KR20010073276A

KR20010073276A - 다환식 탄화수소 오염 토양의 생물정화를 위한 고분자다환식 탄화수소 분해 미생물, 그의 제조 방법 및 분해미생물을 포함하는 유류 분해 조성물

Info

Publication number: KR20010073276A
Application number: KR1020000001531A
Authority: KR
Inventors: 안태영; 이일규
Original assignee: 안태영; 김태호; 주식회사 그린월드
Priority date: 2000-01-13
Filing date: 2000-01-13
Publication date: 2001-08-01
Also published as: KR100712425B1

Abstract

본 발명은 고분자 다환식 탄화수소를 분해하는 미생물에 관한 것으로서, 3-링 이상의 고분자량 다환식 방향족 탄화수소(PAH)를 분해할 수 있는 특징을 갖는 기탁번호 KCTC8975P호의 마이크로박테리움 에스피.(Mycobacterium sp.) C2-3 및 그의 제조 방법을 제공하며, 또한, 상기 마이크로박테리움 에스피. C2-3을 활성성분으로 포함하는 유류 분해 조성물을 제공하여, 유류로 오염된 환경을 정화할 수 있다.

Description

다환식 탄화수소 오염 토양의 생물정화를 위한 고분자 다환식 탄화수소 분해 미생물, 그의 제조 방법 및 분해 미생물을 포함하는 유류 분해 조성물{High molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbon degrading bacteria for bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbon contaminated environment, the method for preparation thereof and decomposing oil composition comprising the degrading bacteria}

본 발명은 다환식 탄화수소 오염 토양의 생물 정화를 위한 고분자 다환식 탄화수소 분해 미생물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 토양에 포함되어 있는 고분자량 다환식 방향족 탄화수소(PAH)를 보조인자나 보조기질 없이 분해할 수 있는 분해 미생물에 관한 것이다.

고분자량 다환식 방향족 탄화수소(PAH)는 화석연료의 연소나 산업활동에 의하여 생성되는 오염물질이다. 많은 양의 PAH가 전세계적으로 공업화된 지역의 담수 및 해양 침적물(sediment)에서 검출되고 있다. PAH는 부유 물질에 흡착하는 성질이 강하여 수계의 바닥으로 침전되어 저질토에 축적된다. 고농도의 PAH는 저서생물의 돌연변이를 유발하거나 사멸시키는 등의 효과를 나타낸다(Varanasi and Stein, 1991). PAHs에 노출되면 인간 건강에 위험을 초래하기 때문에 많은 국가에서 이들 물질을 제거하기 위하여 많은 노력을 하고 있다(White, 1986).

미생물은 자연환경에서 화학물질의 생분해에 있어서 매우 중요한 역할을 한다. 화학물질의 생분해는 각각의 균주에 대한 대사 또는 미생물 군집에 의한 복합적인 대사에 의해 이루어진다.

파이렌은 미국 EPA에 의해 규정된 129개의 우선처리 오염물질에 속해있는 16종의 PAH중의 하나이다(Keith와 Telliard, 1979). 4개의 방향고리가 융합되어 있는 형태로 벤조[에이]파이렌(benzo[a]pyrene), 인데노-(1,2,3-씨디)-파이렌(indeno-(1,2,3-cd)-pyrene)과 1-나이트로파이렌(1-nitropyrene)과 같은 독성이 강한 발암물질과 유사한 구조를 갖기 때문에 유산균 배양액과 더불어 PAH 분해 및 대사연구에 있어서 모델화합물로 연구되고 있다(Chen, 1983; Jacob 등, 1982).

PAH는 광분해, 화학적 산화와 기화에 의해 제거되지만 미생물에 의해 주로 분해가 되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 미생물을 이용하여 오염지역을 정화하는 기술의 발달은 오염지역의 정화에 있어서 많은 잠재력을 갖는다(Muller et al.,1991). 이러한 생물학적 정화처리 기술을 발전시키기 위해서는 분해력이 우수한 균주의 확보가 선행되어져야 하며 분해세균의 생태학적, 생리학적 연구뿐만 아니라, 분해산물을 추적한 실험적인 결과가 뒷받침되어야 한다.

미생물에 의한 PAH 분해에 관한 연구는 1920년대부터 꾸준히 연구되어져 왔다. 1928년 Gray and Thornton에 의하여 나프탈렌(naphthalene), 페놀(phenol), 크레졸(cresol)과 같은 방향족 탄화수소를 대사할 수 있다는 보고 이후 현재까지 다양한 미생물에 의해 여러 가지 종류의 PAH 분해에 관한 연구가 진행되고 있다. 대부분의 연구는 몇 종의 슈도모나스(Pseudomonas), 아에로모나스(Aeromonas), 플라보박테리움(Flavobacterium), 베이제린키아(Beijerinkia),알칼리게네스(Alcaligenes), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 비브리오(Vibrio), 그리고 마이코박테리움(Mycobacterium)에 집중되어져 왔다.

페난트렌(Phenanthrene)은 링을 3개 가진 구조로 이루어져 있으며 다른 PAH보다 독성을 덜 띠고 있지만 자연 환경에 많이 분포하고 있기 때문에 PAH의 대표적인 모델 화합물(model compounds)로 사용되고 있다. 고분자량 다환식 방향족 탄화수소(PAH)의 정의는 벤젠 고리 또는 펜타사이클릭부분(pentacyclic moieties)이 선형, 각형, 또는 집단적으로 배열되어 있는 화합물질의 총칭이다. 이들 PAH는 낮은 용해도, 열역학적으로 매우 안정한 구조, 입자에 강한 흡착력 등의 화학적 특징을 갖고 있으며, 생물체에게는 암을 유발시킬 수 있는 특성을 갖고 있다(Varanasi and Stein, 1991). 독특한 화학적 특성 때문에 환경에 노출되면 오염의 정도가 상당기간 지속성을 갖게 된다. PAH의 오염경로는 생합성적(biosynthetic), 지구화학적(geochemical) 그리고 인위 개변적(anthrophogenic)인 요인 등 3 가지로 나눌 수 있다. 이 중 오염 정도가 심하고 환경 정화 프로그램에 대상이 되는 것은 인위 개변적으로 유류 유출사고, 크레오소트(creosote), 콜타르(coal tar)와 석유화합물의 고의적인 투기, 나무나 화석연료의 불완전 연소에 의한 생성 등이다. PAH는 광분해, 화학적 산화와 기화에 의해 제거되지만 미생물에 의해 주로 분해가 되는 것으로 알려져 있다.

