CN1169944C - 红平红球菌及其在脱除含硫化合物中硫元素的应用 - Google Patents

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rhodococcus
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Abstract

本发明的红平红球菌为Rhodococcus erythropolis LSSE8-1，2001年10月9日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCCNO.0643；其革兰氏染色阳性，部分抗酸，好氧；在葡萄糖天门冬素琼脂和营养琼脂上30℃插片培养14小时后，其菌丝从菌落中央开始断裂，24小时产生球状或杆状小体，72小时菌落周缘继续生长，无气生菌丝体，偶尔有分枝；对维生素B1无要求；含有内消旋二氨基庚二酸，有特征性的阿拉伯糖和半乳糖，细胞壁属于IV型，该红平红球菌含有诺卡氏枝菌酸；可有效地脱除含硫化合物中的硫的应用，所述的含硫化合物为有机含硫化合物或无机含硫化合物。

Description

红平红球菌及其在脱除含硫化合物中硫元素的应用
                           发明领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种红平红球菌及其在脱除含硫化合物中硫元素的应用。
                           背景技术
石油的主要元素组成是碳和氢，二者合计达96～99％，其余1～4％则是硫、氮、氧及微量金属元素。硫在石油中以无机硫和有机硫的形式存在。无机硫包括溶解和悬浮的单体硫，硫化氢和硫铁矿等，而有机硫包括各种硫醇，硫醚，二硫化物和噻吩及其衍生物。一般来说，有机含硫化合物中，噻吩类化合物是最丰富的。许多沸点较低的小分子含硫有机物比较容易通过简单的化学方法除去。因此，许多深度脱硫研究工作都用二苯并噻吩(DBT)作为石油中难脱除有机硫的模型化合物。
石油及其产品中的含硫所带来的问题是多方面的。第一，它们燃烧直接导致二氧化硫的生成，从而造成空气污染和酸雨，严重污染环境，破坏生态平衡，直接威胁着人类的生存空间。据有关报道，全世界每年排入大气的SO2近两亿吨，我国每年排入大气的SO2也达到了1795万吨。随着我国机动车保有量的不断增加，汽车尾气造成的空气污染越来越严重。1998年国际卫生组织公布的一项报告表明全球空气污染最严重的十大城市中，我国的太原、北京、乌鲁木齐、兰州、重庆、济南、石家庄七大城市榜上有名。同时我国酸雨面积不断扩大，1995年已扩大到华中、华南地区约100万平方公里，占国土面积的29％，酸雨威胁到73个城市，酸雨的年平均pH值已达5.6。其次，含硫有机化合物能严重地毒化石油精炼时的催化剂，导致产率降低。另外，含硫化合物的存在加重了石油精炼设备如贮存罐、运输管线等的腐蚀，增加了精炼成本。为了避免硫化物造成的危害，就必须想方设法地除了石油及其产品的硫化物。因此，世界发达国家都制定出严格的规定来控制石油产品中的硫含量。美国1990年就通过了清洁空气法的修正案，提出了使用新配方汽油的要求。欧洲议会1998年也立法要求2000年实施清洁汽油配方。2000年后，发达国家普遍要求将柴油的含硫量降到350ppm以下，汽油的含硫量降到50-100ppm以下，北美和欧洲国家要求到2005年汽油、柴油中硫含量要低于50ppm，2010年要低于30ppm甚至于10ppm。我国是一个发展中国家，SO2的排放量远远超过世界平均水平。为了落实国家的可持续发展战略，我国初步提出将目前柴油中硫含量从5000ppm降低到2000ppm以下，部分大城市车用柴油中硫含量低于500ppm。
常用的脱硫方法有还原脱硫法、氧化脱硫法和吸咐脱硫法。工业上广泛采用的方法是加氢还原脱硫法，即用氢气作为还原剂将原料中的硫还原成硫化氢的形式除去。加氢脱硫是一个需要催化剂的高温高压过程，因此它的耐温耐压设备投资昂贵，操作费用也高。虽然这种方法对脱除石油产品中许多含硫化合物中的硫是有效的，但对脱除有些含硫化合物，特别是较重馏分中的多芳硫杂环中的硫效果却不显著或很差。氧化脱硫法是用氧化剂将噻吩被氧化成相应的砜或亚砜，由于后者在油和水中的溶解度不同，可使含硫分子得到分离，从而达到脱硫的目的。但这些化学氧化过程都没有选择性，有许多副反应同时发生。
生物脱硫是利用微生物对硫源的特殊需要或代谢方式来实现硫脱除的方法。它反应条件温和，设备投资仅为加氢脱硫的30％，反应过程没有有害产物生成，可以实现深度脱硫，是一种具有广阔发展前途的技术。能够脱除有机硫化物的微生物既有厌氧菌也有好氧菌。例如Desulfovibrio desulfurcans M6能厌氧降解DBT，并主要产生联苯。但转化率低，速度慢。好氧性脱硫途径有两条，一条是以攻击C-C键为代表的“Kodama途径”，一条是以攻击“C-S”键为代表的“4S途径”。1973年，Kodama等人从环境中分离得到一株细菌，它能催化含硫杂环化合物二苯并噻吩发生氧化反应，使C-C键断裂(如图1)，通过这一途径，硫并没有真正从杂环化合物中脱除，但是因为其产物的水溶性所以使硫的脱除。1988年美国气体技术研究所(IGT)的Kilbane首次分离得到了能够选择性催化DBT类含硫化合物的C-S键的紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)IGTS8，它可以选择性地进攻DBT中的C-S键，而对其中的C--C键不起作用。