，将连接产物化转至E.coli Trans-T1感受态中，复苏后涂布在Kan抗性的平板上。通过挑菌PCR验证对克隆子进行验证，获得基因插入载体。

3)质粒DNA提取

使用Vazyme公司的FastPure Plasmid Mini Kit试剂盒进行提取。

4)质粒DNA化学转化与阳性克隆子的鉴定

1).将储存于-80℃的E.coli S17-1λpir感受态放置冰上融化；

2).在无菌条件下取10μL质粒轻柔地加到刚融化E.coli S17-1λpir感受态细胞中，冰浴30min；

5).复苏好的产物4℃，5000r/min，在无菌条件下弃去上清，保留菌体，刘约100微升上清液将菌体重悬，涂布于含有相应抗性的LB平板上，37℃恒温培养箱中过夜培养；

PCR体系如下：2×Rapid Master Mix10μL，pKJU-JF1μL，pKJU-JR1μL，菌液模板2μL，ddH₂O补足至20μL。

菌液PCR反应条件：95℃10min；95℃15s，55℃15s，72℃X(1kb/15s)，30个循环；72℃10min；16℃∞。

通过0.8％琼脂糖凝胶电泳来检测PCR条带大小，将条带大小正确的克隆转接到含硫酸卡那霉素抗生素的5ml LB液体培养基中，37℃，180r/min过夜培养。通过质粒提取进行进一步的测序验证。

7.H.cupida J9U的接合转化

接合转化是一种将质粒转入H.cupida J9U的有效方法。具体转化方法如下：

1).将-80℃保存的H.cupida J9U菌株(作为受体菌)在LB60平板上活化，将含有目的质粒的E.coli S17-1λpir菌株(作为供体菌)在LB平板上活化；

2).将含有目的质粒的大肠杆菌E.coli S17-1λpir和H.cupida J9U菌株分别接种至LB和LB60液体培养基中，37℃，180r/min培养16h；

4).向EP管中加入1mL步骤3中经过培养的菌液，置于无菌1.5mLEP管中，5000r/min，离心5min，弃尽上清；

5).向EP管中加入1mL10mmol MgSO₄和60-10mmol MgSO₄洗液，轻柔地吹洗以重悬菌体，5000r/min，离心5min，弃尽上清；

6).重复步骤5)，充分洗涤菌体；

7).分别加入80μL的MgSO₄液体，轻柔地吹吸以重悬菌体，将E.coli S17-1λpir和H.cupida J9U菌液轻柔混合，滴加于LB60固体平板上，静置等待菌液晾干；

8).刮取培养所得菌苔，溶于1ml LB60液体培养基后涂布于含有相应抗性的LB60平板上，37℃静置培养24h，对长出的菌落进行菌落PCR，以筛选正确的转化子。

8.H.cupida J9U插入菌株的构建

1).将基因插入载体通过接合转化的方法转化进入H.cupida J9U菌株，并涂布于含有100μg/mLKan抗性LB60培养基平板上，37℃，培养36h；

2).无菌条件下，在平板上挑取单菌落于含有Kan抗性的LB60液体培养基中进行培养，通过菌液PCR验证单交换；

3).将验证正确的菌株转接至无抗性的LB60试管中，37℃，180r/min培养24h完成双交换，自杀质粒丢失；

4).取培养后的菌液100μL，用LB60液体培养基稀释1000倍后涂布于含有5-Fu抗性的LB60液体培养基中进行培养，通过菌液PCR验证双交换，将双交换菌株的PCR产物进行测序；

5).将测序正确的基因插入菌株保存于-80℃的甘油管中。

6).H.cupida J9U基因组中插入目的基因的工程菌株亦称为H.cupida J9U的衍生菌。

9.H.cupida J9U的RNA提取、反转录以及定量PCR

9.1RNA提取

在提取细菌RNA时，要依照改良的SparkJade细菌RNA快速提取。

1.取1～2ml菌液到一个1.5ml离心管中，12000r/min离心1min，彻底弃去上清，保留菌体；

2.向上步离心管中加入1mg/ml的溶菌酶缓冲液约20μl重悬菌体，室温孵育5min，裂解细胞壁，每2min涡旋震荡10s帮助破壁；

3.短暂离心收集菌体，吸去上清，涡旋震荡分散细胞；

4.向上步体系中加入500μl裂解液RLplus，吹打混匀后用于震荡20s，帮助细胞充分裂解；

5.立刻将上步的裂解物加入到一个DNA清除柱中(清除柱放置在收集管中)，12500r/min离心1min，保留过滤液；

6.弃去清除柱，在过滤液中介如风体积的70％乙醇，立即吹打混匀；

7.将上步混合物立即加入吸附柱RA(RA放置在收集管中)，12500r/min离心1min，弃去滤液；

8.向RA中加入700μl去蛋白液RW1，12000r/min离心30s，弃滤液；

9.向RA中加入500μl漂洗液RW，12000r/min离心30s，弃滤液；

10.重复步骤9的操作；

11.RA空管12500r/min离心2min，打开RA并将其放置于一个新的RNase-free的离心管中，室温放置10min，使残留的乙醇挥发；

12.在RA吸附膜的中间部位加40μl的RNase-free H2O，室温放置1min，12000r/min离心1min，所得到的RNA产物立即放入-80℃保存或进行反转录。