파이렌(Pyrene)은 4-링을 갖는 고분자량의 다환식 탄화수소로써 1988년 Heitakemp 등이 처음으로 마이코박테리움 에스피.(Mycobacteriumsp.)가 분해할 수 있음을 밝힌 이후 알칼리게네스 디나이트로피컨트(Alcaligenes denitrificans)와로도코쿠스 에스피.(Rhodococcussp.)에 의해 분해된다는 보고가 있다. 저분자량 다환식 탄화수소의 분해연구와는 달리 극히 적은 미생물의 종류가 파이렌의 분해에 관여하는 것으로 추측되고 있으며 이러한 이유로 토양을 포함하는 환경에서도 상대적으로 지속성이 강한 것으로 알려져 있다. 이미 많은 종류의 미생물이 나프탈렌, 페난트렌을 포함하는 저분자량 다환식 탄화수소를 분해한다는 연구가 발표되어져 있고 이에 따른 생태, 생리 및 분자생물학적인 측면의 연구도 활발히 진행되어져 왔다. 그러나 파이렌을 포함하는 고분자량 다환식 탄화수소의 경우 분해에 관여하는 균의 종류도 적을 뿐 아니라 그 생태, 생리, 분자생물학적 연구가 매우 적은 형편이다.

흥미롭게도 마이코박테리아는 4개 이상의 링 구조를 갖는 PAH를 분해할 수 있는 미생물로 유류 오염 토양에서 계속적으로 분리되고 있다. 소수성의 세포표면은 물에 대한 불용성 PAH 입자에 대한 흡착에 유리하기 때문으로 생각된다. 마이코박테리움(Mycobacterium)PYR-1은 파이렌과 플루오르안센(floreanthene)을 나프탈렌과 페난트렌보다 빠르게 분해하는 것으로 알려져 있고(Hietakemp and Cerniglia. 1989), 이 균주는 벤조[에이]파이렌(benzo[a]pyrene)을 무기화(mineralization)시키지 못하였다. 그러나 다른 마이코박테리움 균주(Mycobacteriumstrain)인 RJGII-135는 파이렌과 벤조[에이]파이렌을 분해하는 것으로 보고(Grosser 등, 1991)되었고 PYR-1과 RJGII-135는 16s RNA를 이용한 계통 발생적(phylogenetic) 분석 결과 마이코박테리아의 속성 성장 그룹(fast-growing group)에 속한다(Govindaswami 등, 1995).

(1) PAH 분해세균의 생태학적 생존 및 분해 특성

PAH가 환경에 노출되어 일으킬 수 있는 여러 가지의 문제점을 파악하고 이를 분해세균을 이용하여 환경으로부터 제거시키려는 연구가 많이 진행되어져 왔다. 그러나 이들 많은 연구들은 단일 PAH를 이용하여 분해능을 실험하고 그 분해특성을 파악하는 것이 주요 연구의 대상이었다. 그러나 중요한 점은 PAH가 오염된 지역에서는 단일 PAH가 존재하는 것이 아니라 2-링부터 5-링 이상의 PAH들이 혼합되어 있는 상태로 오염되어 있다는 점이다. 이에 Stringfellow와 Altken(1995)은 슈도모나스에서 페난트렌 분해시 나프탈렌, 메틸나프틸렌(methylnaphthylene), 플루오렌(fluorene)에 의해서 경쟁적인 대사작용(competitive metabolism)이 일어난다고 보고하였다. 따라서 특정 균주를 이용하여 PAH 오염지역을 생물정화하기 위한 모델링과 그 조절에 있어서 반드시 PAH들간의 대사적인 관계를 알아보아야 할 것이다.

(2) PAH 분해에 미치는 첨가제의 영향

PAH는 소수성의 특성을 갖고 있다. 이 소수성은 분자량이 증가할수록 증가한다. 미생물에 의한 이용도나 분해도를 증가시키기 위하여 생물학적 또는 화학적으로 생산된 계면활성제(surfactants)의 사용에 관한 연구들이 진행되고 있다. 이러한 연구들은 미생물에 의한 PAH 분해시에 계면활성제가 수계나 토양계에서 PAH의 생분해를 촉진시킨다(Guerin and Jones, 1988; Aronstein, et al., 1991; Lantz et al., 1995; Thiem, 1994). 그러나 이와는 반대로 계면활성제의 첨가는 미생물에 의한 PAH 분해도에 영향이 없거나 혹은 감소시킨다(Aronstein, et al., 1991;Efroymson and Alexander, 1991; Laha, and Luthy, 1991, 1992; Thiem, 1994; Volkering, et al., 1995; Liu, et al., 1995). 또 계면활성제가 사용될 때 임계미셀농도(CMC) 값 이상이 처리되면 토양이나 수계의 미생물에 유독(toxic)하게 작용한다(Aronstein, et al., 1991; Laha, and Luthy, 1992; Liu et al.,1991; Edward et al. 1991). 그러나 CMC 이상의 농도에서만이 PAH의 자동력(motility)나 용해도(solubility)를 증가시키는 것으로 알려져 있다(Vigon and Rubin,1989; Liu et al.,1991; Edward et al. 1991). 이러한 연구결과들은 다음과 같은 이유로 설명할 수 있다.

1) 균세포 막(bacterial cell membrane)의 파괴 혹은 투과도의 증가에 의한 독성의 상승(Helenius and Simons, 1975; Cserhati et al., 1991; Heipiper et al., 1994),

2) 박테리아가 소수성기질에 부착하는 것을 방지하는 것과 같은 세균과 계면활성제의 상호작용으로 인한 물리화학적 효과(Efroymson and Alexander, 1991; Neu, 1996),

3) 계면활성제의 영향으로 수층의 PAH 농도의 증가로 인한 독성,

4) 미셀(micelle)로부터 느린 PAH 용출이 초래하는 계면활성제-미셀-용해화된(surfactant-micelle-solubilized) PAH의 이용능의 감소(Volkering, et al., 1992, 1995; Guha and Jaffe, 1996; Zhang, et al., 1997) 및

5) 계면활성제와 PAH 사이의 기질로써의 경쟁(Liu, et al., 1995; Thiem, 1994) 등과 같은 요인이 한가지 혹은 복합적으로 작용할 가능성이 있으며 적용되는균주에 따라서 작용할 가능성도 배제할 수 없다.

