CN117004629A - 用于构建多环芳烃降解工程菌的基因组合物及降解组合物 - Google Patents
用于构建多环芳烃降解工程菌的基因组合物及降解组合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117004629A CN117004629A CN202311280540.5A CN202311280540A CN117004629A CN 117004629 A CN117004629 A CN 117004629A CN 202311280540 A CN202311280540 A CN 202311280540A CN 117004629 A CN117004629 A CN 117004629A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- engineering bacteria
- groups
- aromatic hydrocarbon
- polycyclic aromatic
- degradation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 127
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 title claims abstract description 125
- 125000005575 polycyclic aromatic hydrocarbon group Chemical group 0.000 title claims abstract description 99
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 77
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 76
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 76
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims abstract description 27
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 52
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 51
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 46
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 32
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 26
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 22
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 18
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 16
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical group O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 13
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 11
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 10
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 claims description 7
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 7
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 6
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 claims description 6
- 238000005457 optimization Methods 0.000 claims description 6
- 241001240958 Pseudomonas aeruginosa PAO1 Species 0.000 claims description 4
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 claims description 4
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 claims description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 abstract description 7
- 238000007142 ring opening reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 102000016680 Dioxygenases Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010028143 Dioxygenases Proteins 0.000 abstract description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 abstract description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 abstract 1
- YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N phenanthrene Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3C=CC2=C1 YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 53
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- FCBUKWWQSZQDDI-UHFFFAOYSA-N rhamnolipid Chemical compound CCCCCCCC(CC(O)=O)OC(=O)CC(CCCCCCC)OC1OC(C)C(O)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 FCBUKWWQSZQDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 5
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 1-naphthol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=CC2=C1 KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OIPPWFOQEKKFEE-UHFFFAOYSA-N orcinol Chemical compound CC1=CC(O)=CC(O)=C1 OIPPWFOQEKKFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 3
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 3
