KR100449567B1 - 오염물질 분해효소 발현촉진용 가속영양제의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 토양의 오염물질분해를 촉진하기 위하여 특정물질에 오염된 주변에 서식하는 오염물질 분해능력을 가진 미생물을 포함하는 액상미생물제제중의 미생물 또는 토착미생물 또는 외래 미생물의 활동성을 촉진하기 위한 오염물질 분해효소들의 발현을 촉진하는 가속영양제의 제조방법에 관한 것이다.

상기한 본 발명에 의하여 오염토양, 특히 유류에 의하여 오염된 토양의 생물학적 정화를 위하여 특정 분해미생물균주를 고속 배양, 제제화하여 적용하고 외래 미생물 또는 토착미생물의 성장을 촉진하는 가속영양제와 오염물질의 분해에 직접 관여하는 효소들의 발현을 촉진하는 가속영양제를 사용함으로써 오염된 토양의 정화시간을 획기적으로 단축시킬 수 있고 결과적으로 오염된 토양의 정화비용을 대폭적으로 절감할 수 있는 특징이 있다.

Description

오염물질 분해효소 발현촉진용 가속영양제의 제조방법{Method for preparing accelated medicines for promoting nutrition for reducing contaminated soil}

본 발명은 토양의 오염물질분해를 촉진하기 위하여 특정물질에 오염된 주변에 서식하는 오염물질 분해능력을 가진 미생물을 포함하는 액상미생물제제중의 미생물 또는 토착미생물 또는 외래 미생물의 활동성을 촉진하기 위한 오염물질 분해효소들의 발현을 촉진하는 가속영양제의 제조방법에 관한 것이다.

급격한 산업화로 인하여 화석연료의 사용량 증가, 오염물질 배출량의 급증, 대도시로의 인구집중, 무리한 개발계획에 따른 자연파괴로 인한 심각한 환경오염에 직면해 있다. 이러한 환경오염은 대기나 물 등을 매개체로 하여 인간의 생활에 신속하고도 직접적인 영향을 미칠뿐만 아니라 토양과 지하수를 통하여 오랜 기간동안 느린 속도로 노출되기도 한다. 특히 과거 유해물질의 부적절한 폐기, 노후시설의 파손, 갑작스런 환경사고 등에 따른 토양의 오염은 광범위한 오염범위, 막대한 처리비용 등으로 인해 오래동안 방치되어 왔다.

토양오염을 야기하는 오염물질은 경유, 디젤유, 중유, 윤활유 등의 유류와 클로로페놀, 폴리클로리네이티드비페닐, 다환방향족탄화수소, 중금속 등이 될 수 있으며, 이중에서 탄화수소를 근간으로 하는 유기화합물은 특정 분해미생물의 탄소원 및 에너지원으로 사용됨으로써 별도의 환경오염없이 생분해(Biodegradation)가 가능한 특성을 가지고 있다.

생분해(Biodegradation)란 자연 생태계의 특정 미생물등이 적절한 조건하에서 유해오염물질을 분해하여 무해화 또는 영양원으로 사용하는 현상이며, 미생물의 이러한 기능을 이용하여 토양, 지하수, 해양, 하천등 오염된 지역을 정화하는 종합적인 엔지니어링 기술을 생물학적 복원기술(Bioremediation)이라 한다. 생물학적복원기술이 효율적일 경우 최종산물은 물이나 이산화탄소와 같이 무해한 물질로 변화되어 환경이나 생물에 아무런 해를 주지 않아야 한다. 이러한 생물학적 복원기술은 경제적이면서도, 자연의 정화능력을 이용함으로 해서 2차적인 오염원이 없는 장점이 있어 최근 각광받고 있는 기술이다.

생물학적 복원기술(Bioremediation)은 오염지역에 자연적인 분해를 가속화하기 위해서 외부기술을 적용하느냐의 여부에 따라 크게 능동적 복원과 수동적 복원으로 분류할 수 있다. 능동적 복원기술은 기술의 적용형태에 따라 편의상 현장에서 그대로 처리하는 부지내 기술과 오염 매개물을 현장외부로 이동하여 기술을 적용하는 부지외 기술로 분류할 수 있다.