这种代谢脱硫途径就是“4S途径”(如图2)。这一途径的优点是对底物的破坏作用很小，从而对其燃烧值的影响较小。现在国内外已发现了几十株能专一性脱硫的微生物，主要有Arthrobacter，Bacillus，Brevibacterium，Burkholderia，Corynebacterium，Gordona，Nocardia globerula，Paenibacillus，Pleurotus ostreatus，Pseudomonas，和Rhodococcus几种，其中以红球菌(Rhodococcus)最多，最具代表性，也最具有应用前景。例如日本Tottori大学生物技术系的红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)D-1菌株，美国宾夕法尼亚州王平(Ping Wang)等人的红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)N1-36、Q1a-22和N1-43菌株，美国EBC(EnergyBioSystems Corporation)公司的紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)IGTS8和红球菌(Rhodococcus sp.) I-19菌株，日本静冈石油能源中心高级技术研究所生物精炼加工实验室红球菌(Rhodococcus sp.)KA2-5-1菌株，美国.加利福尼亚州斯坦福SSRL(Stanford Synchrotron Radiation Laboratory)实验室的红球菌(Rhodococcus sp.)ECRD-1菌株。而且，Rhodococcus rhodochrous IGTS8在美国已进入工业应用的中试阶段。因而，红球菌(Rhodococcus)被广泛认为是最具应用前景的脱硫菌。尽管如此，这些红球菌亦然具有这样或那样的缺陷，从而限制了其应用。例如对高浓度的DBT的耐受性和脱硫活性差，脱除有机硫的活性易受硫酸根等无机含硫化合物的抑制，不能耐受羟基联苯的抑制等都是具有代表性的缺憾。我国国内公开报道的有自主知识产权的“四硫途径”脱硫菌有德氏假单胞菌(Pseudomanas delafidii)R-8、球形诺卡氏菌(Nocardia globelula)R-9、短芽胞杆菌(Bacillus brevie)R-6和球形芽胞杆菌(Bacillus sphaericus)R-16等，未见有红球菌(Rhodococcus)的报道。有关该类菌的许多研究工作，均是借国外的红球菌(Rhodococcus)进行，没有该类菌的所有权，因而也不可能将其直接应用于工业生产。本发明的红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)新菌株LSSE8-1具有广阔的工业应用前景和理论研究价值。
                           发明内容
本发明的目的在于克服以上红球菌的缺陷，提供一种更高活性，耐硫酸根和羟基连苯，并能对高浓度的DBT有较高脱硫活性的红平红球菌；
本发明的目的在于该红平红球菌在脱除含硫化合物中硫元素的应用。
本发明提供的一株成功地从自然界筛选分离得到的红平红球菌及其在脱除有机含硫化合物中硫的应用，该红平红球菌无论是生长状态还是静止细胞，无论是游离细胞还是固定化细胞，无论是完整的菌体还是破碎的菌体片段，无论是细胞粗液还是分离纯化的酶组分均能表现出专一性的有效地脱除含硫化合物，特别是石油及其产品中的硫。
本发明的实施方案如下：
本发明提供的红平红球菌，其特征在于：该红平红球菌为Rhodococcuserythropolis LSSE8-1，2001年10月9日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC NO.0643；
该红平红球菌的革兰氏染色阳性，部分抗酸，好氧；在葡萄糖天门冬素琼脂和营养琼脂上30℃插片培养14小时后，其菌丝从菌落中央开始断裂，24小时产生球状或杆状小体，72小时菌落周缘继续生长，无气生菌丝体，偶尔有分枝；对维生素B1无要求；
该红平红球菌含有内消旋二氨基庚二酸，有特征性的阿拉伯糖和半乳糖，细胞壁属于IV型，该红平红球菌含有诺卡氏枝菌酸；
该红平红球菌本发明的16SrRNA序列如下：
GTGTTTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAAGGCCTTTCGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACAC
GTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACTTCAGGT
TGCATGACTTGGGGTGGAAAGATTTATCGGTGCAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGT
AATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACG
GCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCC
GCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTG
CAGAAGAAGCACCGG。
