CN1219878C - 戈登氏菌及其在脱除含硫化合物中硫元素的应用 - Google Patents

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CN1219878C CN 02116212 CN02116212A CN1219878C CN 1219878 C CN1219878 C CN 1219878C CN 02116212 CN02116212 CN 02116212 CN 02116212 A CN02116212 A CN 02116212A CN 1219878 C CN1219878 C CN 1219878C
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Abstract

本发明的戈登氏菌为Gordona nitida LSSEJ-1，2002年1月24日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC NO.0700；其革兰氏染色阳性，菌体为棒状，长2-3微米，生长过程中从棒状转变为球形，在菌落内或液体培养条件下多以细胞聚集体形式存在，不抗酸；好氧；对维生素B1无要求；该戈登氏菌含有内消旋二氨基庚二酸，有特征性的阿拉伯糖和半乳糖，细胞壁属于IV型，该戈登氏菌含有诺卡氏枝菌酸；含有的甲基萘醌类物质主要为MK-9(H2)；可有效地脱除含硫化合物中的硫，含硫化合物为有机含硫化合物。

Description

戈登氏菌及其在脱除含硫化合物中硫元素的应用
                           发明领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种戈登氏菌及其在脱除含硫化合物中硫的应用。
                           背景技术
石油中的含硫有机化合物包括各种硫醇，硫醚，二硫化物和噻吩及其衍生物。其中，以噻吩类化合物含量最多。石油产品中的硫经过燃烧以二氧化硫的形式排放到大气中，再经过酸雨的形式沉降下来，对环境造成了严重的污染，严重威胁着全球的生态平衡。据报道，全世界每年排入大气的SO2近两亿吨，我国每年排入大气的SO2为1795万吨，我国酸雨面积不断扩大，1995年已扩大到华中、华南地区约100万平方公里，占国土面积的29％，酸雨威胁到73个城市。汽车尾气已成为我国大城市的主要空气污染源。1998年国际卫生组织公布的一项报告表明全球空气污染最严重的十大城市中，我国的太原、北京、乌鲁木齐、兰州、重庆、济南、石家庄七大城市榜上有名。同时，含硫有机化合物能严重地毒化石油精炼时的催化剂，导致产率降低。因此，为了减少大气中硫的污染，世界各国对燃料油中硫含量的要求越来越严格。美国1990年就通过了清洁空气法的修正案，提出了使用新配方汽油的要求。欧洲议会1998年也立法要求2000年实施清洁汽油配方。2000年，发达国家普遍要求将柴油中的硫含量降到350ppm以下甚至更低。汽油的含硫量降到50-100ppm以下，北美和欧洲国家要求到2005年汽油、柴油中硫含量要低于50ppm，2010年要低于30ppm甚至于10ppm。我国是一个发展中国家，汽油和柴油的品质较低，SO2的排放量远远超过世界平均水平。为了落实国家的可持续发展战略，我国初步提出将目前柴油中硫含量从5000ppm降低到2000ppm以下，部分大城市车用柴油中硫含量低于500ppm。
目前，工业上广泛采用的加氢脱硫法(HDS)是一个需要催化剂的高温高压过程，因此它的耐温耐压设备投资昂贵，操作费用高。加氢脱硫虽然能够有效脱除石油中的无机硫和部分有机硫，但对带有取代基的二苯并噻吩类杂环化合物的脱硫效率很低。然而，要使燃油中的硫含量达到高标准的要求，这类含硫稠杂环中的硫也必须加以脱除。最近十年生物催化脱硫(BDS)研究取得了很大的进展，微生物能够在温和的条件下将含硫杂环中的硫选择性脱除，使得石油及其制品的深度脱硫成为可能。
生物脱硫就是利用微生物专一性脱除含硫化合物的硫。1988年，美国气体技术研究所(IGT)的Kilbane首次分离得到了能够选择性催化DBT类含硫化合物C-S键的断裂而不改变分子的碳氢结构的红平红球菌(Rhodococcus rhodochrous)IGTS8，它能够将DBT中C-S键打开并使硫脱除，经过选择性脱硫的“4S”途径，即亚砜/砜/磺酸盐/硫酸盐(sulfoxide/sulfone/sulfonate/sulfate)途径，将DBT代谢为2-羟基联苯(如图1)。其他研究者也相继分离出了一些类似的细菌，如：红球菌ECRD-1、UM3和UM9，红平红球菌D1和N1-36，棒杆菌(Corynebacteriumsp.)SY1，嗜热的Paenibacillus sp.细菌A11-2，Gordona细菌CYKS1和诺卡氏菌(Nocardia sp.)CYKS2等等。生物脱硫反应条件温和，设备投资仅为加氢脱硫的30％，反应过程没有有害产物生成，可以实现深度脱硫。同时，这类催化C-S键断裂的过程使燃料中的有价值成分最大限度地保留下来，显示了良好的工业化前景。