9.2RNA的反转录

清除柱的使用应用在RNA提取过程中，因为在提取RNA的过程中可能会存在部分DNA的残留，使用Vazyme公司的II Q RT SuperMix for qPCR试剂盒对溶液中的残存的DNA更彻底的去除，在此基础上在进行逆转录。

基因组DNA去除体系：4×gDNAwiperMix 4.0μL，RNA1.0μL，RNase-Free H₂O补足至16.0μL。

轻轻吹打混匀体系后，42℃金属浴2min。

5×HiScriptⅡSelect qRT SuperMixⅡ 4.0μL

上步中的反应体系 16.0μL

吹打混匀后，50℃金属浴孵育15min后，再置于85℃下反应5s，产物即为cDNA，产物可立即用于实时荧光定量PCR实验或-20℃中保存。

9.3实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法

使用Vazyme公司的Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒制备qRT-PCR体系，并使用/>实时定量PCR系统进行qRT-PCR反应。

RT-qPCR反应体系：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix10.0μL，F0.4μL，R0.4μL，模板cDNA1.0μL，ddH₂O补足至20.0μL。

RT-qPCR反应条件：95℃30s；95℃10s，56℃30s，72℃30s，40个循环；95℃15s；60℃60s；95℃15s；4℃∞。

以H.cupida J9U菌株的16S rRNA基因作为内参，通过计算2^-ΔΔCt值确定目标基因的相对表达水平。

10.H.cupida J9U的生长曲线测定

1.将保存在-80℃产低温冰箱中的H.cupida J9U菌株在LB60固体琼脂版上划线活化；

2.挑取单菌落置于5mL LB60液体试管中，37℃，180rpm过夜培养；

3.将上步菌液以1％的接种量接到含有100mL的LB60液体培养基中，37℃，180rpm，振荡培养，每组设置3个平行试验组；

4.从0h开始每隔3h，用紫外分光光度计测定600nm下的吸光值OD_600nm；

5.以OD_600nm的测定值为纵坐标，取样时间为横坐标，绘制曲线，测定菌株的生长情况。

11.绿色荧光蛋白相对荧光强度的测定

H.cupida J9U及衍生菌株的GFP相对荧光强度使用酶标仪进行测定，具体步骤如下：

1).取1mL菌液于1.5mL EP管中，4℃，5000r/min离心5min，弃去上清，保留菌体；

2).吸取1mL磷酸缓冲液60PB重悬菌体，4℃，5000r/min离心5min，弃去上清，保留菌体；

3).重复步骤2)的操作两次，最后一次彻底弃去上清；

4).吸取1mL磷酸缓冲液重悬菌体，混合均匀后取200μL菌液加到96孔板中，使用酶标仪测定荧光值，绿色荧光蛋白GFP的检测条件为：吸收波长520nm，激发波长488nm。余下的800μL菌液用哪个紫外分光光度计读取OD₆₀₀值；

5).测定的荧光值除以OD₆₀₀，再减去背景值，将空质粒对照菌株H.cupida J9UpBBR(该菌的基础菌株为H.cupida J9U，插入的质粒为pBBR，该质粒不携带gfp基因，质粒构建方法为常规方法)的相对荧光强度作为背景值。

12.共聚焦显微镜观察

通过共聚焦显微镜可直接观察菌株绿色荧光蛋白强度，具体操作步骤如下：

1).取培养27h的菌液置于1.5mL EP管中，4℃，5000r/min，5min弃去上清，保留菌体；

2).用1mL 60％磷酸缓冲液将菌体洗三次；

3).加入400μL磷酸缓冲液重悬菌体，混匀后再加入终浓度10μM/L的FM4-64膜荧光染料，37℃避光孵育25min；

4).从上一步中提取约2μL的细菌溶液并将其滴在玻璃幻灯片上，添加最终浓度为2％的甘油以固定细胞，用盖玻片覆盖并按下幻灯片。在此过程中，尽量减少气泡的产生，并用滤纸压紧；

5).绿色荧光蛋白GFP被激活，蓝色激发光波长为488纳米，而FM4-64的红色荧光是用蔡司的共聚焦显微镜LSM710观察，其激发光波长为543nm。观察所用的物镜为100×10，主增益为780，激发强度为2.0％。

13.PNP降解实验

1)PNP矿化实验

将工程菌株J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP接种于MM60培养基+25mg/L PNP，使初始OD₆₀₀＝0.2，在180rpm和37℃的摇床中培养，看其是否能完全矿化PNP。

1).将工程菌株J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP分别在LB60培养基中37℃，180r/min培养16h；