(3) PAH 분해세균의 분해 경로 및 분자생물학적 고찰

PAHs를 탄소원과 에너지원으로 이용하여 분해할 수 있는 능력을 가진 많은 종류의 세균들이 분리되고 있다. PAHs의 대사 경로(catabolic pathway)의 경우 다른 PAHs의 경우 부분적으로 연구된 것에 비해 나프탈렌의 경우 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)G7에서 자세히 밝혀졌다(Yen and Serdar, 1988; Cerniglier, 1992; Pothuluri and Cerniglia, 1994).P. putidaG7에 의한 나프탈렌 대사작용은 나프탈렌 탈산소화 효소(naphthalene dioxygenase)에 의하여 링 하나에 1,2-디하이드록시-1,2-디하이드로나프탈렌(1,2-dihydroxy-1,2-dihydronaphthalene)을 생성하기 위하여 하이드록시화 반응(hydroxylation)을 시킨다. 이 나프탈렌 탈산소화 효소는 한가지의 환원 효소(reductase(nahAa)), 한 개의 페로독신(ferredoxin(nahAb)) 그리고 2개의 철-황 단백질(iron-sulphur protein(nahAc와nahAd))로 구성되어 있는 다중 효소(multimeric enzyme)이다. 1.2-디하이드록시-1,2-디하이드로나프탈렌이 탈수산화 효소(dehydroxygenase(nahB))에 의해 1,2-디하이드록시나프탈렌으로 탈수화된 후, 하이드록시화된 링은 1,2-디하이드록시나프탈렌 탈산소화 효소(nahC)(1,2-dihydroxynaphthalene dioxygenase(nahC))에 의하여 깨진다. 그 후 이성화 효소(isomerase(nahD)), 수화효소-알돌화효소(hydratase-aldolase(nahE)) 그리고 탈수소화 효소(dehydrogenase(nahF))에 의해 살리실산염(salicylate)과 피루브산염(pyruvate)을 생성하게 된다(Eaton and Champman, 1992; Eaton, 1994).생성된 살리실산염은 카테콜(catechol)로 변형되어 균주에 따라 오르토(ortho)와 메타(meta) 분열(cleavage)되며 이 단계를 하부 경로(lower pathway)라 칭한다(Williams and Sayers, 1994). 상부 경로(upper pathway)라 칭하는 나프탈렌에서 살리실산염(salicylate)까지의 대사 경로(catabolic pathway)는 다른 종류의 PAHs에서도 발견되는데P. fluorecence5R의 경우 페난트렌이나 안트라센(anthracene)이 1-하이드록시-2-나프톨산(1-hydroxy-2-naphthoic acid)과 2-하이드록시-3-나프톨산(2-hydroxy-3-naphthoic acid)으로의 변환이 바로 그 예이다(Menn et al., 1993).P. putidaG7의 경우 하부와 상부 경로를 암호화하는 유전자는 NAH7 플라스미드(plasmid)에 위치하는 sal과 nah라는 두 개의 폴리시스트로닉 오페론(polycistronic operon)에 배열되어 있다. 이 두 오페론의 발현 조절은 nahR의 산물에 의해 조절된다. NahR의 활성은 세포 내 살리실산염의 농도에 의해서 결정된다(Schnell, 1985).

(4) 자연환경에서의 생물정화에 적용방안

오염물질에 오염된 환경에 생물을 이용하여 정화하는 방법은 널리 이용되고 있다. 해당오염물질의 분해능을 갖는 미생물을 오염지역에 투여함으로써 그 환경에서 오염물질을 제거하거나 분해능을 증가시키는 것은 매우 유용한 도구로써 생각되었다(Atlas, 1991). 그러나 미생물을 투여함으로써 난분해성 물질을 성공적으로 처리했다는 보고(Briglia et al., 1990; Brodkorb and Legge, 1992; Grosser et al., 1991; Heitakemp and Cerniglia, 1989; Middledorp et al., 1990)와 미생물의 투여가 아무런 효과가 없다는 보고(Goldstein, et al., 1985; Harkness, et al.,1993; Liu, et al.,1990)가 양립하고 있다.

미생물을 이용한 생물정화(bioremediation)의 성공여부는 다양한 요인에 의해서 좌우될 수 있다. 그 요인은 접종자(inoculum)의 종류(type), 토양의 특성, 토양에 존재하는 기질과 그 양 등이다.

현재 국내의 경우 오염 환경에 관한 법규마저 체계적이지 못하고 규제할 수 있는 화합물질의 종류도 미진하다. 이런 이유로 토양 및 수계 특히, 국내 토양의 경우 어느 정도 PAH에 의해 오염이 되어 있는지 조차 파악할 수 없다. 현재 미국이나 그 밖의 여러 국가에서는 미생물을 이용한 PAH 오염 처리 프로그램을 개발하여 상용화까지 되어 있다. 그러나, 현재 국내산 미생물로 만든 미생물 제재로 이를 처리할 수 있는 방법에 관한 연구 등이 미진한 것이 문제이다.

따라서 본 발명에서는 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 국내 토양으로부터 고분자량의 PAH를 분해하는 세균을 분리하여 그 생태학적 및 생리학적 특성을 파악함으로써 국내 토양의 생물정화에 이용하고 그 효율을 높일 수 있는 분해 미생물을 제공하고자 한다.

도 1은 본 발명의 미생물에 의한 클리어 존(zone)의 형성(중앙 검은 부분)을 나타낸 도면이다.

도 2는 본 발명의 미생물이 생장할 수 있는 최적 온도를 나타내는 그래프이다.

도 3은 다양한 농도에서 파이렌(Pyrene)의 분해율을 나타낸 막대 그래프이다.

도 4는 다양한 농도에서 페난트렌(Phenanthrene)의 분해율을 나타낸 막대 그래프이다.

도 5는 다양한 유도 조건(Inducing condition)으로 페난트렌의 분해율을 도시한 그래프이다.

도 6은 다양한 유도 조건으로 플루오르안센(Fluoranthene)의 분해율을 도시한 그래프이다.

도 7은 다양한 유도 조건으로 파이렌의 분해율을 도시한 그래프이다(●: 유도하지 않음, ○ : 페난트렌 유도, ▼ : 플루오르안센 유도, ▽ : 파이렌 유도).