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- SJJCQDRGABAVBB-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-2-naphthoic acid Chemical compound C1=CC=CC2=C(O)C(C(=O)O)=CC=C21 SJJCQDRGABAVBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DYNFCHNNOHNJFG-UHFFFAOYSA-N 2-formylbenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C=O DYNFCHNNOHNJFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N Naphthalene Chemical compound C1=CC=CC2=CC=CC=C21 UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100321409 Rattus norvegicus Zdhhc23 gene Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- VUZPPFZMUPKLLV-UHFFFAOYSA-N methane;hydrate Chemical compound C.O VUZPPFZMUPKLLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- OITQDWKMIPXGFL-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-2-naphthaldehyde Chemical compound C1=CC=C2C(O)=C(C=O)C=CC2=C1 OITQDWKMIPXGFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100096647 Escherichia coli (strain K12) srmB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101150026476 PAO1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100468655 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) rhlA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000320117 Pseudomonas putida KT2440 Species 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003876 biosurfactant Substances 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000010813 internal standard method Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000001089 mineralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 101150085729 phnD gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- -1 polycyclic aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000005067 remediation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 101150080850 rhlB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003385 ring cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/78—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Pseudomonas
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
- C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/38—Pseudomonas
- C12R2001/40—Pseudomonas putida
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及多环芳烃降解领域，具体涉及用于构建多环芳烃降解工程菌的基因组合物及降解组合物。用于构建多环芳烃降解工程菌的基因组合物，包括基因nidA、nidB，当宿主细胞为大肠杆菌时，所述基因组合物还包括nidD、phdE、phdF、phdG以及phnD。一种降解组合物，包括多环芳烃降解工程菌，还包括工程菌E.coli M2、工程菌E.coli M3中的至少一种。本发明通过优化编码双加氧酶的基因以及优化多环芳烃上游模块的降解路线，利用其得到的降解工程菌能够有效的实现芳环的裂解开环，以降解多环芳烃。
Description
技术领域
本发明涉及多环芳烃降解领域，具体涉及用于构建多环芳烃降解工程菌的基因组合物及降解组合物。
背景技术
多环芳烃（PAHs）代表一类分子结构中含有两个或以上芳环的难降解有机化合物，它们在环境中有多种存在形式，分布广泛，对环境和人体健康都有不利的影响。因此，寻找高效处理多环芳烃污染问题的方法是全球瞩目的课题之一。
目前，对于PAHs污染的修复方法主要可分为传统的物理、化学方法和以微生物为主的生物修复措施。大多数物理方法只能实现转移PAHs的目的，PAHs本身的结构并没有发生变化，只是将污染问题转移到不同的地点，对PAHs污染的修复效果具有不彻底性，需要进一步的污染物管理。利用化学方法去除PAHs时需要额外添加化学氧化剂，添加量过少会导致中间产物产生抵抗降解作用，同时中间产物会造成二次污染，而添加量过多同样也存在二次污染的问题。生物修复可以克服上述物理和化学修复的缺点，具有安全性、经济型和生态环境友好性等优点。
随着微生物对PAHs代谢途径、相关基因及酶的表征等研究的开展，微生物修复现已成为处理PAHs污染的常用方法，现有技术通常采用微生物菌剂对PAHs进行降解，但受到降解微生物的丰度、多样性、鲁棒性等自身生长的限制，同时，PAHs的强疏水性、低生物可利用性等因素也限制了微生物对PAHs的降解，导致PAHs的降解率低。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的对多环芳烃的降解率低的缺陷，从而提供用于构建多环芳烃降解工程菌的基因组合物及降解组合物。
一方面，本发明提供一种用于构建多环芳烃降解工程菌的基因组合物，包括基因nidA、nidB，当宿主细胞为大肠杆菌时，所述基因组合物还包括nidD、phdE、phdF、phdG以及phnD。
所述基因组合物中的各目的基因经过密码子优化，包括：所述nidA优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述nidB优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述nidD优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述phdE优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述phdF优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述phdG优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述phnD优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。通过优化编码基因nidA、nidB、nidD、phdE、phdF、phdG和/或phnD，同时优化多环芳烃的降解路线，利用优化后的基因组合物得到的降解工程菌能够更为有效的实现芳环的裂解开环和对多环芳烃的初步降解。
通过本发明提供的多环芳烃降解工程菌，包括编码上述的基因组合物，能够实现提高对多环芳烃的降解率。
另一方面，本发明提供一种多环芳烃降解工程菌的构建方法，包括如下步骤，S1，构建含有所述基因组合物的表达载体；S2，将表达载体转入宿主中，得到降解工程菌。
步骤S1构建含有所述基因组的表达载体的步骤如下，将基因组的各目的基因分别与经双酶切的质粒载体连接，得到表达载体；和/或，
所述基因组合物的各目的基因与经双酶切的质粒的连接体系为，以10μL为计： 2×Basic Assembly Mix 5 μL，质粒载体与各目的基因的体积比0.9-1.1:1.9-2.1，其余为去离子水，其中，质粒浓度为80-150 ng/µl，各目的基因的浓度为50-80ng/µl。
所述基因组合物的各目的基因与经双酶切的质粒载体连接条件为48-52℃，30-35min。
所述经双酶切的质粒载体的酶切体系为，以50μL为计：质粒为35-40μL，限制性内切酶EcoR I 2-2.5μL、限制性内切酶Hind III 2-2.5μL，digest Buffer 4-5μL，其余为去离子水，其中，质粒浓度为80-150 ng/µl，EcoR I的酶活为1500-2500 U，Hind III的酶活1500-2500 U。
所述经双酶切的质粒载体的酶切反应程序为35-39℃，45-50 min。
步骤S2中宿主为大肠杆菌、铜绿假单胞菌中的至少一种。
所述大肠杆菌为E. coliBL21(DE3)。
铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌PAO1或铜绿假单胞菌O-2-2中的至少一种。
另一方面，本发明还提供一种多环芳烃降解组合物，包括上述多环芳烃降解工程菌或上述构建方法构建的多环芳烃降解工程菌。