在国内外已发现的专一性脱硫的微生物中以红球菌最多。其中，Rhodococcusrhodochrous IGTS8在美国已进入工业应用的中试阶段。因而，红球菌被广泛认为是最具应用前景的脱硫菌。但是，红球菌对高浓度DBT的脱硫活性差，脱硫活性受硫酸根等无机含硫化合物及羟基联苯的抑制。在微生物分类中，戈登氏菌与红球菌同为放线菌，细胞壁均为IV型，具有相似的有机溶剂抗性，戈登氏菌在生物脱硫的应用前景可与红球菌相提并论，为生物脱硫的工业化应用提供更多的选择。因此，本发明的戈登氏菌(Gordona nitida)新菌株LSSEJ-1具有广阔的工业应用前景和理论研究价值。
                           发明内容
本发明的目的在于克服红球菌的缺陷，得到更高活性，耐硫酸根和羟基连苯，并能对高浓度的DBT有较高脱硫活性的菌株。本发明是一株成功地从自然界筛选分离得到的戈登氏菌及其在脱除有机含硫化合物中硫的应用，该戈登氏菌无论是生长状态还是静止细胞，无论是游离细胞还是固定化细胞，无论是完整的菌体、细胞裂解液还是分离纯化的酶组分均能表现出专一性的有效地脱除含硫化合物，特别是石油产品中含硫化合物中的硫。
本发明的实施方案如下：
本发明提供的戈登氏菌，其特征在于：该戈登氏菌为Gordona nitida LSSEJ-1，2002年1月24日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC NO.0700；
菌株LSSEJ-1菌体为棒状，长2-3微米，生长过程中从棒状转变为球形，在菌落内或液体培养条件下多以细胞聚集体形式存在，不形成孢子，不能移动，革兰氏染色阳性，不抗酸。
该戈登氏菌含有内消旋二氨基庚二酸，有特征性的阿拉伯糖和半乳糖，细胞壁属于IV型，该戈登氏菌含有诺卡氏枝菌酸；
该戈登氏菌的16SrRNA序列如下：
TACGGCTACCTTGTTACGACTTCGTCCCAATCGCCGATCCCACCTTCGACAGCTCCCTCCCACAAGGGGTTAGGCCACCGGC
TTCGGGTGTTACCGACTTTCATGACGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCGTTGCTGATCTG
CGATTACTAGCGACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACTGGCTTTAAGGGATTCGCTCCA
CCTCACGGTATCGCAGCCCTCTGTACCAGCCATTGTAGCATGTGTGAAGCCCTGGACATAAGGGGCATGATGACTTGACGTC
ATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTCTCCTGCAAGTCCCCGGCATAACCCGCTGGCAATACAGGACAAGGGTTG
CGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTACACCAACCACAAGGGA
ACATGTATCTCTACATGCGTCTGGTGTATGTCAAACCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCACATGCTCCG
CCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGTACTTAATGCGTTAGC
TACGGCACGGAACTCGTGAAATGAGCCCCACACCTAGTACCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGTATCTAATCCTGTTC
GCTACCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACTACCCAGAGACCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGC
ATTTCACCGCTACACCAGGAATTCCAGTCTCCCCTGTAGTACTCAAGTCTGCCCGTATCGCCTGCACGCCTACAATTGAGTT
GCAGAAATTCACAGACGACGCGACAAACCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAGTAATTCCGGACAACGCTCGCACCCTACGTA
TTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTGGCCGGTGCTTCTTCTCCAGGTACCGTCACTTGCGCTTCGTCCCTGGTGAAAGAGGT
TTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCC
TCCCGTAGAGTCTGGGCTGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTAGG
CCATTACCCCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGGGCCCATCCTGAACCGCAAAAGCTTTCCACCCCAGAGCATGCATTCCAAG
GTCATATCCGGTATTAGACCCAGTTTCCCAGGCTTATCCCAAAGTTCAGGGCAGATCACCCACGTGTTACTCACCCGTTCGC
CACTCGAGTACCCAGCAAGCTGGGCCTTTCCGTTCGACTTGCATGTGTTAAGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCATGA
TCAAACTCT
本发明提供的戈登氏菌在脱除有机含硫化合物中硫元素的应用，尤其是对二苯并噻吩(DBT)及其衍生物；所述的含硫化合物为有机含硫化合物，在脱除以苯并噻吩(DBT)为代表的一大类化石燃料中的含硫化合物时，专一性地攻击碳硫键，对碳碳键不进行攻击，原分子的碳碳结构没有被破坏。
下面详细介绍本发明：
本发明的戈登氏菌是以我国大港油田被油气污染的土壤和污水池中采集上样和水样，以二苯并噻吩化合物为硫源选择性培养分离纯化而得到，其生物学特征如下：
A.形态学特征
菌株LSSEJ-1菌体为棒状(见图2和图3)，长2-3微米，生长过程中从棒状转变为球形，在菌落内或液体培养条件下多以细胞聚集体形式存在，不形成孢子，不能移动，革兰氏染色阳性，不抗酸。在液体培养条件下，沿玻璃管壁生长，形成菌膜。
B.培养特征
本菌株LSSEJ-1在葡萄糖天门冬素琼脂、营养琼脂、桑塔斯琼脂、土豆浸汁琼脂等五种培养基中培养，形成的菌落开始时没有颜色，然后逐渐变成橙红色，菌膜厚，边缘光滑，无气生菌丝。
C.化学组分
按Hasegawa T.等的快速薄层层析法(Thin Layer Chromography，TLC)对本菌株LSSEJ-1进行全细胞水解液糖型及氨基酸分析，确认该菌含有meso-DAP(内消旋二氨基庚二酸，Diaminopimelic acid)，有特征性的阿拉伯糖和半乳糖，细胞壁属于IV型。
按Lechevalier的实验方法进行枝菌酸分析，本菌株LSSEJ-1含有诺卡氏枝菌酸(nocardomycolic acid)。含有的甲基萘醌类物质主要为MK-9(H2)。
D.生理生化
参照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》vol.IV.的方法，菌株LSSEJ-1的生理生化特征如表1所示。
            表1为菌株LSSEJ-1的生理生化特征
    特征     结果   碳源利用特征     结果
    明胶液化     -     葡萄糖     +
    牛奶凝固     -     L-阿拉伯糖     -
    牛奶胨化     +     D-木糖     -
    淀粉水解     +     D-果糖     +
    硝酸盐还原     -     D-半乳糖     +
    纤维素上生长     -     D-甘露糖     +
    H2S产生     -     海藻糖     +
    黑色素产生     -     麦芽糖     -
    尿素水解     +     鼠李糖     -
    酪氨酸水解     -     D-山梨醇     -
    分解腺嘌呤     -     苷露醇     +
    分解七叶苷     +     肌醇     -
    水解Tween60     +     石腊     +
    水解Tween40     +     柠檬酸钠     +
    过氧化氢酶     +     醋酸钠     +
E.16SrRNA序列
本发明的菌株LSSEJ-1的16SrRNA序列如下：
TACGGCTACCTTGTTACGACTTCGTCCCAATCGCCGATCCCACCTTCGACAGCTCCCTCCCACAAGGGGTTAGGCCACCG
GCTTCGGGTGTTACCGACTTTCATGACGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCGTTGCTGA
TCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACTGGCTTTAAGGGATTC
GCTCCACCTCACGGTATCGCAGCCCTCTGTACCAGCCATTGTAGCATGTGTGAAGCCCTGGACATAAGGGGCATGATGAC
TTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTCTCCTGCAAGTCCCCGGCATAACCCGCTGGCAATACAGG
ACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTACACC
AACCACAAGGGAACATGTATCTCTACATGCGTCTGGTGTATGTCAAACCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTA
ATCCACATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGG
TACTTAATGCGTTAGCTACGGCACGGAACTCGTGAAATGAGCCCCACACCTAGTACCCACCGTTTACGGCGTGGACTACC
AGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACTACCCAGAGACCCGCCTTCGCCACCGGT
GTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCACCGCTACACCAGGAATTCCAGTCTCCCCTGTAGTACTCAAGTCTGCCCGTATCG
CCTGCACGCCTACAATTGAGTTGCAGAAATTCACAGACGACGCGACAAACCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAGTAATTC
CGGACAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTGGCCGGTGCTTCTTCTCCAGGTACCGTCACT
TGCGCTTCGTCCCTGGTGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGC
CCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGAGTCTGGGCTGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTC
AGGTCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTAGGCCATTACCCCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGGGCCCATCCTGAACCGCA
AAAGCTTTCCACCCCAGAGCATGCATTCCAAGGTCATATCCGGTATTAGACCCAGTTTCCCAGGCTTATCCCAAAGTTCA
GGGCAGATCACCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTCGAGTACCCAGCAAGCTGGGCCTTTCCGTTCGACTTGCATGT
GTTAAGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCATGATCAAACTCT
通过检索GenBank，本发明的菌株LSSEJ-1与其中相关菌株的16SrRNA的相似性如表2所示。
                          表2菌株LSSEJ-1与相关菌株的16SrRNA的相似性
                    登录路径及菌相关菌株名称   分值(bits)     E值
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表2显示，本发明LSSEJ-1新菌株的16SrRNA在GenBank中无完全相同的菌株，说明本菌株是首次被分离。该菌属于戈登氏菌属进化分枝。形态特征：菌体为棒状，长2-3微米，生长过程中从棒状转变为球形，在菌落内或液体培养条件下多以细胞聚集体形式存在；无气生菌丝体。胞壁化学组份中含有枝菌酸，胞壁属于IV型，不抗酸。
本发明的LSSEJ-1菌株既可以在营养培养基中培养，也或以在含有硫源(无机可溶性含硫化合物如MgSO4，或有机含硫化合物如二甲基亚砜等)的基础培养基中培养。若菌体生长中没有DBT，则脱硫前在培养基中加入DBT或其衍生物CxDBT进行适当诱导能大大提高脱硫速度。菌株在pH4-9均能良好地生长，生长温度25-45℃，好氧。
本发明的菌株LSSEJ-1的应用方法有：(1)用除DBT类化合物以外的其它化合物作硫源，迅速培养的菌体，直接或DBT诱导后用于石油及其产品的脱硫；(2)用冷冻干燥的菌体细胞进行脱硫；(3)用该菌的细胞片段或细胞提取液进行脱硫；(4)用该菌中提纯的生物活性成份进行脱硫。(5)该菌进行进一步的诱变处理后进行脱硫。
本发明提供的戈登氏菌是从自然界筛选分离得到的；该戈登氏菌无论是生长状态还是静止细胞，无论是游离细胞还是固定化细胞，无论是完整的菌体还是破碎的菌体片段，无论是细胞粗液还是分离纯化的酶组分均能表现出专一性的有效地脱除含硫化合物，特别是石油及其产品中的硫。
                        附图说明
附图1为生物脱硫的“4S途径”示意图；
附图2-1、附图2-2为本发明LSSEJ-1菌株的投射电镜照片
附图3为本发明LSSEJ-1菌株的扫描电镜照片
附图4为本发明LSSEJ-1菌株脱除DBT中硫的色谱分析图；