도 8은 파이렌(Pyrene)의 분해율에 대한 부식산(humic acid)의 효과를 도시한 그래프이다(●: 제어, ○ : 500 ppm, ▼ : 1000 ppm).

도 9는 파이렌(300 ppm)의 분해에 대한 계면 활성제의 효과를 도시한 그래프이다(●: 제어, ○ : 트리톤 X-100, ▼ : 트윈 80, ▽ : SDS).

도 10은 트리톤 X-100의 독성을 나타내는 효과를 도시한 그래프이다.

도 11은 파이렌(300 ppm)의 분해에 대한 보조 기질로서 페난트렌의 효과를 도시한 그래프이다(30 ℃, 150 rpm, 6 일).

도 12는 파이렌(300 ppm)의 분해에 대한 보조 기질로서 페난트렌의 효과를 도시한 그래프이다(30 ℃, 150 rpm, 6 일).

도 13은 파이렌(200 ppm)의 분해에 대한 보조 기질로서 페난트렌의 효과를 도시한 그래프이다(●: 제어, ○ : 50 ppm, ▼ : 100 ppm).

도 14는 파이렌(200 ppm)의 분해에 대한 보조 기질로서 플루오르안센의 효과를 도시한 그래프이다(●: 제어, ○ : 50 ppm, ▼ : 100 ppm).

도 15는 혼합된 폴리아로마틱하이드로카본(PAH)에 대한 마이코 박테리움 에스피.(Mycobacterium sp.) C2-3과 스핑고모나스 에스피.(Sphingomonas sp.) 1-21로 혼합된 배지(culure)의 페난트렌의 분해율을 나타낸 그래프이다(■: 2 일 경과, ?? : 6 일 경과).

도 16은 혼합된 폴리아로마틱하이드로카본(PAH)에 대한 마이코 박테리움 에스피.(Mycobacterium sp.) C2-3과 스핑고모나스 에스피.(Sphingomonas sp.) 1-21로 혼합된 배지(culture)의 파이렌의 분해율을 나타낸 그래프이다(■: 2 일 경과, ?? : 6 일 경과).

본 발명은 상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여,

기탁번호 KCTC8975P호의 3-링 이상을 갖는 다환식 방향족 탄화수소의 분해능을 가진 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 에스피.(Mycobacterium sp.) C2-3을 제공한다.

상기 3-링 이상의 다환식 방향족 탄화수소는 파이렌(Pyrene), 페난트렌(Phenanthrene) 및 플루오르안센(Fluoranthene)으로 이루어진 군에서 선택되는 다환식 방향족 탄화수소이다.

또한, 본 발명은 상기의 마이코박테리움 에스피.(Mycobacterium sp.) C2-3이 노말-알칸(n-alkane)의 분해능을 가지는 마이코박테리움 에스피. C2-3을 제공한다.

또한, 본 발명은 기탁번호 KCTC8975P호인 마이크로박테리움 에스피.(Mycobacterium sp.) C2-3을 활성성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 유류 분해 조성물을 제공한다.

상기 유류 분해 조성물은 계면 활성제 및/또는 부식산을 더욱 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은

a) 기름으로 오염된 토양에서 시료를 채취하고,

b) 채집된 시료를 파이렌이 유일 탄소원으로 들어있는 최소 배지에 첨가하여 실온에서 1 주일 이상 배양하고,

c) 상기 배양액을 상기 b)의 배양 조건과 동일한 조건의 새로운 배지로 접종하는 농축 배양을 하고 C2-3 균주를 분리한 후,

d) 상기 c)에서 분리된 C2-3 균주를 파이렌이 도포된 최소 고체 배지 위에서 1 주일 이상 배양하고,

e) 마이크로박테리움 에스피.(Mycobacterium sp.)로 동정하는 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 에스피.(Mycobacterium sp.) C2-3의 제조 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

파이렌(Pyrene)을 분해하는 균주를 분리하기 위하여 유류 저장 시설 주변의 만성적인 유류 오염 토양을 파이렌이 유일 탄소원으로 들어 있는 최소 배지에 첨가하여 실온에서 1 주일간 배양하고, 그 배양액을 동일한 조건의 새로운 배지로 접종하는 농축 배양을 한 후 Kiyohara의 방법으로 분리한다. 분리된 C2-3 균주는 파이렌이 도포된 최소 고체 배지 위에서 1 주일 배양 후에 뚜렷한 분해환을 관찰할 수 있다.

C2-3 균주는 그람 양성이며, 마이크로박테리움 에스피.로 동정된다. 또한, C2-3의 염기 서열을 바탕으로 PHYLIP를 이용한 최대 가능 계통도를 이용하여 다른 마이크로박테리움 균주들과 비교한 결과 속성 성장 마이크로박테리움 그룹(fast-growing Mycobacterium)에 속하는 것을 알 수 있다.

마이크로박테리움 에스피. C2-3의 배양 최적 온도는 트립틱 소이 브로스(TSB)에서 20 내지 30 ℃이고, 이 온도에서 고체 배지상에서 수 일간 육안으로 관찰할 수 있을 만한 콜로니를 생성할 수 있으며 콜로니의 모양은 중간 크기이고 부드러운 모양이며 빛이 나는 특성을 가지며, 색깔은 노란색을 띠고 있다.

마이크로박테리움 에스피. C2-3이 분해할 수 있는 탄화수소는 표 2와 같다. 본 발명의 M. sp.는 파이렌, 플루오르안센 등의 고분자량 PAH는 분해할 수 있으나 나프탈렌과 같은 저분자량의 PAH는 잘 분해하지 못한다. 반면에 헥사데칸과 헵타데칸 등의 노말-알칸은 분해할 수 있다.

M. sp. C2-3의 파이렌 분해에 있어서 부식산의 영향을 알아보기 위하여 500ppm과 1000 ppm의 부식산을 처리하였을 때 분해도의 증가의 변화를 나타내는 도 8에 나타난 바와 같이 부식산으로 처리하였을 때 파이렌의 분해도가 높은 것을 알 수 있다.