예를 들어서, 토양경작기술(landfarming)은 지표부근의 오염된 토양에 대해 현장에서 그대로 적용될 수 있는 기술이다. 미생물의 성장을 촉진하기 위해 질소와 인을 포함한 영양분과 물을 첨가하여 수분조절을 하고 pH를 조절하기 위해 석회를 사용한다. 그리고 산소공급을 원활히 하기 위해서는 주기적으로 뒤집기를 실시하는 방식을 이용하고 있다. 또한 토양경작기술에 오염토양 내에 이미 존재하는 미생물을 그대로 이용하면서 이러한 미생물의 활성을 촉진하는 미생물촉진법(Biostimulation)이 적용되기도 하고, 특정 오염물질에 대한 분해능이 우수한 외래미생물을 첨가하는 미생물투입법(Bioaugmentation)이 적용되기도 한다. 토양경작 기술은 다른 방식에 의해 처리된 토양의 후처리로 사용될 수 있으며 처리비용이 가장 저렴하다는 큰 장점을 가지고 있다. 그러나, 처리시간이 길고 분해속도가 느리다는 단점이 있다.

이러한 생물학적 복원기술이 성공하기 위해서는 즉, 미생물이 토양내의 오염물질을 효과적으로 분해하기 위해서는, 미생물의 성장에 필요한 영양분의 존재, 산소와 같은 전자수용체의 존재, 탄소원과 에너지원이 되는 오염물질의 전달, 오염물질을 분해할 수 있는 효소(Enzyme)의 활성화 등의 여러 조건이 만족되어야만 한다. 이를 해결하기 위하여, 토양내에 부족할 수 있는 질소와 인을 포함하는 비료를 투입하기도 하며, 토양 뒤집기와 같은 물리적 산소공급 또는 과산화수소와 같은 산소유발물질을 투입하기도 하며, 오염물질의 전달을 촉진하기 위하여 계면활성제를 투입하기도 한다. 오염물질의 생화학적 분해는 여러 단계를 거치게 되어 최종적으로 이산화탄소와 물, 그리고 미생물 생체로 변화하게 되며, 각 단계마다 필요한 효소가 적절하게 활성화되어야만 한다. 특히, 오염물질의 안정화된 화학구조를 깰 수 있는 초기반응이 전체 분해속도를 결정하는 단계라고 알려져 있으며, 이에 관여하는 효소의 활성화가 중요한 요소가 된다.

그러나, 기존의 생물학적 복원기술은 미생물의 일차적 대사만을 고려하여 기본 영양물질을 투입하거나, 분해 미생물 그 자체를 투입하는 방식을 사용하고 있어, 분해속도가 매우 느려 전체 처리속도가 수개월에서 수년이 걸리는 단점이 있었다. 그 결과, 투입된 외래 미생물이 현장토양 환경에 적응하지 못하고 소멸되어 무용화된 경우가 많으며, 미생물 성장이 원활하더라도 정작 오염된 물질의 분해는 매우 느린 경우가 많아서 신속한 토양오염을 해소하지 못하는 등의 문제점이 있었다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 오염된 토양내에 존재하는 오염물질 분해능력을 가진 미생물을 신속하게 배양할 수 있는 액상미생물제제 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 토양의 오염물질을 신속하게 분해, 제거할 수 있도록 토양에 내재된 미생물의 활동을 촉진시키는 가속영양제의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 토양내 오염물질의 분해를 가속화하기 위한 수단으로 강력한 분해 균주인 외래 미생물의 조합을 적절히 투입함으로써 분해현상을 극대화하는 생물학적 정화방법을 제공하는데 있다.