2).将培养物以5000rpm离心5分钟，收集细胞；

3).在MM60培养基中彻底洗涤细菌两次；最后重悬至OD₆₀₀＝4.0；

4).在加入25mg/LPNP之前，将细胞悬液接种到20ml的MM60使初始OD₆₀₀＝2；在20mLMM60培养基中加入步骤3)的菌体，同时加25mg/LPNP，使得刚接到培养瓶中的OD₆₀₀为0.2；

5).定期取样分析，每次吸取2毫升培养物，一份用紫外分光光度计测量菌株的OD₆₀₀，确定细胞密度，一份用于污染物进行GC分析，以确定污染物及其中间产物的数量。

2)样品中污染物的提取

1).在1mL样品中加入等体积的乙酸乙酯，涡旋2分钟以提取受污染的PNP。

2).静置5分钟后，以12000rpm离心3min；

3).为了用气相色谱法(GC)分析PNP，上层有机物通过0.22M的过滤器，并收集到一个棕色小瓶中。

3)PNP的GC检测条件

检测仪器：GC-2014C气相色谱仪；柱子：DB-5毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；检测器：FID；载气：氦气；流速：1.0mL/min。

PNP的检测程序如下：

进样器和检测器温度升至300℃。柱子的温度120℃保持2分钟，随之温度升至200℃(以25℃/分钟的速度)保持8分钟，最终升至260℃(以30℃/min的速度)并保持5min。

制备不同浓度(0mg/L，25mg/L，50mg/L，75mg/L，100mg/L)PNP标准品，根据相对应的峰面积绘制标准曲线用于PNP的定量。

14.H.cupida J9U过表达pnpAB增强PNP降解

将携带pnpAB基因的五个强启动子(P3、P8_KT、P15、P16和P22)单独插入到J9U基因组的phbC基因第759个碱基位置(具体构建方法参考前文的第6.部分的2)基因插入载体的构建，第7.和第8.部分)。在添加25mg/L PNP的MMG60培养基中通过对5株工程菌中pnpAB基因的转录水平、PNP的降解率和对高浓度PNP的耐受性分析，来证实启动子过表达pnpAB是否提高PNP的降解效能。在含50mg/L、100mg/L和200mg/L PNP的MMG60培养基中对5株工程菌进行耐受性实验，并记录PNP完全降解所需的时间。在实验过程中，以J9U作为对照，在相同条件下培养。

15.耐盐对硝基苯酚矿化菌株的构建

采用启动子工程策略，将强启动子P15和P8_KT用于构建工程菌株J9U-P15PNP和J9U-P8_KTPNP。具体的，本发明耐盐对硝基苯酚矿化菌株J9U-P8_KTPNP或J9U-P15PNP参考以上第6.第7.和第8.部分进行构建。本发明先扩增得到H.cupida J9U的HC-3617(phbC)第759个碱基位点的上下游同源臂序列，之后将此同源臂序列连接到P8_KT-pnpAB&P_lac-gfp基因的上下游，并构建到的pKJU质粒上，之后转入H.cupida J9U中，筛选，获得含pnpA、pnpB和gfp基因的J9U菌株；之后再以上述工程菌株中gfp基因最末端碱基位点为基准，扩增此新的插入位点的上下游同源臂序列，连接到P8_KT-pnpCD的上下游，并构建到pKJU质粒上，之后转入含pnpA、pnpB和gfp基因的J9U菌株中，筛选，获得含pnpA、pnpB、pnpC、pnpD和gfp基因的J9U菌株；随后，再以上一步获得工程菌的HC-2958基因的第231个碱基位点为基准，扩增此插入位点的上下游同源臂序列，连接到P8_KT-pnpE的上下游，并构建到pKJU质粒上，之后转入含pnpA、pnpB、pnpC、pnpD和gfp基因的J9U菌株中，筛选，获得含pnpA、pnpB、pnpC、pnpD、pnpE和gfp基因的J9U菌株；最后，再以上述工程菌的pnpE基因最末端碱基位点为基准，扩增此插入位点的上下游同源臂序列，连接到P8_KT-pnpF的上下游，并构建到pKJU质粒上，之后转入含pnpA、pnpB、pnpC、pnpD、pnpE和gfp基因的J9U菌株中，筛选，获得含pnpA、pnpB、pnpC、pnpD、pnpE、pnpF和gfp基因的J9U菌株。P15-pnpAB&P_lac-gfp、P15-pnpCD、P15-pnpE及P15-pnpF基因的连接和转入方法同上，仅将上述P8_KT替换为P15即可。

对以构建完成的工程菌株，利用稳定同位素示踪技术分析PNP降解代谢通路中的流向，从而确定PNP的降解效率。

矿化实验方法同14。PNP浓度和细胞密度(OD₆₀₀)在整个培养过程中的不同时间点被测定。为了进一步证明J9U-P15PNP和J9U-P8_KTPNP将¹³C-PNP转化为¹³CO₂的能力，两株工程菌用100mL规格的血清瓶(用配套的密封垫和铝盖封闭)装有25mg/L ¹³C₆-PNP的MM60培养基中，使初始OD₆₀₀＝0.2，并在180r/min的转速37℃恒温培养摇床中封闭振荡培养3天。