탄화수소의 분해도를 증가시키는 방법 중의 하나가 계면활성제의 첨가이다. 따라서, 계면활성제의 첨가가 M. sp. C2-3의 파이렌 분해에 미치는 영향을 알아보기 위해 트리톤(Triton) X-100(일본 준세이화학사 제조), 트윈(Tween) 80(미국 sigma사 제조), SDS(미국 sigma사 제조)로 처리한다. 트윈(Tween) 80이 처리된 실험군에서 2일 배양에 50 정도의 분해능을 보였고, 3일 후에 더해준 파이렌이 95 이상이 분해됨을 알 수 있다. SDS의 경우에는 트윈(Tween) 80보다는 분해도가 다소 낮은 약 30 정도의 분해도를 보이고 4일 배양 후에 95 이상의 파이렌을 분해한다. 그러나, 트리톤(Triton) X-100은 분해능을 전혀 나타내지 못함을 알 수 있다.

상기 계면활성제가 M. sp. C2-3의 세포 성장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 포도당을 탄소원으로 제공한 최소 배지에 각각의 계면활성제를 첨가하고 성장도를 측정한 결과 트윈(Tween) 80과 SDS는 세포의 성장을 촉진하였으나 트리톤(Triton) X-100의 경우에는 완벽하게 억제되었다. 이는 트윈(Tween) X-100이나 SDS의 경우 탄소원으로 이용된다기보다는 보조 인자로서 작용하는 것으로 생각되며, 파이렌 분해시 분해도를 증가시킨 이유는 이들 계면활성제가 보조 인자로서의 작용과 파이렌의 용해도를 증가시켜 분해도를 높인 것으로 생각된다. 그러나, 트리톤(Triton) X-100의 경우에는 M. sp. C2-3의 성장 자체에 독성을 갖는 것으로 판단된다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 다만, 하기하는 실시예는 본 발명을 더욱 잘 이해되도록 하기 위한 것으로 본 발명이 하기하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

[PAH 분해 균주의 분리]

균주의 분리는 기름 탱크 주변의 토양을 중심으로 유류가 오염되어 있는 곳을 선정하였다. 채집된 토양시료는 최소배지 5 ㎖와 500 ppm의 파이렌이 들어있는 20 ㎖ 용량의 바이알(vial)에 0.5 g 씩 접종하고 28 ℃, 130 rpm에서 1주일간 농축(enrichment)하였다. 농축된 시료는 동일한 조건의 새로운 배지로 100 ㎕씩 접종하여 전달(transfer)하여 1주일간 배양하였다. 이러한 전달(transfer)을 3회 반복하였다. 사용된 최소 배지의 성분은 다음과 같다. 증류수 1 L당 (NH₄)₂SO₄30 mg, NaCl 2 g, K₂HPO₄0.5 g, MgSO₄-7H₂O 50 mg, CaCl₂-H₂O 20 mg, KNO₃10 mg, 추적 금속 용액(trace metal solution) 1 ml이다.

3회의 연속 농축 후에 1.5 의 아가(agar)를 첨가하여 고형화시킨 최소배지에 단계적으로 희석하여 100 ㎕ 씩 접종한 후 Kiyohara(1982)의 방법에 의해 파이렌을 2 가 되도록 아세톤에 녹여 분무 살포하였다. 배양은 28 ℃에서 배양하였으며 배양 중 수시로 관찰하여 콜로니(colony) 주위에 투명대(clear zone)가 생성된 콜로니를 분리하였다. 약 150 개의 콜로니를 얻었으며 순수배양을 위하여 2 배 희석된 트립틱 소이 아가(Tryptic soy agar) (Difco)에 스트릭(streak)하여 순수한 단일콜로니를 얻었다.

[분리된 균주의 농도별 파이렌 분해확인]

분리된 균주가 파이렌을 분해하는데 있어서 어느 정도의 농도까지 분해하는가를 밝히기 위해서 최소액체배지 5 ㎖에 50, 100, 250, 500, 1000 ppm이 되도록 파이렌을 아세톤에 녹여 첨가하였다. 균의 접종은 TSB에서 24 시간 전 배양시킨 후 원심분리(8000 rpm, 4 ℃, 10 분)하여 균체를 수확하고 최소액체배지를 이용하여 3회 세척하였다. 수확된 균체액은 파이렌이 첨가된 배지에 OD₄₄₀0.1이 되도록 접종하였다. 배양은 28 ℃, 130 rpm에서 하였으며, 잔류 파이렌 분석은 배지양의 3 배에 해당하는 에틸 아세테이트로 추출하여 증류기로 에틸 아세테이트를 증발시킨 후 아세토니트릴 2 ㎖에 녹여 LC-PAH (Supelco) 컬럼(colume)이 장착된 HPLC(Shimazu)를 이용하였으며 분석조건은 100 아세톤을 분당 0.5 ㎖씩 흘리고, 시료는 20 ㎕를 주입하였으며 검출기는 UV 검출기를 이용하여 254 nm에서 측정하였다.

[분해능을 갖는 세균의 동정]

분해능이 있는 균주는 생리생화학 실험, FAME의 조성을 분석 및 16S rRNA의 시퀀스(sequence)를 조사하여 동정한다. 균체의 게놈(genomic) DNA는 Giovannoni 등(1990)의 방법을 변형하여 추출하였다. 16S rRNA 유전자의 증폭에 이용된 프라이머(primer)는 유박테리아(eubacteria)의 16S rDNA 도메인(domain)에 특이적으로 부착하여 증폭하는 27F (E. colinumbering 8∼27 : 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')와 1492R (E. colinumbering 1492∼1510 : 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')을 사용하였다(Lane, 1991). PCR 반응물의 조성은 10 배 반응용액(100 mM Tris·HCl, 400 mM KCl, 500 ㎍/㎖ BSA, pH 8.3), 1.5 mM MgCl₂, 250 M dNTPs, 100 pmol 프라이머(primer)이며, 정제된 DNA(50 ng/㎕)와 3U의Taq중합효소(polymerase)를 첨가하여 총 50 ㎕의 혼합물을 만들고 석유(mineral oil) 30 ㎕를 중층하여 반응을 진행시켰다.

PCR 반응조건은 94 ℃에서 2 분간 초기 열처리를 한 후, 94 ℃에서 2분, 50 ℃에서 1 분, 72 ℃에서 2 분씩 30회 반복하고 마지막에는 72 ℃에서 20 분간 처리한 후 반응을 중단하였다. 증폭된 PCR 반응물은 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동하여 분리하였다. DNA 시퀀싱 시스템(sequencing system)(ABI377)을 이용하여 직접 시퀀싱(direct sequencing)을 실시하였다. 결정된 염기서열을 GenBank 및 EMBL(european molecular biology laboratory)등의 데이타베이스와 비교하여 분류학적 위치를 확인하였다.