优选的，多环芳烃降解组合物还包括工程菌E. coliM2、工程菌E. coliM3中的至少一种。
优选的，多环芳烃降解组合物还包括工程菌P. putidaKTRL02，所述工程菌P. putidaKTRL02含有基因rhlA和rhlB；可选的，所述基因rhlA经过密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述基因rhlB经过密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
所述工程菌P. putidaKTRL02中含有基因rhlA和rhlB的表达载体的启动子为tac强启动子。
所述工程菌P. putidaKTRL02中含有基因rhlA和rhlB的表达载体中 RBS核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
所述工程菌P. putidaKTRL02的宿主为恶臭假单胞菌。所述恶臭假单胞菌为P. putidaKT2440。
所述多环芳烃降解工程菌、工程菌E. coliM2和工程菌E. coliM3的体积比为0.8-1.2:0.8-1.2:0.8-1.2。上述各菌株的菌悬液的菌活1×109-1×1010CFU/mL。
所述多环芳烃降解工程菌、工程菌E. coliM2、工程菌E. coliM3和工程菌P. putidaKTRL02的体积比为0.8-1.2:0.8-1.2:0.8-1.2:0.8-1.2。上述各菌株的菌悬液的菌活1×109-1×1010CFU/mL。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的一种用于构建多环芳烃降解工程菌的基因组合物，包括基因nidA和nidB。本发明对编码双加氧酶的nidA和nidB基因，利用其得到的降解工程菌能够有效的实现芳环的裂解开环，以降解多环芳烃。
当宿主细胞为大肠杆菌时，所述基因组合物还包括基因nidD、phdE、phdF、phdG和phnD。本发明结合phdE、nidD、phdF、phdG和phnD基因，实现了对多环芳烃上游模块的降解路线优化，通过nidA和nidB编码的环羟基化双加氧酶将多环芳烃转化为顺式结构，顺式结构被phdE、phdF、phnD和phdG编码的酶催化，转化为多环醛类，随后，多环醛类通过由nidD编码的脱氢酶的催化转化为多环酸类。因此，利用上述的基因组合物得到的降解工程菌能够更为有效的实现芳环的裂解开环和对多环芳烃的初步降解。
2. 本发明提供的一种多环芳烃降解工程菌的构建方法，包括构建含有所述基因组的表达载体；将表达载体转入宿主中，得到降解工程菌。本发明的构建方法简单易操作，难度低。
3.本发明提供的一种多环芳烃降解组合物，包括本发明提供的多环芳烃降解工程菌。本发明通过将优化基因序列后得到的降解工程菌形成混合体系，各降解工程菌相互配合，使得混合体系更为稳定，能够有效提高多环芳烃的降解率。
4. 本发明提供的一种多环芳烃降解组合物，还包括工程菌E. coliM2和工程菌E. coliM3中的至少一种。通过将工程菌E. coliM2和/或工程菌E. coliM3与本发明提供的多环芳烃降解工程菌混合，得到的混合体系，其中，本发明提供的多环芳烃降解工程菌能够将多环芳烃的芳环裂解开环和初步降解，而工程菌E. coliM2和/或工程菌E. coliM3对裂解后的降解物进行处理，实现将多环芳烃降解为终产物，终产物为二氧化碳和水，避免单独使用多环芳烃降解工程菌降解多环芳烃过程中，产生大量的中间产物，导致无法彻底降解芳烃物质进而使得降解率下降的问题。
5.本发明提供的一种多环芳烃降解组合物，还包括工程菌P. putidaKTRL02，所述工程菌P. putidaKTRL02含有基因rhlA和rhlB。本发明通过优化与合成鼠李糖脂的相关基因rhlA和rhlB，提高了工程菌利用葡萄糖生产鼠李糖脂的合成效率，将含有基因rhlA和rhlB的工程菌P. putidaKTRL02与本发明提供的多环芳烃降解组合物相结合，在降解过程中，通过提高鼠李糖脂的含量，降低了多环芳烃的疏水性，进而提高多环芳烃的溶解度，实现多环芳烃的降解率的提高。
本发明通过对负载基因rhlA和rhlB表达载体进行优化，尤其是选用tac强启动子控制两个基因的转录表达，同时对连接基因rhlA和rhlB的RBS序列进行优化，提高了工程菌P. putidaKTRL02的稳定性，减少了工程菌P. putidaKTRL02传代过程中质粒片段丢失的情况，加强了工程菌P. putidaKTRL02对基因rhlA和rhlB表达，进而提高了降解环境中鼠李糖脂的含量，提高了多环芳烃的降解率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中质粒构建示意图；
图2是本发明实施例2中质粒构建示意图；
图3是本发明实施例3中质粒构建示意图；
图4是实验例1中降解工程菌EcoliM01、降解工程菌P. aeruginosaPAO1-AB和降解工程菌P. aeruginosaO-AB降解菲的过程中的生长曲线及底物的消耗曲线图，其中，实线表示葡萄糖含量，虚线表示OD600值，降解工程菌E. coliM01菌悬液E-M01为降解工程菌E. coliM01菌悬液，PAO1-AB为降解工程菌P. aeruginosaPAO1-AB菌悬液，O-AB为P. aeruginosaO-AB菌悬液；
图5是实验例1中各工程菌和多环芳烃降解组合物对100 mg/L菲处理8天后菲的降解率，其中，O-AB+M2+M3为应用例4的多环芳烃降解组合物，PAO1-AB+M2+M3为应用例3的多环芳烃降解组合物，E-M01+M2+M3为应用例2的多环芳烃降解组合物；
图6是实验例2中的降解工程菌E. coliM01与野生菌E. coliBL21，降解工程菌P. aeruginosaPAO1-AB和其宿主细胞P. aeruginosaPAO1、P. aeruginosaO-AB和其宿主细胞P. aeruginosaO-2-2的菌悬液对100 mg/L菲处理8天后菲的降解率；
图7是实验例3中工程菌P. putidaKTRL02在含菲培养基中的生长和产脂情况；
图8实验例4中的降解工程菌E. coliM01、多环芳烃降解组合物EM0123和多环芳烃降解组合物EM0123与工程菌P. putidaKTRL02形成的组合物对100 mg/L菲处理8天后的菲的降解率。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
研究基于中间代谢物鉴定、底物利用和基因注释，提出了戈多尼亚属降解菲的水杨酸代谢途径。通过nidA和nidB编码的环羟基化双加氧酶将菲转化为顺式-3，4-二氢二羟基菲，顺式-3，4-二氢二羟基菲被phdE、phdF、phnD和phdG编码的酶催化，转化为1-羟基-2-萘甲醛，随后，1-羟基-2-萘甲醛通过由nidD编码的脱氢酶的催化转化为1-羟基-2-萘甲酸，1-羟基-2-萘甲酸被phdI和phdJ编码的酶催化，转化为2-羧基苯甲醛，进一步，2-羧基苯甲醛脱羧成1-萘酚，最后，将1-萘酚转化为水杨酸。这与先前关于水杨酸可进一步转化为儿茶酚的研究一致。儿茶酚被之后的一系列酶降解，最终参与到TCA循环中，实现将菲最终完全矿化为二氧化碳和水的目的。
但上述降解路线形成的工程菌对多环芳烃的初步降解效率不高，分析是由于现有降解路线对环的裂解效果差，因此，本发明在上述降解路线的基础上，增加了编码双加氧酶的nidA和nidB，强化了裂解开环过程，还补充了可以催化转化顺式-3，4-二氢二羟基菲的phdE，同时删除了新通路上不需要的phnF基因。
本发明实施例、应用例和实验例中涉及的质粒提取、PCR产物纯化、琼脂糖凝胶回收等操作按照上海赛默飞世尔公司提供的对应试剂盒说明进行，无缝克隆操作按照北京全式金生物技术公司无缝克隆试剂盒说明进行，使用的限制性内切酶均购自南京诺维赞公司。
本发明实施例野生菌E. coliBL21、底盘细胞E. coliBL21-M1，E. coliBL21-M1的质粒、基因序列nidD、phdF、phnD和phdG以及工程菌E. coliM2、E. coliM3来自文献Artificial Consortium of Three E. coli BL21 Strains with SynergisticFunctional Modules for Complete Phenanthrene Degradation。
降解工程菌P. putidaKT-AB的来自文献：Ruolin Qin, Tao Xu, Xiaoqiang Jia.Engineering Pseudomonas putida to produce rhamnolipid biosurfactants forpromoting phenanthrene biodegradation by a two-species microbial consortium[J]. Microbiol Spectr, 2022, 10(4): e0091022。
底盘细胞P. aeruginosaPAO1来自文献：郜香黎,李兆格,张丹,等.铜绿假单胞菌PAO1降解菲、萘的特性及产物分析[J].西北大学学报：自然科学版, 2012, 42(5):6.DOI:10.3969/j.issn.1000-274X.2012.05.016.