培养结束后，用10M盐酸将培养物酸化至pH值小于2，然后在摇床上密封振荡5～7分钟。用10mL无菌注射器将气体从血清瓶顶部吸出并收集至12mL密闭顶空瓶中。把气体样品送至中国农业科学院环境稳定同位素实验室，以获取测定气体的组分和CO₂中的δ13C。以J9U作为对照菌株，在相同条件下培养。

实验结果

1.RNA-seq分析和启动子预测筛选内源启动子结果

通过对H.cupida J9U比较转录组数据分析，将所有基因通过FPKM值来进行排序，FPKM值排名前40位的基因被认定为具有较高的转录水平，选择它们的上游序列作为启动子筛选的初步目标。40个基因及其FPKM值见表3。

表3RNA-seq分析中RPKM值排名前40位的高转录水平基因

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接着，通过一个在线的启动子软件对这40个基因的上游序列进行启动子预测。其中，由16个序列(P3、P4、P5、P7、P12、P15、P16、P17、P18、P22、P25、P27、P31、P33、P34、P40)可以准确预测出启动子区域，再加上一个外源强启动子P8_KT。因此这16个启动子序列被选择进行进一步的克隆和表征。在线启动子预测软件的预测界面如图7所示(以P15为例)。

2.内源启动子表征载体和菌株的构建

为了获得被选择的16个高转录水平基因的完整启动子序列，被选择基因与其上游基因之间的全部基因间区通过PCR的方式被克隆下来，但是不包括被选择基因自身的RBS序列。同时本发明通过引入异源P8_KT启动子，且序列已知。将克隆得到的启动子序列分别与gfp的5’端进行融合PCR得到融合片段，然后以与表达载体自身的lac启动子相反的方向连接到pBBR1MCS-2中。同时，为了对各个启动子进行准确表征，在PCR扩增gfp时，统一引入相同的RBS序列(TAAGGAGGTTTTCTA)，并且，将带有相同RBS序列的gfp连接到pBBR1MCS-2的lac启动子之后构建表达质粒，以lac启动子作为表征内源启动子的对照。构建得到的各个启动子表征载体的酶切验证结果见图8～图10。

图8为启动子表征载体的PCR验证电泳图。M：MarkerIII；1；H.cupida J9U-Plac；2：H.cupida J9U-P3；3：H.cupida J9U-P4；4：H.cupida J9U-P5；5：H.cupida J9U-P7；6：H.cupida J9U-P8_KT。

图9为启动子表征载体的PCR验证电泳图。M：MarkerIII；1：H.cupida J9U-P12；2：H.cupida J9U-P15；3：H.cupida J9U-P16；4：H.cupida J9U-P17；5：H.cupida J9U-P18；6：H.cupida J9U-P22。

图10为启动子表征载体的PCR验证电泳图。M：Marker III；1：H.cupida J9U-P25；2：H.cupida J9U-P27；3：H.cupida J9U-P31；4：H.cupida J9U-P33；5：H.cupida J9U-P34；6：H.cupida J9U-P40。

本发明得到所有启动子的序列，其中，P_lac的核苷酸序列具体如下：

TTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTG(SEQ ID NO.13)。

P8_KT的核苷酸序列具体如下：

TTACTTACTACAAGTAATGGGTACTATGTACGCCGGCCAGTTTCTCTTTCCTGAGAGATGGCTATTTAATAGA AAGTCCTTGAAGGGGAACACG(SEQ ID NO.2)。

P15的核苷酸序列具体如下：

GGATTCGTGAATCAGTGTCATCCTGCGGTCATGATTGATAATTAGTGTTG(SEQ ID NO.1)。

3.RT-qPCR表征内源启动子的转录水平

运用RT-qPCR对gfp的转录水平进行分析，从而表征各个内源启动子的转录水平。为了对所选择的内源启动子进行更加全面的表征，在工程菌株生长的不同阶段取样，进行转录水平分析。

图11为构建的所有工程菌株的生长曲线。

首先，对各个工程菌株的生长曲线进行测定，测定结果如图11所示。从结果可以看出这18个菌株具有相同的生长趋势。然后选择对数期前期(6h)、对数期后期(21h)以及稳定期(27h)三个时间点进行取样。进行RT-qPCR反应时，以16S rDNA基因用作内参。在进行数据分析时，将lac启动子下的GFP转录水平设为1用来充当对照。gfp在各种内源启动子作用下的转录水平如图12所示。

通过RT-qPCR分析启动子表征菌株中gfp基因的相对转录水平，进而表征18个启动子的转录水平。以P_lac启动子作为对照，各启动子的转录水平在不同生长时期(12h、21h、27h)均高于lac启动子的转录水平，结果见图12。GFP基因，尤其是在P3、P4、P8_KT、P15、P16、P22、P27和P34启动子表现出更优良的转录水平。在21h和27h，由P3驱动的GFP基因的转录水平比lac启动子高16倍。