[분해에 미치는 환경요인]

온도 및 pH의 영향

분리된 균주가 파이렌을 분해함에 있어 최적온도를 파악하기 위하여 4 ℃, 15 ℃, 25 ℃, 30 ℃, 37 ℃, 45 ℃에서 분해능을 확인하였다.

유기물의 영향

Heitkamp와 Cerniglia(1988)는 PAH 분해세균이 펩톤(peptone), 효모추출(yeast extract), 또는 녹말과 같은 유기물이 소량 첨가되면 PAH의 분해능이 증가된다고 보고하였다. 본 실험에서는 분리한 균주가 파이렌 분해시 유기물의 영향을 파악함으로써 분해도를 증가시킬 수 있는가를 파악하였다.

부식산(Humic acids)의 영향

부식산은 토양과 지하수에서 흔히 존재하는데 이 부식산이 계면활성제와 같은 역할을 한다(Chiou 등, 1987). 따라서 분리된 균주가 파이렌의 분해시 부식산의 영향을 파악하였다.

유도된(induced) 세포와 유도되지 않은(non-induced) 세포의 분해

PAH 분해와 관련된 효소들은 플라스미드에 암호화되어 있는 유도 대사 효소(inducible catabolic enzyme)이다(Williams, 1981). 따라서 분리된 균주가 PAH를 분해하는데 있어서 분해와 관련된 효소 유도와 단백질 합성의 영향을 알아보고자 하였다. Induced starter culture는 TSB에서 전 배양 후(5 일, 30 ℃, 130 rpm) 원심분리(4 ℃, 4,000 rpm)하여 균체를 수확한 후 최소 배지(minimal medium)로 3회 세척하였다. 세척 후 50 ppm의 PAH가 들어 있는 50 ml의 최소 배지로 균체를 옮긴 후 전 배양과 같은 조건에서 1 주일간 배양 후에 사용하였다. 유도되지 않은 세포의 경우 TSB에서 배양 후 동일한 방법으로 균체를 수확하고 세척하여 사용하였다.

[분해경로의 파악]

파이렌의 대사산물의 추적은 분해연구에 있어서 생리학적 또는 효소학적연구의 기본이 될 수 있으며 파이렌이 분해되어 CO₂까지의 단계를 추적함으로써 파이렌 분해도를 증가시킬 수 있는 방안을 제시할 수도 있다. 뿐만 아니라 PAH 분해시 그 자체의 독성뿐만 아니라 그 대사산물이 DNA와 반응하여 강한 돌연변이 원이나 발암물질화 될 수 있기 때문에 반드시 파악되어야 한다(AAFP,1993). 현재까지 알려진 파이렌의 분해경로는 마이코박테리움 에스피.가 파이렌 시스-4,5-디하이드로다이올-시스-4,5-디하이드로다이올(pyrene cis-4,5-dihydrodiol), 4-하이드록시페리나프텐온(4-hydroxyperinaphthenone), 4-페난트로인산(4-phenanthroic acid), 프탈산(phthalic acid), 시나민산(cinnamic acid)으로 분해된다는 것(Heitakemp 등, 1988)과 로도코쿠스 에스피.(Rhodococcussp.)가 마이코박테리움 에스피.(Mycobacteriumsp.)와는 다른 1,2 그리고 4,5-디하이드록시파이렌(dihydroxypyrene), 시스-2-하이드록시-3-(페리나프텐온-9-일)프로페닌산(cis-2-hydroxy-3-(perinaphthenone-9-yl)propenic acid) 그리고 2-하이드록시-2(페난트렌-5-원-4-에닐)아세트산( 2-hydroxy-2(phenanthrene-5-one-4-enyl)acetic acid)으로 분해된다는 것이다(Walter 등,1991). 분리한 균에 의한 파이렌 분해시 대사산물의 분석은 Heitakamp 등(1988)의 방법으로 수행하였다.

[파이렌의 다른 PAH와의 경쟁적 분해]

일반적으로 PAH의 오염은 단일 물질의 오염이 아니고 여러 종류의 PAH가 복합적으로 혼합되어 있는 상태에서 오염이 된다. 따라서 페난트렌과 같은 저분자 PAH(3-링 이하)를 보조기질(co-substrate)로 첨가하여 파이렌 분해의동력학(kinetics)을 알아봄으로써 분리된 균주가 PAH의 혼합상태에서 상대적으로 난분해도가 높은 파이렌의 제거효율을 알아보았다.

[실험실내 실험구내에서의 분해]

가로×세로×높이가 30×30×15㎝의 폴리에틸렌 박스(polyethylene box)를 이용하여 오염되지 않은 토양을 채취하여 만들었다. 기질인 파이렌의 양은 토양 ㎏당 300 ㎎의 비율로 첨가하고 분리된 균주를 10⁶/g으로 첨가하여 3일 간격으로 실험구 3곳의 토양을 1 g씩 채취하여 섞은 후 잔존하는 파이렌을 분석하였다. 이때 토양의 pH, 입도분석, 토양의 함수율과 암모니아염 질소, 아질산염 질소, 질산염 질소는 토양분석방법(Methods of soil analysis)에 따라 시행하였다.

상기의 실험에 대하여 아래와 같은 결과를 얻었다.

1. 균주의 분리

분리된 C2-3 균주는 파이렌이 도포된 최소 고체배지 위에서 1 주일 배양 후에 뚜렷한 분해환을 관찰할 수 있었다(도 1). 균주 C2-3은 그람양성이며, 16S rRNA 서열분석 결과 총 1,474bp의 염기서열을 분석하였다. 결정된 1,474bp의 서열을 GenBank의 데이터베이스와 비교하여본 결과 C2-3은 마이코박테리움 에스피.로 동정되었다. C2-3과 가장 일치하는 염기서열을 가진 균주는 마이코박테리움 길범(Mycobacterium gilvum)으로 1,428bp의 서열 중 1,421bp가 일치하였다.

현재까지 분리된 물질분해와 관련된 마이코박테리움 에스피.들과의 16S rRNA 염기서열을 비교 분석한 결과M.sp. BB1과 1,428bp의 중복 지역(overlab region)중 1,421bp가 일치하여 0.9950의 유사도를 나타내고 있다.M. sp. PAH135와는 1,451bp 중 1,423bp가 일치하여 0.9807의 유사도를 나타내고 있으며 3-링의 안트라센을 분해하는 것으로 알려진M. 안트라센(anthracene)과는 1,448bp중 1,404bp가 일치하여 가장 낮은 유사도인 0.9696을 나타내었다(표 1).