도 1은 액상시료에서 본 발명의 가속영양제 AN1의 첨가에 따른 페난트렌 분해율의 변화상태를 나타내는 그라프,

도 2는 액상시료에서 본 발명의 가속영양제 AN1의 첨가에 따른 미생물수 증가상태를 나타내는 그라프,

도 3은 액상시료에서 본 발명의 가속영양제 AN2의 첨가에 따른 페난트렌 분해율의 변화상태를 나타내는 그라프,

도 4는 액상시료에서 본 발명의 가속영양제 AN2의 첨가에 따른 미생물수 증가상태를 나타내는 그라프,

도 5는 고농도 오염 토양시료에서 본 발명의 가속영양제 AN2 투입에 따른 분해율의 변화상태를 나타내는 그라프.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 액상미생물제제의 제조방법은, 오염된 토양 및 주변토양의 지표면으로부터 0~30cm 정도 하부의 토양 100~500g을 채취하는 제1단계; 암모늄클로라이드 2~7g, 소듐포스페이트 1~3g, 이디티에이 0.2~0.6g, 칼륨클로라이드 0.3~0.5g, 소듐설페이트 0.2~0.4g, 마그네슘설페이트 0.2~0.4g, 및 미네랄용액 5~10ml을 포함하는 조성물을 증류수 1L에 첨가하여 일반 미생물 배양용 배지를 생성하는 제2단계; 상기 제2단계에서 생성된 미생물 배양용 배지 100mL에 상기 제1단계에서 채취된 토양 5~50g을 넣고 10∼14시간, 바람직하게는 12시간동안 진탕배양한 후 약 1시간동안 침강시켜 상등액 50~100mL를 취하는 제3단계; 상기 제3단계에서 취한 상등액에 탄소원이 되는 오염물질을 100~10000ppm의 농도로 투여하고 25∼35℃, 바람직하게는 약 30℃에서 분당 100∼200rpm, 바람직하게는 150rpm으로 일주일간 배양한 후 10mL를 취하여 총 100mL 배지에 동일한 방법으로 1회 더 배양하는 제4단계; 상기 제4단계에서 배양된 배양액의 전부 또는 일부를 취하여 100~10000배 희석하고 멸균상태에서 뉴트리언트 한천배지에 도말하는 제5단계; 상기 제5단계에서 배양된 배양액을 7일간 배양 후 한천배지에 나타난 콜로니를 각각 분리하여 순수배양한 후, 원심분리하고, 냉동건조하여 -60∼-80℃, 바람직하게는 약 -70℃에서 보관하는 제6단계; 및 상기 제6단계에서 냉동보관된 미생물 균주를 상기 제2단계에서 조성된 일반 미생물 배양용 배지에 포도당 5~10g/L를 추가로 첨가한 배지에 넣고 멸균상태에서 이틀동안 진탕배양하는 제7단계를 포함한다.

또한 상기 액상미생물제제의 미생물 또는 토착미생물 또는 외래 미생물의 균체성장과 현장 적응성을 극대화하기 위한 가속영양제1(AN1)의 농축액 제조방법은, 포도당 3.0∼5.0g, 아세테이트 1.0∼3.0g, 뉴트리언트 1.0∼5.0g, 에탄올 1g/L, 트윈(tween) 80 1∼1.5g/L, 및 근토양추출액 50ml의 조성물을 증류수 100ml에 첨가하여 녹인 용액을 준비하는 제1단계; 야산의 나무뿌리 밑 10∼30cm 부위의 토양 30g을 에탄올 1∼3g/L, 바람직하게는 2g/L와, 트윈 80 1∼10g/L, 바람직하게는 3g/L를 증류수 100mL에 첨가하고 약 2시간동안 200∼400rpm, 바람직하게는 300rpm에서 야산 근토양을 추출하고 약 10분동안 2000∼4000rpm, 바람직하게는 약 3000rpm에서 원심분리하여 상등액을 준비하는 제2단계; 및 상기 제1단계에서 준비된 용액과 상기 제2단계에서 준비된 상등액을 혼합한 후 0.2 um 필터를 통과시키서 용액을 조성하는 제3단계를 포함한다.

또한 본 발명의 방향족탄화수소의 분해효소 발현을 극대화하기 위한 가속영양제2(AN2)의 농축액 제조방법은, 카테콜 0.2∼1.0g과, 뮤코익산 0.025∼0.5g과, 하이드록시나프토익산 0.1∼0.5g과, 살리실산 0.02∼1g과, 폴릭산 0.1∼0.3g과, 비타민 B농축액 1.0ml 조성물을 준비하는 제1단계; 및 상기 제1단계에서 준비된 조성물을 에탄올 0.1%의 증류수 100ml에 첨가하여 녹인 용액을 0.2um 필터를 통과시켜 용액을 조성하는 제2단계를 포함한다.