图12gfp在各个内源启动子下的转录水平。

4.GFP荧光测定表征内源启动子的表达水平

为了进一步对所选择的内源启动子进行表征，gfp在各个启动子作用下表达。8个转录水平高的启动子P3、P4、P8_KT、P15、P16、P22、P27和P34的GFP相对荧光强度也远高于不同生长阶段的lac启动子。P4启动子的GFP相对荧光强度最高，与lac启动子相比，其在稳定期的GFP相对荧光增加了35倍。如图13所示的结果表明，各个启动子的转录水平和表达水平整体保持一致。但是值得注意的是，P34启动子的转录水平比P4、P8_KT、P16和P22四个启动子整体要高，但是其相对荧光强度要低于P4、P8_KT、P16和P22这四个启动子。

图13为gfp在各个启动子下表达荧光蛋白的相对荧光强度结果图。

以上结果表明一个基因的高水平转录未必会导致该基因编码蛋白的高水平表达。在本发明中，为了保持翻译起始效率的一致性，在报告基因gfp的上游引入了相同的RBS序列。但是，对于不同的启动子，其被启动子预测软件预测的启动子区域与RBS之间的距离是不同的。这可能会影响mRNA的翻译效率，因而可能导致了转录水平和相对荧光强度之间的部分差异。此外，不同启动子与RBS之间的间隔序列的不同，可能是造成转录水平和相对荧光强度之间差异的另一个原因。

5.J9U过表达pnpAB增强PNP降解

5.1强启动子过表达pnpAB工程菌株

PnpAB蛋白催化的反应被认为是PNP生物降解过程中的限速步骤。PNP降解基因的过表达，尤其是限速酶基因pnpAB，可能对PNP降解产生积极影响。本发明选择强启动子P3、P8_KT、P15、P16和P22分别与pnpAB基因及J9U基因组中插入位点的上、下游同源臂与pKJU质粒载体通过限制性内切酶EcoRⅠ进行连接，获得基因插入载体，通过接合转化的方法转化入H.cupida J9U中，使用卡那霉素抗性筛选得到发生第一次单交换的重组子，重组子在含有5-Fu培养基再次筛选得到经过第二次交换的目标基因插入菌株，并获得5株对pnpAB基因的过表达的工程菌，分别命名为J9U-P3-AB、J9U-P8_KT-AB、J9U-P15-AB、J9U-P16-AB和J9U-P22-AB；

无痕插入J9U基因组中phbC基因中间位置(第759个碱基位置)，实现了pnpAB基因的过表达。以各工程菌株的基因组DNA为模板进行PCR反应扩增特异性DNA条带，以J9U菌株的基因组为模板作为阴性对照，通过DNA片段的大小和测序结果证明工程菌株成功构建。图14为pnpAB基因过表达工程菌株的电泳图，由此可见菌株构建成功。

图14为pnpAB基因过表达工程菌株电泳图。A为工程菌J9U-P3-AB；B为工程菌J9U-P8_KT-AB；C为工程菌J9U-P15-AB；D为工程菌J9U-P16-AB；E为工程菌J9U-P22-AB。泳道：M，Marker III；1，以J9U基因组为对照；2，不同启动子过表达pnpAB工程菌基因组为模板。

5.2强启动子过表达pnpAB基因转录水平

为了研究强启动子的插入是否会影响pnpAB基因的转录水平，本发明做了一个RT-PCR实验。根据图15，五株工程菌(J9U-P3-AB、J9U-P8_KT-AB、J9U-P15-AB、J9U-P16-AB、J9U-P22-AB)中pnpA和pnpB的转录水平相较于与J9U-P_lac-AB，均表现出较好的转录趋势。且pnpA的转录强度比pnpB高，产生这种结果的原因可能是由于pnpA基因与启动子相距较近，其转录强度要比pnpB更具优势。

图15为RT-qPCR分析五株过表达工程菌中pnpA和pnpB基因的转录情况图。以J9U-P_lac-pnpAB作为对照，其转录水平设为1。

5.3强启动子插入工程菌株的PNP降解

本发明测量了插入强启动子的工程菌株的PNP降解率和对PNP的耐受性。在添加了25mg/LPNP的MMG60中，气相色谱检测到PNP的特征峰。

在GC分析中，PNP特征峰的保留时间(RT)为14.3min(如图16中的A所示)，其标准曲线如图16中的B所示。

图16为GC分析结果图；其中，A为PNP出峰时间(RT)分别为14.3min，B为峰面积与浓度标曲线。

令人惊讶的是，工程菌株J9U-P15-AB仅在2小时内降解了25mg/l PNP，J9U-P3-AB、J9U-P8_KT-AB和J9U-P16-AB在6小时内降解(如图17所示)。这表明使用强内源启动子过表达pnpAB基因可显著增加PNP的降解速率。据了解，当前在关于使用内源性启动子工程策略在嗜盐菌中构建耐盐有机污染物降解途径的报道很少。因此，本发明在耐盐环境下实现对PNP的矿化具有较深远的影响。