균 주	동 일 성	GenBank 접근 번호
M. sp. RJGⅡ135M. 클로로페놀리쿠스(PCP-1)M. sp. BB1M. 파라포르투이툼M. sp. PAH135M. sp. RF002M. 안트라세니쿰M. sp. WF2M. sp. GP1M. sp. CH1	1452/1478(0.9824)1452/1478(0.9824)1421/1428(0.9950)1435/1456(0.9855)1423/1451(0.9807)1405/1432(0.9811)1404/1448(0.9696)1261/1276(0.9882)1273/1298(0.9807)1294/1331(0.9722)	U30661X79094X81996X93183X84978U90876Y15709U90877AJ012626AF054278

표 1은 알려진 방향족 분해 균주 마이크로박테리움 sp.와 16S rRNA 서열의 비교한 것이다.

마이코박테리움 에스피.(Mycobacteriumsp.) C2-3의 배양최적 온도는 TSB에서 27 ℃로써 37 ℃와 44 ℃에서는 유의할만한 성장을 나타내지 못하였다(도 2). 또한 고체 배지 상에서도 27 ℃에서 7 일 안에 육안으로 관찰할 수 있을 만한 콜로니를 생성하였으며 콜로니의 모양은 중간 크기(medium size), smooth, shiny의 특성을 나타내고 있으며, 색깔은 노란색을 띠고 있으며, 배양시간이 길어질수록 진한노랑으로 변화하였다.

마이코박테리움 에스피.(Mycobacteriumsp.) C2-3이 분해할 수 있는 탄화수소는 표 2와 같다. 흥미로운 것은 파이렌, 플루오르안센과 같은 고분자량의 PAH를분해할 수 있음에도 불구하고 나프탈렌과 같은 저분자량의 PAH를 분해하지 못하였다. 반면에 헥사데칸 및 헵타데칸과 같은 노말-알칸(n-alkane)은 비교적 잘 분해하는 것으로 나타났다(표 2).

화 합 물	분 해 율
나프탈렌플루오렌페난트렌플루오르안센파이렌n-알칸	－＋(착색 안됨)＋＋＋(노란색)＋＋(붉은색)＋＋＋(엷은 노란색)＋＋

표 2는 분리된 균주에 의한 방향족 화합물 분해 정도를 나타낸 표이다.

(＋ : 약함, ＋＋ : 우수함, ＋＋＋ : 매우 우수함, 최소 배지 방법에 대하여 분사하여 분석함).

페난트렌, 플루오르안센과 파이렌을 도포한 배지에서는 분해산물로 추정되는 각각 노란색, 빨간색, 흐린 노란색의 색깔을 가진 물질이 콜로니 주위로 확산되는 것을 관찰할 수 있었다.

자연환경에서 오염물질의 제거가 되어져야 하는 이유는 자체의 독성으로 기인하는 경우가 많다. 따라서 PAH를 분해하는 미생물일지라도 PAH의 농도에 의해 억제될 수 있다. M. sp. C2-3은 250 ppm까지는 14일 배양 동안 주어진 대부분의 파이렌을 분해하였다. 그러나 500 ppm의 경우 약 45 정도를 분해하였고 28 일째에도 약 80 정도의 파이렌을 분해하였다. 또한 1000 ppm의 기질을 첨가하였을 때는 유의할만한 수준의 분해능을 나타내지 못하였다(도 3).

페난트렌의 경우에는 파이렌과는 달리 독성이 상대적으로 덜한 것으로 알려져 있다.M. sp. C2-3은 250 ppm까지는 7 일 안에 거의 모든 페난트렌을 분해하였다. 그러나 500 ppm의 경우, 7 일 배양에 약 50 , 14 일 배양에 70 를 분해하였다. 이는 파이렌과 14 일 배양시를 비교하여 보면, 파이렌은 약 45 를 분해한 반면 페난트렌은 약 70 를 분해하였고, 1000 ppm에서도 약 23 를 분해하였다(도 4). 이는 본 실험에 사용된M. sp. C2-3은 파이렌이 페난트렌보다도 동일시간, 동일농도에서 훨씬 분해도가 낮다는 것을 알 수 있다.

TSB에서 배양한 후 페난트렌, 플루오르안센(fluoranthene), 파이렌이 50 ppm 들어 있는 최소액체배지로 다시 접종하여 1주일간 배양하여 각 PAH를 분해하는 효소를 유도한 후 각 PAH가 300 ppm 들어 있는 최소액체배지에 다시 접종하여 그 분해도를 측정한 결과, 페난트렌의 경우(도 5), 플루오르안센(fluoranthene)과 파이렌에서 유도시킨 실험군이 24 시간부터 급격히 분해도가 증가하는 양상을 보여주고 있다. 그런데 유산균 배양액에서 유도시킨 실험군의 경우 48 시간이 지난 후부터 분해도가 증가하는 양상을 보여주고 있다. TSB에서 배양한 대조군은 88 시간이 지난 후에 분해도가 증가하였다. 이는 유산균 배양액 분해에 관여하는 효소의 유도는 유산균 배양액에 의해 유도되지만, 파이렌이나 플루오르안센(fluoranthene)과 같은 고분자량의 PAH에 의해서도 유도가 되는 것을 확인할 수 있었다.

파이렌의 경우 파이렌에서 유도시킨 실험군이 24 시간의 유도 기간(lag time) 경과 후부터 분해도가 급격하게 증가하는 양상을 보이고 있다(도 7). 그러나 유산균 배양액에서 유도시킨 실험군은 TSB에서 유도시킨 대조군과 동일한 양상을 나타내고 있다. 이는 파이렌을 분해하는 효소는 유산균 배양액에 의해 전혀 유도되지 않는 것을 의미하며 파이렌에서 유도시킨 경우 유산균 배양액의 분해가 유도되는 것으로 보아Mycobacteriumsp. C2-3의 분해경로는 파이렌 분해과정 중 유산균 배양액 분해과정이 포함되는 것으로 생각된다.