이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

토양의 오염물질분해를 촉진하기 위하여 특정물질에 오염된 주변에 서식하는 오염물질 분해능력을 가진 미생물을 포함하는 액상미생물제제중의 미생물 또는 토착미생물 또는 외래 미생물의 활동성을 촉진하기 위한 오염물질 분해효소들의 발현을 촉진하는 가속영양제의 제조방법에 관한 것이다. 이것은 본질적으로 자연에 존재하는 토착 또는 외래 미생물중에서 특정 오염물질의 분해능력을 가진 미생물을 고속으로 배양하고, 분해능력을 촉진시킴으로서 별도의 환경오염없이 오염물질을 제거할 수 있는 환경친화적인 정화방법이다.

본 발명에 의한 액상미생물제제는, 오염된 토양에 서식하는 토착미생물중에서 오염물질의 제거능력을 보유하는 미생물을 토양으로부터 분리하고, 이것을 이용하여 액상미생물제제를 제조하여 달성된다.

상기와 같은 액상미생물제제의 제조방법은, 먼저, 제1단계로서, 유류 또는 오염물질에 의하여 오염된 토양 및 주변토양의 지표면으로부터 0∼30cm 정도 아래의 토양 100~500g을 채취한다. 토양은 균일하게 혼합될 수 있도록 교반시킨다. 토양의 채취는 특히 오염물질에 의하여 오염정도가 심한 부분에 대하여 수행하는 것이 바람직하다.

상기와 같이 토양을 채취한 후에는, 제2단계로서, 하기의 표 1에 표시된 것과 같은 성분 및 함량을 포함하는 조성물을 준비하였다가 수용액으로서의 증류수 1L에 첨가하여 일반 미생물 배양용 배지를 조성한다.

구 분	성 분	함 량
1	암모늄클로라이드 (NH4Cl)	2.0∼7.0g
2	소듐포스페이트 (NaH2PO4)	1.0∼3.0g
3	이디티에이 (EDTA)	0.2∼0.6g
4	칼륨클로라이드 (KCl)	0.3∼0.5g
5	소듐설페이트 (Na2SO4)	0.2∼0.4g
6	마그네슘설페이트 (MgSO47H2O)	0.2∼0.4g
7	미네랄용액 (Mineral solution)	5∼10ml

제3단계로서, 상기 제2단계에서 배양된 일반 미생물 배양용 배지 100mL에 채취한 토양 10g을 넣고 10∼14시간, 바람직하게는 12시간동안 진탕배양한 후 약 1시간 정도 침강시켜 상등액 75mL를 취한다.

그 후에 상기 상등액 용액에 탄소원이 되는 오염물질을 100~10000ppm의 농도로 투여하고 약 25~35, 바람직하게는 30℃에서 분당 150 rpm 정도로 일주일간 2회 배양한다.

상기와 같이 배양된 배양액중의 전부 또는 일부를 취하여 100~10000배 희석하고 멸균상태에서 뉴트리언트 한천배지에 도말한다.

상기 배양액을 7일간 배양한 후 뉴트리언트 한천배지에 나타난 콜로니를 각각 분리하여 순수배양한 후, 원심분리하고, 냉동건조하여 -60∼-80℃, 바람직하게는 -70℃ 정도에서 보관한다. 상기와 같이 보관된 미생물 균주를 각각 표 1에 기초하여 조성된 일반 미생물 배양용 배지에 포도당 1중량%(10g/L)를 추가로 첨가한 배지에 넣고 멸균상태에서 이틀동안 진탕배양하여 액상미생물제제의 제조를 완료한다. 상기와 같이 제조된 액상미생물제제는 오염된 토양에 직접 도포하거나 일정한 깊이의 지표하부면에 도포하여 오염물질을 제거하는데 사용된다. 상기와 같이 제조된 액상미생물제제의 오염물질 분해능력이 후에 도면을 참고하여 설명된다.

또한 상기 액상미생물제제 또는 토착미생물 또는 외래 미생물의 균체성장과 현장 적응성을 극대화하기 위한 가속영양제1(AN1)의 농축액 제조방법은, 먼저 제1단계로서 포도당 3.0∼5.0g, 아세테이트 1.0∼3.0g, 뉴트리언트 1.0∼5.0g, 에탄올 0.1중량%(1g/L), 트윈(tween) 80 0.1∼0.15중량%(1∼1.5g/L), 및 근토양추출액 50ml의 조성물을 증류수 100ml에 첨가하여 녹인 용액을 준비한다. 상기한 가속영양제1(AN1)에 사용되는 조성물의 성분이 하기의 표 2에 표시되어 있다.