底盘细胞P. aeruginosaO-2-2来自文献：赵方龙,朱零清,杨雪,等.铜绿假单胞杆菌o-2-2产鼠李糖脂的发酵培养基优化及LC-MS/MS分析[J].中国生物工程杂志, 2013, 33(6):7.DOI:CNKI:SUN:SWGJ.0.2013-06-015。
底盘细胞P. putidaKT2440来自文献：杨运文,蒋伏欢,宋杰,等.重组工程法敲除恶臭假单胞菌KT2440的染色体基因[J].南京师大学报：自然科学版, 2011, 34(4):6.DOI:10.3969/j.issn.1001-4616.2011.04.018。
本发明质粒pHERD20T、pBBR1MCS-2和本发明底盘细胞E. coliBL21-M1、P. aeruginosaPAO1、P. aeruginosaO-2-2、P. putidaKT2440均可市售购买。
本发明中底盘菌株感受态制备方法：10 mL摇管中活化平板上的对应菌株单菌落，过夜后转接至装有100 mL LB的摇瓶中。参数设定为30°C， 220 rpm摇床中培养约3 h，使OD600值为0.6-0.8。于超净台将其分装至50 mL离心管中并冰置15 min。4°C，8000 rpm离心10 min，去上清并用冰预冷的无菌水重悬菌体，重复上述操作2次。之后用冰预冷的30%甘油重悬菌体，重复2次。最后于超净中用移液枪取1 mL 30%甘油重悬离心后的菌体，轻轻吹吸混匀后分装并储存于无菌的1.5 mL离心管中，迅速转移至-80℃冰箱中保存。
本发明实施例使用的引物序列及功能见表一。
表一本发明实施例使用的引物
实施例1
本实施例提供一种多环芳烃降解工程菌的构建方法，具体步骤和方法如下：
获取目的基因：按照核苷酸序列SEQ ID NO：1合成nidA、按照核苷酸序列SEQ IDNO：2合成目的基因nidB，按照核苷酸序列SEQ ID NO：4合成目的基因phdE。按照扩增反应体系为2×Phanta Max Buffer 25 μL，模板 1 μL（含有各目的基因nidA、nidB和phdE的质粒，浓度为100 ng/µl），Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL，dNTP Mix 1 μL，正向引物2 μL（浓度为10 µmol/L），反向引物 2 μL（浓度为10 µmol/L），ddH2O 18 μL，共50μL，扩增反应程序为预变性95℃ 2 min，变性95℃ 15sec，退火45-70℃ 15sec，35 cycles，延伸72℃ 15 s/kb，彻底延伸72℃ 5min，扩增目的基因nidA（引物为SEQ ID NO：11-12）、nidB（引物为SEQ ID NO：13-14）和phdE（引物为SEQ ID NO：15-16）。对扩增的各目的基因进行二次扩增，扩增反应体系为2×Phanta Max Buffer 25 μL，模板 1 μL（含有各扩增后的目的基因nidA、nidB和phdE，浓度为100 ng/µl），Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase 1 μL，dNTP Mix 1 μL，正向引物2 μL（浓度为10 µmol/L），反向引物 2 μL（浓度为10 µmol/L），ddH2O 18 μL，共50 μL，扩增反应程序为预变性95℃ 2 min，变性95℃15sec，退火45-70℃ 15sec，35 cycles，延伸72℃ 15 s/kb，彻底延伸72℃ 5min，得到二次扩增的目的基因nidA（引物为SEQ ID NO：20-21）、nidB（引物为SEQ ID NO：19、22）和phdE（引物为SEQ ID NO：23-24），使各目的基因产生与相邻位置重合的序列。
重组质粒的建立：通过对工程菌E. coliBL21-M1的质粒进行双酶切，删掉质粒上phnF基因，保留nidD、phdF、phnD和phdG基因，按照图1所示的质粒图谱将二次扩增的目的基因nidA、nidB和phdE与经双酶切的质粒载体进行连接，按照ABclonal爱博泰克公司无缝克隆试剂盒说明进行操作，其中，质粒载体双酶切体系为，限制性内切酶EcoR I（酶活2000 U）和限制性内切酶Hind III（酶活2000 U）各2.5 μL，质粒（出发质粒载体为降解工程菌E. coliBL21-M1的质粒，质粒浓度100ng/µl）40 μL，Fast digest Buffer 5 μL，酶切反应程序为37℃，45 min，将双酶切的质粒载体按照天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作步骤对双酶切的质粒载体纯化得到连接体系的质粒载体，质粒与三个二次扩增的目的基因的连接体系为：2×Basic Assembly Mix 5 μL，质粒载体0.5μL（质粒浓度80ng/µl），各目的基因1μL（目的基因浓度80ng/µl），去离子水定容至10 μL，连接反应条件为50℃，30min，连接步骤进行2次，将目的基因nidA、nidB、和phdE与质粒载体连接构建重组质粒（先将二次扩增的目的基因nidA和nidB与质粒载体连接，得到连接产物1，在将连接产物1与二次扩增的目的基因phdE连接得到重组质粒），反应结束后置于冰上并立即转化。
转化：将重组质粒转化至感受态细胞E. coliDH5α中，挑取在链霉素抗性平板上生长出的单菌落进行菌落PCR，筛选出正确转入构建质粒的菌株。从正确导入构建质粒的E. coliDH5α中提取质粒，导入底盘细胞E. coliBL21(DE3)中，通过菌落PCR筛选正确转入质粒的菌株，筛选出的菌株过夜培养后送至测序公司进行序列比对，序列正确的菌株即为所构建的降解工程菌E. coliM01。
实施例2
本实施例提供一种多环芳烃降解工程菌的构建方法，具体步骤和方法如下：
将实施例1扩增的目的基因nidA和nidB进行二次扩增，扩增反应体系为2×PhantaMax Buffer 25 μL，模板 1 μL（含有各扩增后的目的基因nidA、nidB和phdE，浓度为100ng/µl），Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL，dNTP Mix 1 μL，正向引物2μL（浓度为10 µmol/L），反向引物 2 μL（浓度为10 µmol/L），ddH2O 18 μL，共50 μL，扩增反应程序为预变性95℃ 2 min，变性95℃ 15sec，退火45-70℃ 15sec，35 cycles，延伸72℃15 s/kb，彻底延伸72℃ 5min，得到二次扩增的目的基因nidA（引物为SEQ ID NO：20-21）、nidB（引物为SEQ ID NO：19、25），使各目的基因产生与相邻位置重合的序列。