图17为GC测定不同时间点PNP降解情况图。其中，A：J9U-P3-AB、B：J9U-P8_KT-AB、C：J9U-P15-AB、D：J9U-P16-AB；E：J9U-P22-AB。PNP出峰时间在14.3min。

J9U-P3-AB、J9U-P8_KT-AB、J9U-P15-AB、J9U-P16-AB；J9U-P22-AB 5个工程菌在PNP浓度为50mg/L、100mg/L和200mg/L的选择压力下，工程菌株的PNP耐受性也得到了显着改善(表4)，其中J9U-P15-AB工程菌在50mg/L浓度的PNP作用下，可在2.5h之内就可完全降解PNP。上述步骤中PNP在pnpAB基因表达酶的作用下生成中间产物-对苯二酚(HQ)，由于长期与空气接触，会发生氧化作用，其氧化产物会变成红棕色暴露在空气中易被氧化，使培养基中的颜色变成红棕色。同时，因为对苯二酚对细胞生长是有毒性的，因此对苯二酚的存在导致PNP不能完全矿化。

表4使用不同强启动子在J9U中针对不同浓度的PNP降解耐受验证

^a工程菌在一定浓度下过表达并完全降解PNP所需的时间。

6.J9U中PNP高效矿化途径的构建

本发明将来源于WBC-3菌中的6个降解基因pnpA、pnpB、pnpC、pnpD、pnpE、pnpF及gfp被插入到H.cupida J9U基因组中。H.cupida J9U具有中度嗜盐菌优良的特性，作为底盘宿主，通过外源性降解途径引入，可实现某一降解功能，具体的，本发明获得的菌株能够降解污染物，并且能够耐受高盐环境，对环境友好。图18显示了组装的整个降解途径。

图18为7个外源基因的组装示意图。Xn表示插入的第n个基因序列。Px代表不同的启动子。

图19为H.cupida J9U中PNP生物降解过程示意图。

外源基因及其插入的染色体位置详细信息如表5所示。

表5外源基因及其插入的染色体位位置详细信息

注：[1]Zhang J J,Liu H,Xiao Y,et al.Identification andcharacterization of catabolic para-nitrophenol4-monooxygenase and para-benzoquinone reductase from Pseudomonas sp.strain WBC-3[J].J Bacteriol,2009,191(8):2703-10.

[2]Cormack B P,Valdivia R H,Falkow S.FACS-optimized mutants ofthegreen fluorescent protein(GFP)[J].Gene,1996,173(1Spec No):33-8.

gfp在AB基因和CD基因之间，排列顺序是AB-GFP-CD；E基因在前，F基因在后，顺序为E-F；整体基因排列顺序为：A-B-GFP-C-D-E-F。

通过使用PCR检测和对插入的基因进行DNA测序，证明了工程菌的成功构建。对J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP两株工程菌提取基因组作为模板，电泳结果见图20。结果显示，本发明成功构建了两株可降解污染物的工程菌株。

图20为工程菌J9U-P8_KTPNP(A)和J9U-P15PNP(B)基因组中PNP降解基因及gfp的电泳检测图。M：Marker III；1-7分别表示：pnpA、pnpB、pnpC、pnpD、pnpE、pnpF、gfp。

7.J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP中外源基因的转录验证

引入的外源基因在启动子P8_KT和P15下转录，借助RT-PCR检测J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP中引入的PNP降解基因和gfp基因的转录。

图21为RT-PCR检测H.cupida J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP中7个外源基因的转录结果图。Ⅰ：J9U-P8_KTPNP；Ⅱ：J9U-P15PNP。A、B、C、D、E、F、G分别代表pnpA、pnpB、pnpC、pnpD、pnpE、pnpF和gfp。泳道：M，Marker III；1、基因组DNA为PCR模板；2、cDNA为PCR模板；3、mRNA为PCR模板；4、ddH₂O为PCR模板。

如同预期的那样(图21)，通过采用J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP基因的基因组DNA和cDNA用来充当模板获得的特异性PCR条带的大小与引入的外源基因的大小一致。与预想不同的是，当阴性对照mRNA和ddH₂O用作模板时，没有形成PCR条带。这表明整合到J9U基因组中的七个外源基因在J9U-P15PNP和J9U-P8_KTPNP中成功转录。

8J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP中绿色荧光蛋白GFP的功能性表达

工程菌株J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP的细胞用FM4-64/L荧光染色处理后会使细胞膜呈现红色。如图22显示了共聚焦扫描显微镜下观察结果：内部充满绿色荧光，细胞膜呈红色。结果表明，该菌株成功表达了绿色荧光蛋白eGFP。因此，当将带有eGFP标记的菌株J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP快速释放到受污染的环境中进行生物修复时，能够借助荧光对其进行跟踪。

图22为共聚焦显微镜观察结果图。其中，Ⅰ、Ⅱ分别为共聚焦显微镜测定工程菌株J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP中GFP荧光强度(A：细胞内的绿色荧光；B：细胞膜上的红色荧光；C：A和B的叠加。