구 분	성 분	함 량
1	포도당 (Glucose)	3.0∼5.0g
2	아세테이트 (Acetate)	1.0∼3.0g
3	뉴트리언트 (Nutrient broth)	1.0∼5.0g
4	에탄올 (Ethanol)	0.1중량%
5	트윈 80 (Tween 80)	0.1∼1.0중량%
6	근토양 추출액 (Soil extract)	50ml

상기와 같이 용액이 준비된 후에 제2단계로서 야산 근토양 30g을 에탄올 0.1∼0.3중량%(1∼3g/L), 바람직하게는 0.2중량%(2g/L)와 트윈 80 0.1∼1중량%(1∼10g/L), 바람직하게는 0.3중량%(3g/L)의 증류수 100mL에 첨가하고 약 2시간동안 약 300 rpm에서 추출하고 10분동안 3000rpm에서 원심분리하여 상등액을 준비한다. 야산근토양을 구체적으로 나무뿌리 밑 10∼30cm 정도 부위의 토양을의미한다. 상기 제1단계 및 제2단계의 순서를 바뀌어도 가속영양제의 제조에는 지장이 없다.

제3단계로서, 상기 제1단계에서 준비된 용액과 상기 제2단계에서 준비된 상등액을 혼합한 후 0.2um 필터를 통과시키서 용액을 조성하여 가속영양제(AN1)을 제조한다. 상기와 같이 제조된 가속영양제는 단독으로 오염된 토양에 투입되어서 토착미생물 또는 외래 미생물의 생장을 촉진시키깅 위한 보조제 또는 상기의 액상미생물제제에 보조제로서 사용될 수 있다.

또한 방향족탄화수소의 분해효소의 발현을 극대화하기 위한 본 발명의 가속영양제2(AN2)의 농축액 제조방법은, 제1단계로서 카테콜 0.2∼1.0g과, 뮤코익산 0.025∼0.5g과, 하이드록시나프토익산 0.1∼0.5g과, 살리실산 0.02∼1.0g과, 폴릭산 0.1∼0.3g과, 비타민 B농축액 1.0ml 조성물을 준비하고, 준비된 조성물을 제2단계로서, 에탄올 0.1%의 증류수 100ml에 첨가하여 녹인 용액을 0.2um 필터를 통과시켜 제조를 완료한다. 상기 조성물의 성분이 하기 표 3에 표시되어 있다.

구 분	성 분	함 량
1	카테콜 (Catechol)	0.2∼1.0g
2	뮤코익산 (Mucoic acid)	0.025∼0.5g
3	하이드록시나프토익산(1-hydroxy-2-naphtoic acid)	0.1∼0.5g
4	살리실산 (Salicylic acid)	0.02∼1.0g
5	폴릭산 (Folic acid)	0.1∼0.3g
6	비타민 B 농축액 (Vitamin B solution)	1.0ml

상기와 같이 제조된 본 발명의 액상미생물제제의 생분해도를 조사하기 위하여 액상시료와 토양시료를 다음과 같이 준비하였다.

액상시료는 탄소원이 제거된 미생물 배지에 트리톤 X-100을 0.3% 첨가한 후,분말 페난트렌 10~100mg/L의 농도로 첨가하여 완전히 녹이고 멸균한 배지 50~100mL를 125~250mL 삼각플라스크에 준비하였다. 토양시료는 미세분말 형태의 균일한 실트 토양 1~10g에 페난트렌 0.03mg~1mg을 녹인 아세톤 1~10ml를 뿌리고 상온에서 건조시켜 만들었다.

오염된 액상시료 및/또는 오염된 토양시료에 본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 혼합 액상미생물제제를 0.1~1% 정도 첨가하고 상온에서 150rpm으로 7~21일간 처리하였다. 미생물의 분해효율을 측정하기 위하여 다음과 같은 조건하에서 실험을 수행하였다.