按照图2所示的质粒图谱，将二次扩增的目的基因nidA和nidB与经双酶切的质粒进行连接，其中，质粒载体双酶切体系为，限制性内切酶EcoR I（酶活1500 U）和限制性内切酶Hind III（酶活1500 U）各2.5 μL，质粒（出发质粒载体为pHERD20T，质粒浓度100ng/µl）40 μL， digest Buffer 5 μL，酶切反应程序为35℃，50min，将双酶切的质粒载体按照天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作步骤对双酶切的质粒载体纯化得到连接体系的质粒载体，连接操作根据ABclonal爱博泰克公司无缝克隆试剂盒说明进行，连接体系为2×Basic Assembly Mix 5 μL，质粒载体（出发质粒载体为pHERD20T，浓度为130ng/µl）0.2μL，1μL二次扩增的目的基因nidA和1μL二次扩增的目的基因nidB（各目的基因浓度60ng/µl）去离子水定容至10 μL。反应条件为48℃，35mi，将二次扩增的目的基因nidA、nidB与质粒载体连接构建重组质粒，反应结束后置于冰上并立即转化。
将重组质粒转化至P. aeruginosaPAO1感受态细胞中，挑取在抗性平板上生长出的单菌落进行菌落PCR，筛选出正确转入构建质粒的菌株。筛选出的菌株过夜培养后送至测序公司进行序列比对，序列正确的菌株即为所构建的降解工程菌P. aeruginosaPAO1-AB。
实施例3
本实施例提供一种多环芳烃降解工程菌的制备方法，具体步骤和方法如下：
将实施例2制备构建的重组质粒转化至P. aeruginosaO-2-2感受态细胞中，挑取在抗性平板上生长出的单菌落进行菌落PCR，筛选出正确转入构建质粒的菌株。筛选出的菌株过夜培养后送至测序公司进行序列比对，序列正确的菌株即为所构建的降解工程菌P. aeruginosaO-AB。
实施例4
本实施例提供一种多环芳烃降解工程菌的制备方法，具体步骤和方法如下：
获取目的基因：以实验室保存的降解工程菌P. putidaKT-AB的质粒为基础，按照上海赛默飞世尔公司提供的对应试剂盒说明进行质粒提取，并扩增出核苷酸序列如SEQ IDNO：8所示的目的基因rhlA和核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的目的基因rhlB，再按照扩增体系为2×Phanta Max Buffer 25 μL，模板1 μL（目的基因rhlA或rhlB），Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase 1 μL，dNTP Mix 1 μL，正向引物2 μL（浓度为10 µmol/L），反向引物（浓度为10 µmol/L）2 μL，ddH2O 18 μL，共50 μL，反应程序为预变性95℃ 2min，变性95℃ 15sec，退火45-70℃ 15sec，35 cycles，延伸72℃ 15 s/kb，彻底延伸72℃5min，得到二次扩增的目的基因rhlA（引物序列为SEQ ID NO：32、35）和rhlB（引物序列为SEQ ID NO：33-34），使各目的基因产生与相邻位置重合的序列。
重组质粒的构建：按照图3所示的质粒图谱，将二次扩增的目的基因rhlA和rhlB与经双酶切的质粒载体进行连接，其中，质粒载体双酶切体系为：限制性内切酶EcoR I（酶活2000 U）和限制性内切酶Hind III（酶活2000 U）各2.5 μL，质粒（出发质粒载体为pBBR1MCS-2，质粒浓度150ng/µl）40 μL，Fast digest Buffer 5 μL，酶切反应程序为37℃，45 min，按照ABclonal爱博泰克公司无缝克隆试剂盒说明进行操作，其连接反应体系为：连接体系为2×Basic Assembly Mix 5 μL，质粒载体0.6μL（质粒浓度100 ng/µl），2μL目的基因rhlA、2μLrhlB（目的基因rhlA和rhlB的浓度60 ng/µl），去离子水定容至10 μL，反应条件为50℃，30min，将目的基因rhlA和rhlB与质粒载体连接构建重组质粒，反应结束后置于冰上并立即转化，其中，在二次扩增目的基因rhlB和rhlA连接时，通过二次扩增的目的基因rhlB和rhlA重合的序列将目的基因rhlA和rhlB间的RBS序列连接于载体上，RBS序列核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
转化：将重组质粒转化至P. putidaKT2440感受态细胞中，挑取在卡那霉素抗性平板上生长出的单菌落进行菌落PCR，筛选出正确转入构建质粒的菌株。筛选出的菌株过夜培养后送至测序公司进行序列比对，序列正确的菌株即为所构建的工程菌P. putidaKTRL02。
应用例1
将实施例1-4构建的降解工程菌E. coliM01、P. aeruginosaPAO1-AB、P. aeruginosaO-AB和P. putidaKTRL02、E. coliM2、E. coliM3、底盘细胞E. coliBL21、P. aeruginosaPAO1以及P. aeruginosaO-2-2菌株分别在10mL摇管中过夜活化，过夜后转接到100 mL含有相应抗性的LB培养基中，培养约3 h。分别取45 mL的培养液在无菌环境中小心倒入 50 mL离心管中。4℃，8000 rpm，低温离心10分钟。在超净工作台中弃去上面，用MSM培养基洗涤菌体2-3次，然后通过计算以制备OD600约为3的各工程菌的菌悬液，并稀释至菌活为1×1010CFU/mL，其中，降解工程菌E. coliM01菌悬液命名为E-M01，降解工程菌P. aeruginosaPAO1-AB菌悬液命名为PAO1-AB，P. aeruginosaO-AB菌悬液命名为O-AB，P. putidaKTRL02菌悬液命名为KTRL02，E. coliM2菌悬液命名为M2、E. coliM3菌悬液为M3。
应用例2
按照体积比为1:1:1将应用例1制得的降解工程菌E. coliM01菌悬液、E. coliM2菌悬液、E. coliM3菌悬液混合，得到多环芳烃降解组合物EM0123。
应用例3
按照体积比为1:1:1将应用例1制得的降解工程菌P. aeruginosaPAO1-AB菌悬液、E. coliM2菌悬液、E. coliM3菌悬液混合，得到多环芳烃降解组合物PM23。
应用例4
按照体积比为1:1:1将应用例1制得的降解工程菌P. aeruginosaO-AB菌悬液、E. coliM2菌悬液、E. coliM3菌悬液混合，得到多环芳烃降解组合物OM23。
应用例5