本发明提供的红平红球菌在脱除有机含硫化合物中的硫的应用，其特征在于：所述的含硫化合物为有机含硫化合物或无机含硫化合物，本发明的红平红球菌尤其是可脱除以二苯并噻吩(DBT)为代表的有机含硫化合物中的硫元素，对无机化合物亦有作用。在脱除以苯并噻吩(DBT)为代表的一大类化石燃料中的含硫化合物时，专一性地攻击碳硫键，对碳碳键不进行攻击，原分子的碳碳结构没有被破坏。
下面详细介绍本发明：
本发明的红平红球菌是以我国贵州省赤水市赤水气田12#气井附近被油气污染的土壤和污水池中采集土样和水样，以二苯并噻吩化合物为硫源选择性培养分离纯化而得到；其生物学特征如下：
A.形态学特征
菌株LSSE8-1在葡萄糖天冬素琼脂和营养琼脂上插片培养14小时后，该菌的菌丝从菌落中央开始断裂，24小时后产生球状或杆状的小体(如图3和图4所示)。培养72小时菌落周缘继续生长、无气生菌丝体，偶尔有分枝。革兰氏染色阳性，部分抗酸。
B.培养特征
本菌株LSSE8-1在以下五种培养基中的生长结果见表1所示。
                    表1菌株LSSE8-1的培养特征
  培养基     气生菌丝     基内菌丝     可溶色素
  葡萄糖天门冬素琼脂     无     落英淡粉     无
  营养琼脂     无     浅肉色     无
  桑塔斯琼脂     无     蛋壳黄     无
  土豆浸汁琼脂     无     鹿角棕     无
  TY琼脂     无     落英淡粉     无
C.化学组分
按Hasegawa T.等的快速薄层层析法(Thin Layer Chromography，TLC)对本菌株LSSE8-1进行全细胞水解液糖型及氨基酸分析，确认该菌含有meso-DAP(内消旋二氨基庚二酸，Diaminopimelic acid)，有特征性的阿拉伯糖和半乳糖，细胞壁属于IV型。
按Lechevalier的实验方法进行枝菌酸分析，本菌株LSSE8-1含有诺卡氏枝菌酸(nocardomycolic acid)。
D.生理生化
参照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》vol.IV.的方法，菌株LSSE8-1的生理生化特征如表2所示。
                表2菌株LSSE8-1的生理生化特征
    特征     结果     碳源利用特征     结果
    明胶液化     -     葡萄糖     +
    牛奶凝固     -     L-阿拉伯糖     -
    牛奶胨化     +     D-木糖     -
    淀粉水解     -     D-果糖     +
    硝酸盐还原     -     D-半乳糖     -
    纤维素上生长     -     D-甘露糖     +
    H2S产生     -     海藻糖     +
    黑色素产生     -     麦芽糖     -
    尿素水解     +     鼠李糖     -
    酪氨酸水解     +     D-山梨醇     +
    分解腺嘌呤     +     苷露醇     +
    分解七叶苷     +     肌醇     -
    水解Tween60     +     石腊     +
    水解Tween40     +     柠檬酸钠     +
    醋酸钠     +
E.16SrRNA序列
本发明的菌株LSSE8-1的16SrRNA序列如下：
GTGTTTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAAGGCCTTTCGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACAC
GTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACTTCAGGT
TGCATGACTTGGGGTGGAAAGATTTATCGGTGCAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGT
AATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACG
GCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCC
GCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTG
CAGAAGAAGCACCGG
通过查国际相关的基因库，本发明的菌株LSSE8-1与其中相关菌株的16SrRNA虽有相似性(如表3所示)，但却不完全相同，说明本菌是首次被分离鉴定。
                    表3菌株LSSE8-1与相关菌株的16SrRNA的相似性
登录路径及菌相关菌株名称   分值(bits)     E值
Gb|AF235012.1|AF235012 Rhodococcus sp.UFZ-B528   846     0.0
emb|AJ011328.1|RER011328 Rhodococcus erythropolis   846     0.0
Gb|U82667.1|NSU82667 Nocardioides simplex   846     0.0
Gb|U82666.1|NSU82666 Nocardioides simplex   846     0.0
Gb|U87968.1|RSU87968 Rhodococcus sp.X309.   846     0.0
emb|AJ131637.1|RER131637 Rhodococcus erythropolis   846     0.0
emb|X79289.1|RE43066RR R.erythreus(DSM 43066)   841     0.0
emb|X81929.1|RE16RNA1 R.erythropolis(ATCC 4277T)   835     0.0
dbj|AB046362.1|AB046362 Rhodococcus erythropolis   795     0.0
emb|AJ309915.1|RGL309915 Rhodococcus globerulus   791     0.0
Gb|U87969.1|RSU87969 Rhodococcus sp.B1   783     0.0
Gb|AF095715.1|AF095715 Rhodococcus opacus   759     0.0
emb|AJ298931.1|ROP298931 Rhodococcus opacus   759     0.0
emb|Y11892.1|ROGM2916S R.opacus strain GM-29   759     0.0
emb|X89710.1|RO16SRRNA R.opacus   759     0.0
emb|Y11893.1|RO1CP16S R.opacus strain 1CP   759     0.0
emb|Z37138.1|TW16SRRNB T.wratislaviensis   759     0.0
emb|X80630.1|RO16SR R.opacus   759     0.0
dbj|AB032565.1|AB032565 Rhodococcus opacus   759     0.0
emb|X80616.1|RSP16SR Rhodococcus sp.   753     0.0
Gb|AF181689.1|AF181689 Rhodococcus sp.5/1   751     0.0
emb|AJ002749.1|RSPAJ2749 Rhodococcus sp.strain G   751     0.0
emb|Z37137.1|TW16SRRNA T.wratislaviensis   751     0.0
emb|X80631.1|RO16SR2 R.opacus   751     0.0
emb|X80617.1|RM16SR R.marinonascens   745     0.0
 Gb|AF260713.1|AF260713 Rhodococcus sp.     743     0.0
 Gb|AF235011.1|AF235011 Rhodococcus sp.UFZ-B520     743     0.0
 emb|AJ011329.1|RFA011329 Rhodococcus fascians     743     0.0
 emb|X81933.1|RM16RNA2 R.marinonanscens(ATCC 35653T)     743     0.0
 emb|Y11196.1|RFRIBORNA R.fascians     743     0.0
 emb|X79186.1|RF16S69 R.fascians(DSM 20669)e     743     0.0
 emb|X81930.1|RF16RNA1 R.fascians(ATCC 12974T)     743     0.0
 dbj|AB037103.1|AB037103 Rhodococcus opacus     743     0.0
 dbj|AB037102.1|AB037102 Rhodococcus opacus     743     0.0
 dbj|AB037100.1|AB037100 Rhodococcus opacus     743     0.0
 dbj|AB037246.1|AB037246 Rhodococcus opacus     743     0.0
 emb|X81932.1|RL16RNA1 R.fascians(ATCC 35014T)     739     0.0
 Gb|AF131626.1|AF131626 Tsukamurella sp.     737     0.0
 Gb|AF131442.1|AF131442 Nocardia sp.IM-3553     735     0.0
 Gb|AF181690.1|AF181690 Rhodococcus sp.5/14     735     0.0
 emb|X80615.1|NC16SR2 N.corynebacteroides     735     0.0
 Gb|AF154129.1|AF154129 Nocardia beijingensis     730     0.0
 dbj|AB024312.1|AB024312 Nocardia sp.MK703-102F1     728     0.0
 Gb|AF240142.1|AF240142 Grassland soil bacterium TSA-17     726     0.0
 emb|Y07849.1|RCRNA16S R.corynebacteroides     720     0.0
 emb|Y07813.1|RCO16SR R.corynebacteroides     720     0.0
 dbj|D84420.1|RERPR4 Rhodococcus sp.     718     0.0
 emb|X81935.1|RR16RNA2 R.rhodnii(ATCC 35071T)     716     0.0
 emb|Z37136.1|NP16SRRNA N.pseudosporangifera     712     0.0
 emb|X92114.1|RP16SrRNA R.percolatus     710     0.0
 emb|Z36930.1|NN16SRRNX N.nova     704     0.0
 emb|Z36934.1|NA16SRRNX N.asteroides     704     0.0
 Gb|AF131443.1|AF131443 Nocardia sp.IM-4165     696     0.0
 Gb|AF131441.1|AF131441 Nocardia sp.IM-2608     696     0.0
 emb|X80623.1|RR16SR4 R.rhodnii     696     0.0
 emb|X80621.1|RR16SR2 R.rhodnii     696     0.0
 emb|Z36927.1|NV16SRRNX N.vaccinii     696     0.0
 emb|Z36928.1|NB16SRRNY N.brevicatena     696     0.0
 dbj|AB046357.1|AB046357 Rhodococcus sp.IFO16295     696     0.0
 dbj|AB023374.1|AB023374 Rhodococcus sp.IFO16253     694     0.0
 Gb|AF131440.1|AF131440 Nocardia sp.IM-1627     692     0.0
 Gb|AF131438.1|AF131438 Nocardia sp.IM-0352     690     0.0
 emb|X80606.1|NA16SR N.asteroides     690     0.0
 emb|X80600.1|NB15333 N.brevicatena     688     0.0
 emb|X84850.1|NA192477R N.asteroides(ATCC 19247T)     688     0.0
 Gb|AF131444.1|AF131444 Nocardia sp.IM-4166     684     0.0
 emb|X80593.1|NN33726T N.nova     684     0.0
 emb|X80622.1|RR16SR3 R.rhodnii     682     0.0
 dbj|AB044557.1|AB044557 Rhodococcus sp.PN1     682     0.0
 emb|Z46750.1|NSRNA16 N.salmonicida     674     0.0
 emb|X80597.1|NV11092 N.vaccinii     674     0.0
 emb|X82052.1|CHOA16S C.hoagii     674     0.0
 emb|X80613.1|NR16SR N.restrica     672     0.0
 Gb|AF277219.1|AF277219 Nocardia sp.W504     666     0.0
 Gb|AF277212.1|AF277212 Nocardia sp.R18     666     0.0
 emb|X84855.1|NSPN649RR N.pseudobrasiliensis     664     0.0
 emb|X84856.1|NSP51511R N.pseudobrasiliensis     664     0.0
 Gb|AF331799.1|AF331799 Nocardia sp.4.1177     662     0.0
 Gb|AF179865.1|AF179865 Nocardia paucivorans     662     0.0
 emb|X80614.1|RE16SR R.equi     662     0.0
 Gb|AF227864.1|AF227864 Nocardia sp.86349     660     0.0
 Gb|AF277223.1|AF277223 Nocardia terrovolcana     656     0.0
 Gb|AF277221.1|AF277221 Nocardia sp.R66     656     0.0
 Gb|AF277214.1|AF277214 Nocardia sp.R32     656     0.0
 Gb|AF277211.1|AF277211 Nocardia sp.R25     656     0.0
 Gb|AF277206.1|AF277206 Nocardia sp.W138     656     0.0
 Gb|AF277202.1|AF277202 Nocardia soli strain S1     656     0.0
 Gb|AF277199.1|AF277199 Nocardia soli     656     0.0
 emb|X84853.1|NSPN1049R N.pseudobrasiliensis     656     0.0
 emb|X84857.1|NSP51512R N.pseudobrasiliensis     656     0.0
 Gb|AF277226.1|AF277226 Nocardia sp.R98     652     0.0
 Gb|AF277222.1|AF277222 Nocardia sp.R133     650     0.0
 Gb|AF277215.1|AF277215 Nocardia sp.R31     650     0.0
 Gb|AF163818.1|AF163818 Nocardia asteroides   650   0.0
 emb|AJ298938.1|RC0298938 Rhodococcus coprophilus   650   0.0
 Gb|AF277216.1|AF277216 Nocardia sp.R26   648   0.0
 emb|X80603.1|RE6393T R.equi   648   0.0
 emb|X80594.1|RE33707 R.equi   648   0.0
 emb|Z36926.1|NT16SRRNX N.transvalensis   648   0.0
 Gb|AF277205.1|AF277205 Nocardia sp.W32   644   0.0
该菌属于红球菌属进化分枝。形态特征：基内菌丝生长良好，有初级分枝、横隔并断裂成杆状或球状小体，表面光滑；无气生菌丝体。胞壁化学组份中含有枝菌酸，胞壁属于IV型，部分抗酸。
本发明的LSSE8-1菌株既可以在营养培养基中培养，也或以在含有硫源(无机可溶性含硫化合物如MgSO4，或有机含硫化合物如二甲基亚砜等)的基础培养基中培养。若菌体生长中没有DBT，则脱硫前在培养基中加入DBT或其衍生物CxDBT进行适当诱导能大大提高脱硫速度。菌株在pH4-9均能良好地生长，生长温度25-45℃，好氧。
本发明的菌株LSSE8-1的应用方法有：(1)用除DBT类化合物以外的其它化合物作硫源，迅速培养的菌体，直接或DBT诱导后用于石油及其产品的脱硫；(2)用冷冻干燥的菌体细胞进行脱硫；(3)用该菌的细胞片段或细胞提取液进行脱硫；(4)用该菌中提纯的生物活性成份进行脱硫。(5)该菌进行进一步的诱变处理后进行脱硫。
本发明提供的红平红球菌是从自然界筛选分离得到的；该红平红球菌无论是生长状态还是静止细胞，无论是游离细胞还是固定化细胞，无论是完整的菌体还是破碎的菌体片段，无论是细胞粗液还是分离纯化的酶组分均能表现出专一性的有效地脱除含硫化合物，特别是石油及其产品中的硫。
                            附图说明
附图1为生物脱硫的“Kodama途径”示意图；
附图2为生物脱硫的“4S途径”示意图；
附图3为本发明LSSE8-1菌株的菌丝及断裂小体形态(750X)
附图4为本发明LSSE8-1菌株的断裂小体表面特征(10,000X)
附图5为本发明LSSE8-1脱除DBT中硫的色谱分析图；
附图6为本发明LSSE8-1的16SrRNA序列。
                             实施方式
实施例1：LSSE8-1菌株的筛选
气井的密封性好，一般没有什么泄漏。但是，气井在钻井时却有大量的石油和天然气喷出。从中国贵州省赤水市赤水气田12号气井周围寻找这种被石油污染的土壤作样品，同时在气井附近的污水池中取污水样。取5克土壤样品悬浮于25毫升的生理盐水中，置摇床中混合30-60分钟后，静置，吸以上清液于100毫升的选择性培养基中(水样可以直接取上清液加于选择性培养基中)。选择性培养基的组成为：去离子水1000毫升，KH2PO4 2.44克；Na2HPO4·12H2O 14.03克；NH4Cl 2.00克；MgCl2·6H2O 0.36克；CaCl2·2H2O 0.001克  FeCl3·6H2O 0.001克MnCl2·4H2O 0.004克；甘油1.5毫升，其中加入0.1mmol/L的二苯并噻吩(DBT)作硫源。置摇床以150转/分，30℃培养三天后，在琼脂制成的选择性固体培养基上进行划线分离。分离得到的单菌落分别接种于DBT为0.2mmol/L的选择性培养基中，置摇床以150转/分，30℃培养三至五天。取培养液2ml，用1M盐酸调节其PH为1.0，用2ml的正己醇振荡萃取。萃取液用高效液相进行分析。并与HBP的标准品进行对照。结果选择到了一株对二苯并噻吩(DBT)具有专一性脱硫能力的菌株，定名为红平红球菌为Rhodococcus erythropolis LSSE8-1，2001年10月9日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC NO.0643。
实施例2：LSSE8-1生长细胞的获得与诱导
挑取营养斜面培养的LSSE8-1菌株，加入25毫升的基础培养基中。培养基的成份：去离子水1000毫升，KH2PO4 2.44克；Na2HPO4·12H2O 14.03克；NH4Cl2.00克；MgCl2·6H2O 0.36克；CaCl2·2H2O 0.001克  FeCl3·6H2O 0.001克MnCl2·4H2O 0.004克；葡萄糖10克，Na2SO4 1mmol/L。30℃，150转/分培养24-48小时后，再将其加入500毫升的基础培养基中，48-72小时后，离心获得菌体。将菌体置于50毫升含有1mmol/L DBT的生理盐水中，摇床混合2-4小时，离心再次取得菌体。
实施例3：LSSE8-1活性干细胞的获得
挑取营养斜面培养的LSSE8-1菌株，加入25毫升的基础培养基中。培养基的成份：去离子水1000毫升，KH2PO4 2.44克；Na2HPO4·12H2O 14.03克；NH4Cl2.00克；MgCl2·6H2O 0.36克；CaCl2·2H2O 0.001克FeCl3·6H2O 0.001克MnCl2·4H2O 0.004克；葡萄糖10克，Na2SO4 1mmol/L。30℃，150转/分培养24-48小时后，再将其加入500毫升的基础培养基中，48-72小时后，离心获得菌体。将菌体置于50毫升含有0.1mmol/L DBT的生理盐水中，摇床混合2-4小时，离心再次取得菌体。冷冻真空干燥获得具有活性的干细胞。
实施例4：菌株LSSE8-1脱除模拟体系DBT中的硫。
十二烷中加入DBT，使浓度达到0.2mmol/L。挑取营养斜面培养的LSSE8-1菌株，加入25毫升的基础培养基中。培养基的成份：去离子水1000毫升，KH2PO42.44克；Na2HPO4·12H2O 14.03克；NH4Cl 2.00克；MgCl2·6H2O 0.36克；CaCl2·2H2O0.001克FeCl3·6H2O 0.001克MnCl2·4H2O 0.004克；葡萄糖10克，DBT浓度1mmol/L。30℃，150转/分培养24-48小时后，以油水比1∶3将模拟的油相和菌体培养物混合。30℃，150转/分培养24-48小时，硫被全部脱除，其产物是HBP(如图5所示)。
实例5：菌株LSSE8-1用于加氢脱硫后柴油的深度脱硫
挑取营养斜面培养的LSSE8-1菌株，加入50毫升的基础培养基中。培养基的成份：去离子水1000毫升，KH2PO4 2.44克；Na2HPO4·12H2O 14.03克；NH4Cl2.00克；MgCl2·6H2O 0.36克；CaCl2·2H2O 0.001克  FeCl3·6H2O 0.001克MnCl2·4H2O 0.004克；葡萄糖10克，DBT浓度1mmol/L。30℃，150转/分培养24-48小时后，得到菌悬液。加氢脱硫后柴油20毫升与之混和后，摇床培养24-48小时，柴油中的硫含量由263ppm降至50ppm以下。
实例6：菌株LSSE8-1用于污水中硫酸盐污染物的脱除
挑取营养斜面培养的LSSE8-1菌株，加入50毫升的基础培养基中。培养基的成份：去离子水1000毫升，KH2PO4 2.44克；Na2HPO4·12H2O 14.03克；NH4Cl2.00克；MgCl2·6H2O 0.36克；CaCl2·2H2O 0.001克  FeCl3·6H2O 0.001克MnCl2·4H2O 0.004克；葡萄糖10克，DBT浓度1mmol/L。30℃，150转/分培养24-48小时后，得到菌悬液。以4％的接种比例将该菌悬液接种到含500ppm硫酸根离子的污水中，摇床培养24小时，水中的硫酸根降低至30ppm以下。

Claims (2)

1.一株红平红球菌，其特征在于：该红平红球菌为Rhodococcus erythropolisLSSE8-1，2001年10月9日保藏于‘中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心’，其保藏号为CGMCC No.0642；该红平红球菌的革兰氏染色阳性，部分抗酸，好氧；在葡萄糖天门冬素琼脂上30℃插片培养14小时后，菌丝从菌落中央开始断裂，24小时产生球状或杆状小体，72小时菌落周缘继续生长，无气生菌丝体，偶尔有分枝；对维生素B1无要求；该红平红球菌含有内消旋二氨基庚二酸，有特征性的阿拉伯糖和半乳糖，细胞壁属于IV型，含有诺卡氏枝菌酸；该红平红球菌的16SrRNA序列如下：
GTGTTTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAAGGCCTTTCGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACA
CGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACTTCAG
GTTGCATGACTTGGGGTGGAAAGATTTATCGGTGCAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGG
GGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGA
CACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCG
ACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGCGCAAGTGACGG
TACCTGCAGAAGAAGCACCGG。
2、按权利要求1所述的红平红球菌在脱除含硫化合物中的硫的应用，其特征在于，所述的含硫化合物为有机含硫化合物或无机含硫化合物。
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