처리실험 중 샘플 1ml를 채취하여 페난트렌 분석에 활용하고 0.1ml를 채취하여 미생물 수 측정에 사용하였다. 페난트렌 분석시 토양 및 액상시료 1ml를 마개달린 15ml 유리시험관에 넣고 메틸렌클로라이드 10ml를 첨가하여 500~1000rpm에서 5분간 추출하고 이를 2회 반복한다. 추출액 메틸렌클로라이드 20ml를 40℃에서 휘발시키고, 잔류물을 아세토니트릴 1~10ml에 녹인 후 액체크로마토그래피를 이용하여 분석하였다. 시료 중 미생물은 100~10000배 증류수로 희석하여 뉴트리언트 한천배지에 도말하고 3일 및 7일 후 나타나는 콜로니의 수를 측정하였다.

상기와 같이 수행된 시험에 의한 액상 및 토양시료에서의 각각의 테스트 결과가 표 4에 나타나 있다. 이 시험에서는 또한 액상미생물제제에 더불어 가속영양제1, 2를 추가투입하고 결과를 각각 측정하였다.

구분	시료상태	미생물투입여부	가속영양제 AN1 투입여부	가속영양제 AN2투입여부	분해율 (%)
					2일후	7일후	14일후
A	액상	X	X	X	2.7	2.9	3.4
B	액상	O	X	X	2.3	4.5	7.2
C	액상	O	O	X	11.4	16.7	24.3
D	액상	O	O	O	47.2	65.8	84.3

액상시료상태는 각각 미생물투입여부, 가속영양제1, 가속영양제2의 투입여부에 따라서 A,B,C,D로 구분되어 있으며, 미생물투입여부가 X(미투입), O(투입)으로 표시되어 있다.

상기 표 4에 나타난 결과에서 보는 바와 같이, 액상 시료에서 어떠한 처리도 하지 않은 시료(A)에 비해 미생물 제제를 투입한 결과 시간이 경과할 수 록 분해율이 증가하여 약 2배의 분해효율을 보여주었다. 시료 C와 같이 미생물 제제에 가속화 영양제 AN1을 추가로 첨가하였을 경우 분해효율은 7배로 증가하고, AN2를 첨가하였을 경우는 더욱 증가하여 25배 증가하였다.

이러한 분해율의 변화상태를 도면을 참고하면, 도 1에서 보는 바와 같이 가속화 영양제 AN1 첨가량을 증가시킬수록 분해정도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 도 2에서 보는 바와 같이 미생물 생균 수는 가속영양제 AN1의 첨가량을 증가시킬수록 월등하게 증가하는 것을 확인하였다. 또한 도 3에서는 가속화 영양제 AN2의 첨가량이 증가할수록 분해도가 월등하게 증가하는 것을 볼 수 있다.

도 4와 도 2를 비교하면 도 2가 훨씬 많은 미생물의 수가 존재함에도 분해효율은 AN2 처리한 경우가 더욱 높았다. 분해율의 증가상태는 가속영양제 AN1보다 AN2가 월등히 효과적이었는데, 이는 단순한 미생물의 수 증가보다 오염물질을 분해하는 효소의 활성화가 오염물질의 분해에 더욱 큰 영향을 미침을 나타내는 것이다. 또한 상기에서 준비된 토양에 대한 미생물제제, 가속영양제1(AN1), 가속영양제2(AN2)의 투입에 따른 분해율이 하기의 표 5에 표시되어 있다. 이것에 의하면 토양시료에서는 액상시료에 비하여 전반적으로 분해효율이 증가하는 것을 알 수 있다.

구분	시료상태	미생물투입여부	가속영양제 AN1 투입여부	가속영양제 AN2투입여부	분해율 (%)
					2일후	7일후	14일후
E	토양	X	X	X	2.3	4.2	8.5
F	토양	O	X	X	11.3	100	-
G	토양	O	O	X	24.4	100	-
H	토양	O	O	O	94.5	100	-

즉, 미생물만 투입한 경우에도 액상시료에 비하여 분해효율이 급격하게 증가하였는데 이는 토양시료의 안정된 미생물막 형성과 기질 접근성이 순수 용액 시료보다 향상되었기 때문이다. 토양 시료에서도 마찬가지로 가속화 영양제를 첨가하였을 경우 분해효율은 월등하게 증가하였고, 특히 AN2를 첨가하였을 경우, 95% 분해하는 데 2일밖에 소요되지 않았다. 도 5에서 보는 바와 같이 10배 많은 고농도의 오염토양의 경우도 분해시간이 크게 증가하지 않았음을 알 수 있다.

또한 토착미생물 활용 테스트를 다음과 같이 수행하였다. 즉, 상기의 조건에 의한 오염된 토양시료 및 액상시료에 토착미생물을 함유하는 것으로 생각되는 일반 토양 추출물을 10% 첨가하고 분해도를 조사하였다.

표 6에서 보는 바와 같이 오염물질에 적응력이 없는 토착미생물도 가속영양제의 투입에 의해 상당히 빠른 분해속도를 보여 주었다. 이는 특수미생물이 토착미생물과의 경쟁에서 약화되는 경우에도 가속영양제의 투입으로 빠른 속도로 분해효소를 활성화시킬 수 있음을 보여주는 것이다.

구분	시료상태	특수미생물투입여부	가속영양제 AN1 투입여부	가속영양제 AN2투입여부	분해율 (%)
					2일후	7일후	14일후
D	액상	O	O	O	47.2	65.8	84.3
I	액상	X	O	O	5.7	46.4	64.5
H	토양	O	O	O	94.5	100	-
J	토양	X	O	O	27.8	77.0	85.7

또한 가속영양제를 투입하는 방법을 변경함으로서 더욱 효율적인 분해능력을 유도할 수 있었다. 즉, 도 3과 같이 액상시료에서는 가속영양제2 AN2가 급속하게 사용되고 어느 정도 시간이 지나면 분해현상이 매우 느려지게 되는데, 하기한 표 7에서 보는 바와 같이 주기적으로 가속영양제2 AN2를 첨가할 경우 분해활성이 계속 유지되어 전체적으로 분해시간을 효율적으로 단축시킬 수 있었다.

따라서 본 발명에서는 액상미생물제제와, 가속영양제1, 및 가속영양제2를 혼합하여 사용함으로서 종래 분해성능보다 현저하게 개선된 분해율을 얻을 수 있는 이점이 있다.

하기의 표 7에는 가속영양제 AN2의 투입주기를 변경함에 따른 분해율의 1일후, 2일후, 3일후, 7일후 측정결과가 표시되어 있다.

구분	가속영양제 AN2투입주기	분해율 (%)
		1일후	2일후	3일후	7일후
D	초기 1회	37.4	47.2	53.1	65.8
K	3일 1회	-	-	54.0	81.4
L	매일 1회	35.2	57.9	75.4	100

특히 분해효소 발현용 가속영양제가 오염토양 1Kg당 100∼500mL를 투여한 결과, 최적의 분해율을 보였다. 이것은 단독 사용 또는 다른 가속영양제와 액상미생물제제와의 혼합사용시에 모두 적용되는 결과를 가져온 것이 실험결과 나타났다. 또한 성장촉진용 가속영양제(AN1)도 또한 오염토양 Kg당 100∼500mL를 투여한 결과, 최적의 분해율을 보였다.

이와 같이 본 발명에 의하면 유류오염토양의 생물학적 정화에 있어 특정 분해균주를 고속 배양하여 제제화하여 적용하고 외래 미생물 또는 토착미생물의 성장을 촉진하는 가속영양제와 오염물질의 분해에 직접 관여하는 효소들의 발현을 촉진하는 가속영양제를 사용함으로써 정화시간을 획기적으로 단축시킬 수 있고 결과적으로는 정화비용을 대폭적으로 절감할 수 있다.

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3. 카테콜 0.2∼1.0g과, 뮤코익산 0.025∼0.5g과, 하이드록시나프토익산 0.1∼0.5g과, 살리실산 0.02∼1g과, 폴릭산 0.1∼0.3g과, 비타민 B농축액 1.0ml의 조성물을 준비하는 제1단계; 및 상기 제1단계에서 준비된 조성물을 에탄올 0.1중량%의 증류수 100ml에 첨가하여 녹인 용액을 0.2um 필터를 통과시켜 용액을 조성하는 제2단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 오염물질 분해효소 발현촉진용 가속영양제의 제조방법.
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