按照体积比为0.8:1.2:1将应用例1制得的降解工程菌E. coliM01菌悬液、E. coliM2菌悬液、E. coliM3菌悬液混合，得到多环芳烃降解组合物EM0123。
应用例6
按照体积比为1:0.8:1.2将应用例1制得的降解工程菌P. aeruginosaPAO1-AB菌悬液、E. coliM2菌悬液、E. coliM3菌悬液混合，得到多环芳烃降解组合物PM23。
应用例7
按照体积比为1.2:1:0.8将应用例1制得的降解工程菌P. aeruginosaO-AB菌悬液、E. coliM2菌悬液、E. coliM3菌悬液混合，得到多环芳烃降解组合物OM23。
应用例8
与应用例的步骤和参数相同，不同之处在于各菌株稀释后的菌活为1×109CFU/mL。
实验例1
将应用例1中的各工程菌的菌悬液和应用例2-4制备得多环芳烃降解组合物按照3%接种量分别接种到含有5 g/L葡萄糖及100 mg/L 菲的100 mL无机盐培养基的摇瓶中，在30℃，200 rpm摇床中培养8天，并设置不添加任何菌悬液（包括降解组合物或各工程菌的菌悬液）的实验组为对照组，对照组的实验操作与实验组相同。
在各摇瓶中加入芘作为内标，用正己烷萃取培养基中底物，每摇瓶萃取2次，萃取液取至烧杯中，烧杯放在通风橱中等待正己烷挥发完全，待正己烷完全挥发，用色谱纯二氯甲烷稀释至1000-5000 ppm，无水Na2SO4干燥，并通过0.22 μm有机系膜过滤，之后装入2 mL进样瓶中。
使用气相色谱测定对多环芳烃菲的降解率，检测程序：进样口温度：280°C，检测器温度300°C。99.999%高纯氮气为流动相，流速1 mL/min，分流比为8。程序升温：80°C保持1min，以50°C/min的速率升温至210°C，再以5°C/min升至250°C。进样量为1.2 μL。
菲的降解率计算方法：为了消除进样量的误差，采用内标法测试菲的含量。底物降解率的公式如下：AF是指残留底物的峰面积，AB是内标的峰面积。具体计算公式为：
参见图4-图5所示，可知由三种大肠杆菌组成的三菌体系EM0123对100 mg/L菲的8天降解率最高，达到64.66%，比单菌增加了11.14%。其它两种人工混菌体系PM23和OM23的降解率则分别为51.35%和36.59%。
实验例2
按照与实验例1相同的步骤和参数，分别检测应用例1中降解工程菌E. coliM01和野生菌E. coliBL21，降解工程菌P. aeruginosaPAO1-AB和其宿主细胞P. aeruginosaPAO1、P. aeruginosaO-AB和其宿主细胞P. aeruginosaO-2-2的菌悬液对菲的降解率，各菌的接种量均为3%，参阅图6可知，降解工程菌菌悬液E-M01的降解率约为53.52%，与野生菌E. coliBL21相比提高了48.41%，与实验室保藏菌株E. coliBL21-M1相比提高了28.40%。O-AB的降解率为37.98%，低于E-M01和PAO1-AB的最终降解率。而PAO1-AB总体的生长情况要优于其它两种工程菌，但其降解率略低于E-M01，对100 mg/L菲的8天降解率为45.70%。
实验例3
在含有5 g/L葡萄糖及100 mg/L菲的无机盐培养基中接种1%工程菌P. putidaKTRL02，分别在培养第1-8天内，每天取1mL培养液，在4℃、8000 rpm离心10 min去除菌体后获得发酵液，取333 μL发酵上清液至7 mL离心管中，用1 mL乙醚萃取有机相后转移至新的7 mL离心管中，整个抽提过程进行3次。之后置于烘箱中挥发乙醚试剂，挥发完全后加入0.5 mL的蒸馏水制备溶液。以体积比为1:9比例向200 μL样品中添加用53%硫酸和0.19%苔黑酚配制的苔黑酚试剂，煮沸20分钟，室温下冷却15分钟，测定421 nm波长处的吸光值。
参见图7所示，可知，工程菌P. putidaKTRL02可以利用葡萄糖产生鼠李糖脂，在培养的第二天产量可以达到928.49 mg/L，最大OD600值出现在第五天，约为3.95。
实验例4
EM0123+ KTRL02组：按照1%的接种量将应用例1制得的工程菌P. putidaKTRL02菌悬液接种到含有5 g/L葡萄糖及100 mg/L 菲的100 mL无机盐培养基的摇瓶中，在30℃，220rpm摇床中培养12h，在按照3%的接种量将应用例2制得的多环芳烃降解组合物EM0123接种于摇瓶中，继续在30℃，200 rpm摇床中培养，从工程菌P. putidaKTRL02菌悬液接种时间起，共计培养8天。
EM0123组：与EM0123+ KTRL02组的区别在于，省略了工程菌P. putidaKTRL02菌悬液的接种。
E-M01组：与EM0123组的区别在于，将应用例2制得的多环芳烃降解组合物EM0123替换为应用例1中的降解工程菌E. coliM01菌悬液E-M01。
底物萃取和降解率的测定方法与实验例1相同。
参见图8所示，可知，降解持续8天后，加入工程菌P. putidaKTRL02的多环芳烃降解组合物对100 mg/L菲的降解率最高，达到81.62%，比多环芳烃降解组合物EM0123对100mg/L菲的降解率增加了16.96%。
实验例5
按照1.2%的接种量将应用例1制得的P. putidaKTRL02菌悬液接种到含有5 g/L葡萄糖及100 mg/L 菲的100 mL无机盐培养基的摇瓶中，在30℃，200 rpm摇床中培养24h，在按照3%的接种量将应用例2制得的多环芳烃降解组合物EM0123接种于摇瓶中，继续在30℃，200 rpm摇床中培养7天，从工程菌P. putidaKTRL02菌悬液接种时间起，共计培养8天。
实验例6
按照0.8%的接种量将应用例1制得的工程菌P. putidaKTRL02菌悬液接种到含有5g/L葡萄糖及100 mg/L 菲的100 mL无机盐培养基的摇瓶中，在30℃，200 rpm摇床中培养24h，在按照3%的接种量将应用例2制得的多环芳烃降解组合物EM0123接种于摇瓶中，继续在30℃，200 rpm摇床中培养7天，从工程菌P. putidaKTRL02菌悬液接种时间起，共计培养8天。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (14)
1.用于构建多环芳烃降解工程菌的基因组合物，其特征在于，包括基因nidA、nidB，当宿主细胞为大肠杆菌时，所述基因组合物还包括nidD、phdE、phdF、phdG以及phnD。
2.根据权利要求1所述的基因组合物，其特征在于，所述基因组合物中的基因经过密码子优化，包括：
所述nidA优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；和/或，
所述nidB优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；和/或，