M. sp. C2-3의 파이렌 분해에 있어서 부식산(humic acid)의 영향은 도 8과 같다. 대조군에 비하여 500 ppm과 1000 ppm의 부식산을 처리하였을 때 분해도의 증가가 나타났다. 부식산이 첨가된 실험군에서 배양 2 일째에 이미 약 68 정도의 분해가 이루어졌고 3 일이 지나면서 거의 모든 파이렌이 배지에서 제거되었다.

탄화수소의 분해도를 증가시키는 방법 중의 하나가 계면활성제의 첨가이다. 따라서 계면활성제의 첨가가M. sp. C2-3의 파이렌 분해에 미치는 영향을 알아보기 위해 트리톤(Triton) X-100(일본 준세이화학사 제조), 트윈(Tween) 80(미국 sigma사 제조), SDS(미국 sigma사 제조)로 처리하였다(도 9). 트윈(Tween) 80이 처리된 실험군에서 2 일 배양에 50 정도의 분해능을 보였고, 3 일 후에 더해준 파이렌이 95 이상이 분해되었다. SDS의 경우에는 트윈(Tween) 80 보다는 분해도가 다소 낮은 약 30 정도의 분해도를 보이고 4일 배양 후에 95 이상의 파이렌을 분해하였다. 그러나 트리톤(Triton) X-100은 분해능을 전혀 나타내지 못했다.

이들 계면활성제가M. sp. C2-3의 세포성장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 포도당을 탄소원으로 제공한 최소배지에 각각의 계면활성제를 첨가하고 성장도를 측정한 결과 트윈(Tween) 80과 SDS는 세포의 성장을 촉진하였으나(도 10) 트리톤(Triton) X-100의 경우에는 완벽하게 억제하였다. 이는 트윈(Tween) 80이나 SDS의 경우 탄소원으로 이용된다기보다는 보조인자(cofactor)로써 작용하는 것으로 사료되며 파이렌 분해시 분해도를 증가시킨 이유는 이들 계면활성제가 보조인자로써의 작용과 파이렌의 용해도를 증가시켜 분해도를 높인 것으로 생각된다. 그러나 트리톤(Triton) X-100의 경우에는M. sp. C2-3의 성장 자체에 독성을 갖는 것으로 판단된다.

본 발명에서 분리된 파이렌 분해세균은Mycobacteriumsp.로 동정되었다.Mycobacteriumsp.는 자연환경에 널리 존재하는 미생물(Barksdale 과 Kim, 1977)로 노말-부탄(n-butane)과 2-부탄온(2-butanone) (Phillipa 와 Perry, 1974), 기체성 불포화 탄화수소(Debont, 등. 1980), 사이클로파라핀 탄화수소(cycloparaffinic hydrocarbons)(Beam과 Perry, 1974), 노말-알킬이 치환된 사이클로파라핀(n-alkyl-substituted cycloparaffins)(Beam과 Perry, 1974), 메틸 케톤(methyl ketone)(Beam과 Perry, 1974), 지방족 탄화수소(Hou, 1982)등을 분해한다.

지난 20여 년간 3-링 이상의 PAH를 분해하는 세균이 분리되어 왔으나, 이러한 미생물 중에서 4-링 PAH를 계면활성제나 보조인자가 없는 조건에서 분해하는 미생물은 거의 없었다. 기존에 많은 연구가 진행된Mycobacteriumsp. PYR-1과Mycobacteriumsp. RJGII-135 균주는 파이렌 분해시 모두 보조인자를 요구한다. 최근 들어Mycobacteriumsp. CH1이 보조인자가 없는 조건에서 파이렌을 분해한다고 보고되었다(Churchill 등, 1999). 이 CH1 균주는 본 실험의 C2-3과 PAH 분해의 특성이 나프탈렌을 분해하지 못한다는 점, 그리고 노말-알칸을 분해한다는 점, 그리고 4-링 분해시 보조인자나 계면활성제를 요구하지 않는다는 점에서 매우 유사하다. 그러나 표 2에서 보듯이 16S rRNA의 서열은 1,331bp중 1,294bp가 일치하여 0.9722로 일치도가 매우 낮다. 또 CH1 균주는 PAH분해에 있어서 가장 많은 연구가 수행되어진 nah 유전자 조사(gene probe)를 이용한 혼성화(hybridization) 결과 nah 조사에 반응하지 않아 CH1 균주가 PAH 분해 시 나프탈렌 탈산소화 효소 시스템(naphthalene dioxygenase system)이 아닌 다른 시스템이 존재할 것이라고 암시하였다. 이는 C2-3이 3-링 이상의 PAH는 분해하면서 나프탈렌을 분해하지 못하는 점을 간접적으로 설명할 수 있을 것으로 생각된다.

Claims

기탁 번호 KCTC9875P호인 3-링 이상을 갖는 다환식 방향족 탄화수소의 분해능을 가진 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 에스피.(Mycobacterium sp.) C2-3.
제 1항에 있어서,

상기 3-링 이상을 갖는 다환식 방향족 탄화수소가 파이렌(Pyrene), 페난트렌(Phenanthrene) 및 플루오르안센(Fluoranthene)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 마이코박테리움 에스피.(Mycobacterium sp.) C2-3.
제 1항에 있어서,

상기 마이코박테리움 에스피. C2-3이 노말-알칸(n-alkane)의 분해능을 가진 것인 마이코박테리움 에스피. C2-3.
기탁번호 KCTC8975P호인 마이코박테리움 에스피. (Mycobacterium sp.) C2-3을 활성 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 유류 분해 조성물.
제 4항에 있어서,

상기 조성물이 계면 활성제를 더욱 포함하는 유류 분해 조성물.
제 4항에 있어서,

상기 조성물이 부식산(humic acid)을 더욱 포함하는 유류 분해 조성물.
a) 기름으로 오염된 토양에서 시료를 채취하고,

b) 채집된 시료를 파이렌이 유일 탄소원으로 들어있는 최소 배지에 첨가하여 실온에서 1 주일 이상 배양하고,

c) 상기 배양액을 상기 b)의 배양 조건과 동일한 조건의 새로운 배지로 접종하는 농축 배양을 하고 C2-3 균주를 분리한 후,

d) 상기 c)에서 분리된 C2-3 균주를 파이렌이 도포된 최소 고체 배지위에서 1 주일 이상 배양하고,

e) 마이크로박테리움 에스피.(Mycobacterium sp.)로 동정하는 것을 특징으로 하는 마이코박테리움 에스피.(Mycobacterium sp.) C2-3의 제조 방법.