附图5为本发明LSSEJ-1菌株的16SrRNA序列图
                      具体实施方式
实施例1：LSSEJ-1菌株的筛选
从中国大港油田6号油井附近取被石油污染的土壤作样品。取5克土壤样品悬浮于25毫升的生理盐水中，置摇床中混合30-60分钟后，静置，吸以上清液于100毫升的选择性培养基中(水样可以直接取上清液加于选择性培养基中)。选择性培养基的组成为：去离子水1000毫升，KH2PO4 2.44克；Na2HPO4·12H2O 14.03克；NH4Cl 2.00克；MgCl2·6H2O 0.36克；CaCl2·2H2O 0.001克  FeCl3·6H2O 0.001克  MnCl2·4H2O 0.004克；甘油 1.5毫升，其中加入0.1mmol/L的二苯并噻吩(DBT)作硫源。置摇床以150转/分，30℃培养三天后，在琼脂制成的选择性固体培养基上进行划线分离。分离得到的单菌落分别接种于DBT为0.2mmol/L的选择性培养基中，置摇床以150转/分，30℃培养三至五天。取培养液2ml，用1M盐酸调节其PH为1.0，用2ml的正已醇振荡萃取。萃取液用高效液相进行分析。并与HBP的标准品进行对照。结果选择到了一株对二苯并噻吩(DBT)具有专一性脱硫能力的菌株，定名为戈登氏菌为Gordona nitida LSSEJ-1，2002年1月24日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC NO.0700。
实施例2：LSSEJ-1生长细胞的获得与诱导
挑取营养斜面培养的LSSEJ-1菌株，加入25毫升的基础培养基中。培养基的成份：去离子水1000毫升，KH2PO4 2.44克；Na2HPO4·12H2O 14.03克；NH4Cl2.00克；MgCl2·6H2O 0.36克；CaCl2·2H2O 0.001克  FeCl3·6H2O 0.001克MnCl2·4H2O 0.004克；葡萄糖10克，Na2SO4 1mmol/L。30℃，150转/分培养24-48小时后，再将其加入500毫升的基础培养基中，48-72小时后，离心获得菌体。将菌体置于50毫升含有1mmol/L DBT的生理盐水中，摇床混合2-4小时，离心再次取得菌体。
实施例3：LSSEJ-1活性干细胞的获得
挑取营养斜面培养的LSSEJ-1菌株，加入25毫升的基础培养基中。培养基的成份：去离子水1000毫升，KH2PO4 2.44克；Na2HPO4·12H2O 14.03克；NH4Cl2.00克；MgCl2·6H2O 0.36克；CaCl2·2H2O 0.001克FeCl3·6H2O 0.001克MnCl2·4H2O 0.004克；葡萄糖10克，Na2SO4 1mmol/L。30℃，150转/分培养24-48小时后，再将其加入500毫升的基础培养基中，48-72小时后，离心获得菌体。将菌体置于50毫升含有0.1mmol/L DBT的生理盐水中，摇床混合2-4小时，离心再次取得菌体。冷冻真空干燥获得具有活性的干细胞。
实施例4：菌株LSSEJ-1脱除模拟体系DBT中的硫。
十二烷中加入DBT，使浓度达到0.2mmol/L。挑取营养斜面培养的LSSEJ-1菌株，加入25毫升的基础培养基中。培养基的成份：去离子水1000毫升，KH2PO42.44克；Na2HPO4·12H2O 14.03克；NH4Cl 2.00克；MgCl2·6H2O 0.36克；CaCl2·2H2O0.001克FeCl3·6H2O 0.001克MnCl2·4H2O 0.004克；葡萄糖10克，DBT浓度1mmol/L。30℃，150转/分培养24-48小时后，以油水比1∶3将模拟的油相和菌体培养物混合。30℃，150转/分培养24-48小时，硫被全部脱除，其产物是HBP(如图4所示)。
实例5：菌株LSSEJ-1用于加氢脱硫后柴油的深度脱硫
挑取营养斜面培养的LSSEJ-1菌株，加入50毫升的基础培养基中。培养基的成份：去离子水1000毫升，KH2PO4 2.44克；Na2HPO4·12H2O 14.03克；NH4Cl2.00克；MgCl2·6H2O 0.36克；CaCl2·2H2O 0.001克FeCl3·6H2O 0.001克MnCl2·4H2O 0.004克；葡萄糖10克，DBT浓度1mmol/L。30℃，150转/分培养24-48小时后，得到菌悬液。加氢脱硫后柴油20毫升与之混和后，摇床培养24-48小时，柴油中的硫含量由328ppm降至50ppm以下。

Claims (3)

1、一株戈登氏菌，其特征在于：该戈登氏菌为Gordona nitida LSSEJ-1，2002年1月24日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC NO.0700。
2、权利要求1所述的戈登氏菌在脱除含硫化合物中硫元素的应用。
3、按权利要求2所述的戈登氏菌在脱除含硫化合物中硫元素的应用，其特征在于：所述的含硫化合物为有机含硫化合物。
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