所述nidD优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；和/或，
所述phdE优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；和/或，
所述phdF优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；和/或，
所述phdG优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；和/或，
所述phnD优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
3.一种多环芳烃降解工程菌，其特征在于，包括编码如权利要求1或2所述的基因组合物。
4.一种权利要求3所述的多环芳烃降解工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤，
S1，构建含有所述基因组合物的表达载体；
S2，将表达载体转入宿主中，得到降解工程菌。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤S1构建含有所述基因组的表达载体的步骤如下，将基因组的各目的基因分别与经双酶切的质粒载体连接，得到表达载体；和/或，
所述基因组合物的各目的基因与经双酶切的质粒的连接体系为，以10μL为计： 2×Basic Assembly Mix 5 μL，质粒载体与各目的基因的体积比0.9-1.1:1.9-2.1，其余为去离子水，其中，质粒浓度为80-150 ng/µl，各目的基因的浓度为50-80ng/µl；和/或，
所述基因组合物的各目的基因与经双酶切的质粒载体连接条件为48-52℃，30-35min。
6. 根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述经双酶切的质粒载体的酶切体系为，以50μL为计：质粒为35-40μL，限制性内切酶EcoR I 2-2.5μL、限制性内切酶Hind III2-2.5μL，digest Buffer 4-5μL，其余为去离子水，其中，质粒浓度为80-150 ng/µl，EcoR I的酶活为1500-2500 U，Hind III的酶活为1500-2500 U；和/或，
酶切反应程序为35-39℃，45-50 min。
7. 根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤S2中宿主为大肠杆菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中的至少一种。
8. 根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌为E. coli BL21(DE3)；和/或，
铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌PAO1或铜绿假单胞菌O-2-2中的至少一种。
9.一种多环芳烃降解组合物，其特征在于，包括权利要求3所述的多环芳烃降解工程菌或权利要求4-8任一项所述的构建方法构建的多环芳烃降解工程菌。
10.根据权利要求9所述的多环芳烃降解组合物，其特征在于，还包括工程菌E. coliM2、工程菌E. coli M3中的至少一种。
11.根据权利要求10所述的多环芳烃降解组合物，其特征在于，还包括工程菌P. putida KTRL02，所述工程菌P. putida KTRL02含有基因rhlA和rhlB；可选的，所述基因rhlA经过密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述基因rhlB经过密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
12.根据权利要求11所述的多环芳烃降解组合物，其特征在于，所述工程菌P. putidaKTRL02中含有基因rhlA和rhlB的表达载体的启动子为tac强启动子；和/或，
所述工程菌P. putida KTRL02中含有基因rhlA和rhlB的表达载体中 RBS核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；
和/或，所述工程菌P. putida KTRL02的宿主为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）。
13. 根据权利要求12所述的多环芳烃降解组合物，其特征在于，所述恶臭假单胞菌为P. putida KT2440。
14. 根据权利要求11-13任一项所述的多环芳烃降解组合物，其特征在于，所述多环芳烃降解工程菌、工程菌E. coli M2和工程菌E. coli M3的体积比为0.8-1.2:0.8-1.2:0.8-1.2；和/或，
所述多环芳烃降解工程菌、工程菌E. coli M2、工程菌E. coli M3和工程菌P. putidaKTRL02的体积比为0.8-1.2:0.8-1.2:0.8-1.2:0.8-1.2；和/或，
所述多环芳烃降解工程菌、工程菌E. coli M2、工程菌E. coli M3和工程菌P. putidaKTRL02为菌活1×109-1×1010 CFU/mL的菌悬液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311280540.5A CN117004629B (zh) | 2023-10-07 | 2023-10-07 | 用于构建多环芳烃降解工程菌的基因组合物及降解组合物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311280540.5A CN117004629B (zh) | 2023-10-07 | 2023-10-07 | 用于构建多环芳烃降解工程菌的基因组合物及降解组合物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117004629A true CN117004629A (zh) | 2023-11-07 |
| CN117004629B CN117004629B (zh) | 2024-01-02 |
Family
ID=88567602