9J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP的生长性能的测定

如果引入外来基因，工程菌株可能不会生长得很好，需要确定工程菌株J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP在插入外源基因的情况下是否能生长，对这两个工程菌株以及对照菌株J9U的生长情况进行了测定。如图23中的A所示，在LB60和MMG60培养基(LB60和MMG60分别为含有60g/L的NaCl的LB培养基和MMG培养基)中，并没与发现异常生长情况。

在比较最大比生长速率长率(μ_max)时，J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP之间并没有显著性差异(图23中的B)。由此也证明了在插入外源基因的情况下，细胞生长情况依旧保持优良的性能。

图23为工程菌株生长情况图；其中，A：工程菌株在LB60和MMG60培养基中的生长曲线；B：工程菌株的比生长速率。

10J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP的菌株遗传稳定性的测定

特别是J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP的遗传稳定性至关重要，因为影响了其用于污染物降解的潜力。工程菌株在LB60基中传代培养20代后仍可检测到目的基因序列，并且同时具备降解性能(图24)。

图24为J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP在培养20代后菌株中PNP降解基因的PCR检测情况。M：Marker III；1-7：分别为pnpA、B、C、D、E、F基因。

11J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP高效矿化PNP

防止PNP降解中间物的积累是至关重要的。J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP是本发明创建的有效的PNP矿化菌株。为了改善整个PNP降解途径，在pnpAB、pnpCD、pnpE和pnpF基因的前面分别放置了强启动子P8_KT和P15。利用RT-qPCR发现工程菌中PNP降解基因转录的改变。与J9U-P8_KTPNP相比，J9U-P15PNP内源强启动子P15启动子驱动的pnpABCDEF基因转录明显高于外源启动子P8_KT(图25中的A)。

如图25中的B所示，工程菌J9U-P15PNP可在6小时后使13C-PNP完全消失，菌株OD₆₀₀从0.2长到0.342；在相同条件下，如图25中的C所示，在对13C-PNP的矿化实验中，J9U-P8_KTPNP在8小时后13C-PNP完全消失，菌株OD₆₀₀从0.2长到0.29。由此可见，细胞生长代谢过程中以13-PNP作为唯一碳源。

利用稳定同位素示踪技术对污染物生物降解代谢产物的同位素标记模型进行了分析，计算了化合物在代谢途径中的流向和分布。通过代谢通量分析，可以获得特定代谢途径的活性。¹³C-PNP在降解途径各个酶的反应下最终代谢产物为¹³CO₂，由此可以证实PNP被完全代谢掉了。图27为PNP的¹³C代谢分析示意图。以J9U作为对照组，对工程菌J9U-P8_KTpnp和J9U-P15pnp在血清瓶密闭培养过程中上部空气组份进行分析，发现二氧化氮的含量显著增加，可能的原因在于反应初始，苯环上的NO₂ ^-的脱落。

图25为本发明提供的J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP菌株的降解基因转录及PNP矿化的验证图，其中，A：RT-qPCR检测J9U-P15PNP和J9U-P8_KTPNP中pnpABCDEF基因的转录水平；J9U-P8_KTPNP中pnpABCDEF的转录水平设为1；B：只添加PNP供J9U-P15PNP细胞生长的唯一碳源在MM60中PNP矿化情况；C：J9U-P8_KTPNP以PNP为唯一碳源进行细胞生长，在含有25mg/L PNP的60MM培养基中37℃振荡孵育8小时数据为三个重复的平均值±标准差。

V-PDB(单位：‰)和碳同位素比率都是¹³C。图26中的B展示了J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP如何降解PNP完成时产生的二氧化碳。分别有1275和2093，13C值大大高于J9U的值。与J9U相比，J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP培养系统中二氧化碳的13/(12C+13C)％分别增加了74％和136％。与J9U-P8_KTPNP相比，在J9U-P15PNP培养系统中在13C/(12C+13C)％下的总CO₂也增加了35％，结果表明，强启动子工程菌株J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP能够高效矿化PNP，此外，内源性启动子P15比外源性启动子P8_KT的降解效率更高。δ13C的计算公式如下：

图26为本发明提供的同位素分析证实J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP对13C-PNP的矿化作用，其中，A：J9U、

J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP血清瓶中上方空气组分；B：J9U、J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP培养体系中CO₂的δ13C和13C/(12C+13C)％。

图27为J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP中PNP的C代谢流分析图。

尽管已经分离并表征了许多天然PNP降解细菌，例如P.putida dll-E4和假单胞菌属物种wbc-3，常规的非极端微生物不能在高盐浓度下进行有机污染物的去除。当盐胁迫与污染胁迫相叠加时，嗜盐菌在高盐浓度的存在下降解或转化不同有机污染物的能力非常重要。因此，采用合成生物学的方法以H.cupida J9U菌株为底盘细胞构建高效矿化PNP的工程菌株，在高盐废水修复方面具有重要意义。通过引入表达调控元件(如启动子工程)与异源有机污染物降解途径与先前报道的PNP降解菌株相比，本发明构建的工程菌株J9U-P8_KTPNP和J9U-P15PNP，通过将完整的强启动子与PNP矿化途径通过无痕基因编辑方法整合至H.cupida J9U基因组中，从对PNP的降解效率和PNP的耐受性的研究表明，强启动子提高了PNP矿化途径中酶的表达。因此，基于启动子工程策略在开发、构建高效矿化污染物工程菌株方面提供了理论支持。

结论：

本发明选择通过RNA-seq数据分析、启动子预测及报告基因表征等手段，从J9U基因组中筛选内源性启动子，结合外源性启动子，将其应用于PNP降解途径的改造。具体的，

1.结合RNA-seq数据分析和在线启动子预测软件预测，从H.cupida J9U中初步筛选到了16个内源性启动子，并选取一个外源强启动子P8_KT。

2.通过利用gfp作为报告基因，对这17个启动子进行了表征。根据转录水平和荧光量的测定结果，5个启动子P3、P8_KT、P15、P16和P22被认定为强启动子。

3.将其中的5个强启动子P3、P8_KT、P15、P16和P22与外源基因pnpAB分别插入到J9U基因组中phbC基因第759个碱基位置，构建得到工程菌株J9U-P3-AB、J9U-P8_KT-AB、J9U-P15-AB、J9U-P16-AB和J9U-P22-AB，来对Pseudomonas sp.WBC-3的PNP降解途径限速酶基因pnpAB合成酶基因进行过表达，发现P15可在2.5h降解25mg/L的PNP。

4.启动子P8_KT和P15使得工程菌株J9U-P8_KT PNP和J9U-P15 PNP中与降解相关的基因高表达，利用13C同位素标记法验证了该方案的可行性。

5.通过测定工程菌的生长性能和降解基因的遗传稳定性，将gfp蛋白引入该菌株，为监测该菌株在环境修复中的应用提供了可能。

6.本发明在进行内源启动子筛选时，选择一个外源强启动子作为对照。结果显示在对PNP降解方面内源强启动子要优于外源强启动子。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.一种耐盐对硝基苯酚矿化菌株，其特征在于，所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株为基因组中upp基因缺失且插入强启动子和PNP矿化途径基因的渴望盐单胞菌(Halomonascupida)J9菌株。

2.根据权利要求1所述的耐盐对硝基苯酚矿化菌株，其特征在于，所述强启动子包括P15或P8_KT；所述P15的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述P8_KT的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.根据权利要求1所述的耐盐对硝基苯酚矿化菌株，其特征在于，所述PNP矿化途径基因包括pnpA、pnpB、pnpC、pnpD、pnpE和pnpF基因。

4.根据权利要求1所述的耐盐对硝基苯酚矿化菌株，其特征在于，所述渴望盐单胞菌J9菌株的基因组中还插入gfp基因。

5.权利要求1～4任一项所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株的构建方法，包括以下步骤：

将H.cupidaJ9中完整的反向筛选标记基因upp进行敲除，获得H.cupida J9U；

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，还包括利用所述pKJU质粒载体，将gfp基因通过无痕基因编辑方法整合至H.cupidaJ9U无痕基因编辑菌株的基因组中。

7.一种耐盐对硝基苯酚矿化菌株J9U-P8_KTPNP或J9U-P15PNP，其特征在于，所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株J9U-P8_KTPNP为基因组中upp基因缺失且插入强启动子P8_KT和PNP矿化途径基因pnpA、pnpB、pnpC、pnpD、pnpE和pnpF以及插入启动子P_lac和gfp基因的渴望盐单胞菌J9菌株；

缺失的upp基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

8.权利要求7所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株J9U-P8_KTPNP或J9U-P15PNP的构建方法，所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株J9U-P8_KTPNP的构建方法包括以下步骤：

将P15-pnpAB&P_lac-gfp、P15-pnpCD、P15-pnpE及P15-pnpF基因及各基因插入位点的上、下游同源臂分别与pKJU质粒载体进行连接，获得基因插入载体，通过接合转化的方法将基因插入载体转化入H.cupidaJ9U中，使用卡那霉素抗性筛选得到发生第一次单交换的重组子，重组子在含有5-Fu培养基再次筛选得到经过第二次交换的目标基因插入菌株，最终获得耐盐对硝基苯酚矿化菌株，命名为J9U-P15PNP。

9.权利要求1～4任一项所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株或权利要求5或6所述构建方法构建得到的耐盐对硝基苯酚矿化菌株或权利要求7所述耐盐对硝基苯酚矿化菌株J9U-P8_KTPNP或J9U-P15PNP或权利要求8所述构建方法构建得到的耐盐对硝基苯酚矿化菌株J9U-P8KTpnp或J9U-P15pnp在制备高盐浓度下降解PNP的产品中的应用。

10.内源性强启动子P15或外源性强启动子P8_KT在构建耐盐对硝基苯酚矿化菌株中的应用；所述P15的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述P8_KT的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。