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311280540.5A Active CN117004629B (zh) | 2023-10-07 | 2023-10-07 | 用于构建多环芳烃降解工程菌的基因组合物及降解组合物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117004629B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060275887A1 (en) * | 2005-06-03 | 2006-12-07 | Utah State University | Mycobacteria compositions and methods of use in bioremediation |
| CN109182234A (zh) * | 2018-08-09 | 2019-01-11 | 天津大学 | 一种降解多环芳烃污染物的大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用 |
| CN113462609A (zh) * | 2021-07-30 | 2021-10-01 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种高效降解多环芳烃的分枝杆菌及其应用 |
| CN117004546A (zh) * | 2023-09-26 | 2023-11-07 | 北京建工环境修复股份有限公司 | 一种多环芳烃的降解组合物与多环芳烃的降解方法 |
-
2023
- 2023-10-07 CN CN202311280540.5A patent/CN117004629B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060275887A1 (en) * | 2005-06-03 | 2006-12-07 | Utah State University | Mycobacteria compositions and methods of use in bioremediation |
| CN109182234A (zh) * | 2018-08-09 | 2019-01-11 | 天津大学 | 一种降解多环芳烃污染物的大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用 |
| CN113462609A (zh) * | 2021-07-30 | 2021-10-01 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种高效降解多环芳烃的分枝杆菌及其应用 |
| CN117004546A (zh) * | 2023-09-26 | 2023-11-07 | 北京建工环境修复股份有限公司 | 一种多环芳烃的降解组合物与多环芳烃的降解方法 |
Non-Patent Citations (7)
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117004629B (zh) | 2024-01-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Iyer et al. | H 2-producing bacterial communities from a heat-treated soil inoculum | |
| CN110387360B (zh) | 羟基类固醇脱氢酶及其在合成熊去氧胆酸前体中的应用 | |
| CN110573605B (zh) | 一种慢生根瘤菌单加氧酶及其在制备手性亚砜中的应用 | |
| BR112013003644B1 (pt) | isolado biologicamente puro de uma bactéria clostridium autoethanogenum | |
| WO2020108462A1 (zh) | 一种单加氧酶及其在制备光学纯亚砜中的应用 | |
| EP3129489B1 (en) | Production of succinic acid from organic waste or biogas or methane using recombinant methanotrophic bacterium | |
| CN112301049B (zh) | 高产血红素的重组质粒和基因工程菌株及其构建方法、高产血红素的方法 | |
| CN117004546B (zh) | 一种多环芳烃的降解组合物与多环芳烃的降解方法 | |
| CN109055324B (zh) | 一种改进的酮还原酶及其应用 | |
| CN114703222B (zh) | 一种可完全降解多环芳烃植物的培育方法 | |
| CN114672525B (zh) | N-乙酰基-5-甲氧基色胺的生物合成方法及其应用 | |
| CN113430181B (zh) | 一种来源亚洲象肠道宏基因组的细菌漆酶及其基因 | |
| CN107603991A (zh) | 一种邻苯二酚2,3‑双加氧酶基因及其应用 | |
| CN117004629B (zh) | 用于构建多环芳烃降解工程菌的基因组合物及降解组合物 | |
| CN111607549A (zh) | 一种厌氧解烃菌株的基因工程改造构建方法与应用 | |
| CN106957812B (zh) | 一种产细胞色素p450酶及其电子传递系统工程菌的构建及其应用 | |
| CN111394289B (zh) | 一种基因工程菌及其应用，生产前列腺素e2的方法 | |
| CN104403969A (zh) | 一种可降解孔雀石绿的过氧化物酶及其制备方法 | |
| CN111926027B (zh) | 一种邻苯二甲酸酯水解酶及其制备方法和应用 | |
| CN114672470A (zh) | 一种细胞色素p450 bm3突变酶及其在生物催化合成对羟基联苯中的应用 | |
| CN109182233B (zh) | 一种多环芳烃降解工程菌及其工程改造方法和应用 | |
| CN109897872B (zh) | 酶法制备(2s,3s)-n-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷 | |
| CN111620322A (zh) | 一种利用微生物发酵液还原氧化石墨烯的方法 | |
| CN106811427B (zh) | 角度双加氧酶基因dpeA1A2及其应用 | |
| CN112391328B (zh) | 恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotL基因缺失突变菌及其构建方法、测定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |