CN1197958C

CN1197958C - 小球诺卡氏菌菌株及其在脱除化石燃料中有机硫的应用

Info

Publication number: CN1197958C
Application number: CN 02155682
Authority: CN
Inventors: 姜成英; 邢建民; 罗明芳; 缑仲轩; 刘会洲; 安震涛; 陈家镛
Original assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Current assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Priority date: 2002-12-13
Filing date: 2002-12-13
Publication date: 2005-04-20
Anticipated expiration: 2022-12-13
Also published as: CN1508245A

Abstract

本发明涉及一种小球诺卡氏菌Nocardia globerula R-9，并于2002年7月29日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC NO.0781。该菌株的液体培养、固定化细胞、非生长期静止细胞和粗酶萃取液均可通过氧化断裂C-S键途径脱除含硫有机化合物中的杂环硫。该菌株专一性地脱除燃料中的杂环硫而不破坏有机化合物的C-C骨架，不降低燃料的燃烧热值，具有广阔的工业应用潜力。

Description

小球诺卡氏菌菌株及其在脱除化石燃料中有机硫的应用

技术领域

本发明涉及一种小球诺卡氏菌(Nocardia globerula)新菌株R-9，以及用该菌株作为催化剂断裂含硫有机化合物中C-S键，在脱除化石燃料中有机硫的应用。

背景技术

石油和煤炭是世界上最重要的能源，这些矿物燃料中含有硫化物，燃烧时会产生大量硫氧化物排放到大气环境中，形成酸雨，严重污染环境，破坏生态平衡，直接威胁着地球人类的生存空间。据有关报道，全世界每年排入大气中的SO2近两亿吨，在中国SO₂的排放量达到了1795万吨。同时硫化物的存在还会影响燃料及其产品的外观，腐蚀燃烧及运输设备。为了避免有毒硫化物存在造成的危害，在燃料燃烧前，燃烧过程中或燃烧后必须把燃料中的硫脱除，这已成为全世界急待解决的重大课题。面对日益严峻的环保形势，人们的环保意识不断增强，对于环保的要求变得越来越严格。因此，发达国家越来越重视燃油质量的提高，美国1990年就通过了清洁空气法修正案，环保局提出了使用新配方汽油的要求。从1998年起，美国环保局采用复杂模型，进一步降低汽车排放污染，欧洲议会1998年曾立法要求2000年实施清洁汽油配方。总之，今后10年内，运输燃料(特别是汽油和柴油)的组成和质量指标将会有较大的改观，即要求燃料的H/C比有所上升，而硫及芳烃含量要大大降低。北美和欧洲国家要求到2005年汽油、柴油中硫含量要低于50ppm，2010年汽油、柴油中硫含量要低于30ppm，甚至10ppm。我国是一个发展中国家，石油生产和燃料消耗已成为世界大国之一，SO₂的排放量远远超过世界平均水平。面对日益严峻的环保形势，我国实施了可持续发展战略，大力推行清洁生产，并颁布了一系列环保法规。初步提出将目前柴油硫含量从5000ppm降低到2000ppm以下，部分大城市车用柴油中硫含量低于500ppm的要求，因此，开发和加强高效、低成本的燃料燃前脱硫技术，将对我国实施的环境保护和可持续发展战略产生积极而深远的影响。

降低石油、石油产品和煤炭中含硫量的方法有物理、化学和生物法。物理和化学法的燃前脱硫技术能有效地脱除燃料中的无机硫，但是脱除有机硫的效果很差，因为矿物燃料中含有的有机硫化物成分复杂，大部分是杂环化合物(如图1)，其中的C-S化学共价键十分牢固，用常规的物理和化学方法无法有效去除。目前常用的加氢催化脱除燃料中有机硫(HDB)技术必须在高温(＞300℃)，高压(＞100atm)，加氢及金属催化剂存在的苛刻条件下脱硫，操作费用较高，而且金属催化剂易受底物硫原子周围取代基空间位阻影响，所以对于燃料中大量存在的甲基取代苯并噻吩、二苯并噻吩等结构复杂的杂环硫化物的脱除率较低。(e.g.Houalla，M.，Broderick，D.H.，Sapre，A.V.，Nag，N.K.，de Beer，V.H.J.，Gates，B.C.，Kwart，H.J.Catalt.，61，523-527(1980)).事实证明，在大量轻汽油和柴油中，仍存在着多种二苯并噻吩的烃基取代物(e.g.Kabe，T.，Ishihara，A.andTajima，H.Ind.Eng.Chem.Res.，31，1577-1580(1992))。低硫含量的要求使得HDS过程反应条件越来越苛刻，设备和操作费用增高，同时伴随着烯烃饱和反应，造成燃料燃烧值损失。因此，迫切需要寻找一种能从石油或石油产品中脱除硫却不造成石油燃烧值降低的，经济可行的新工艺。

生物催化脱硫(BDS)方法选择性高，副反应少，反应条件温和，设备简单，运行费用低，投资少，对燃料热值影响小，不造成二次污染的优点使其成为了渐被瞩目的清洁石油燃料生产技术，有希望成为传统脱氢过程的辅助途径来进行含硫燃料的精加工，使它们达到要求水平，所以引起了众多科学家和工程师的兴趣。

目前，已分离了多种能脱有机硫的微生物。其中好氧菌或厌氧菌都能代谢柴油中的主要难处理化合物二苯并噻吩(DBT)，如硫酸盐还原细菌，Desulfovibrio(去磺弧菌属)desulfuricans M6，厌氧地降解DBT，主要的产物是联苯，降解率是42％。据报道，其它的硫酸盐还原细菌也能厌氧地将DBT转化为联苯，但转化率极低。厌氧过程因为有不需要氧的加入，可以直接应用到油井中的优点具有较大的吸引力，但到目前为止还未发现能用于实际石油脱硫体系的高效厌氧微生物。

通过好氧途径代谢DBT的微生物有假单胞菌(pseudomonas sp.)、红球菌(Rhodococcus sp.)、棒杆菌(Corynebacterium sp.)及短杆菌(Brevibacterium sp.)等。通过对各种微生物代谢机制的研究，得知微生物的脱硫途径主要有三种：一种是专一氧化DBT的碳架(C-C键)，生成水溶性的含硫碳氢化合物，C-S键依然保留在化合物中(如图2左边的代谢途径所示)，通过油水分离将含硫降解产物从石油中脱除。这一途径是在从土壤中分离出的假单胞菌(Pseudomonas)，拜叶林克氏菌(Beijerinckia)及不动杆菌(Acinetobacter)和根瘤菌(Rhizobium)的混合培养中发现的，代谢过程中DBT的一个苯环在断裂前先变成为羟基化合物，硫原子未被释放，顺式4-[2-(3-羟基)-噻吩基]-2-氧-3-丁烯酸(tran-HTOB)和3-羟基-2-甲酰基苯噻吩(HFBT)在培养基中积累，其它的细菌如P.eruginosa ERC-8，Beijerinckia sp.，Pseudomonas、Rhizobium melioti和Pseudomonas sp.C18等也有这样的代谢途径。中国科学院微生物研究所的钟慧芳研究小组也曾分离到将DBT分解为水溶性有机硫化物的菌株，可脱除煤中有机硫22.2％～32.0％，(钟慧芳等微生物学报35(2)：130-135，1995)。这种类型的代谢，会由于含碳结构脱除，而造成燃料能量的损失。

另一种途径以DBT为唯一碳源、硫源、能源，直接氧化DBT的C-S键生成苯甲酸盐(如图2右边的代谢途径所示)，已经报道的菌种有短杆菌(Brevibacterium)和节杆菌(Arthobacter)，它们将DBT-亚砜，DBT-砜脱硫最终生成苯甲酸脂和硫酸盐，短杆菌(Brevibacterium)可以脱去粗油中DBT的硫而不攻击非硫碳氢化合物。这一代谢途径中，不只脱除了杂环化合物中的硫，也破坏了烃的碳骨架，同样引起了燃料热值的损失。

第三条途径中，微生物专一氧化断裂DBT的C-S键，而不打开C-C键，以特有的酶系统将硫从杂环中专一性地脱下来，不引起燃料热值的损失。Atlantic Research Corporation最早报道微生物可从DBT脱去硫而不改变烃的结构。1989年Kilbane等分离出了红色红球菌(Rhodococcuserythropolis)IGTS8(以前称为R.rhodochrous)，该菌得到了最广泛的研究，特别是近年来，通过基因工程方法将该类微生物的脱硫基因(dsz)进行了克隆、表达、测序，并成功地改造和构建了重组菌，提高了脱硫效率，使其具有更加广阔的工业应用前景(Denome S.A.et al.J Bacteriol.176(21)：6707-6716，1994)，而且提出了DBT的脱硫途径：该途径经过DBT5-亚砜(DBTO)，DBT 5-砜(DBTO₂)和2-羟基联苯基-2-亚磺酸盐(HBPS)，最终将DBT代谢为2-HBP，因此这一途径也称“4S”途径(如图3)。专一脱硫的“4S”途径是目前比较理想，引起大家广泛关注的研究领域。继R.erythropolis IGTS8之后，又报道了其它几种细菌有相似的代谢途径，如棒杆菌属细菌(Corynebacterium)SY1，R.erythropolis D-1，土壤杆菌属(Agrobacter)MC501，分枝杆菌属(Mycobaterium)G3及黄单胞菌属(Xanthomonas)。

我国在石油微生物脱硫研究方面还处于起步阶段。尤其是对于燃料中含硫有机化合物中硫的专一性脱除的研究至今未见系统研究的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从自然界中分离得到的具有专一性催化断裂有机化合物中C-S键能力的小球诺卡氏菌菌株及其在脱除化石燃料中有机硫的应用，该菌具有脱硫能力强，可利用底物范围广等优点。

本发明提供的小球诺卡氏菌(Nocardia globerula)为Nocardiagloberula R-9，于2002年7月29日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC NO.0781。

该Nocardia globerula R-9菌株可从含油污水处理池中的耗氧活性污泥、油井周围被油污染的土壤以及含硫量较高的煤矿矿坑周围土样中分离得到的。取样品5克悬浮于无硫基础培养基(培养基组成：1000ml水，KH₂PO₄，2.44g；Na₂HPO₄·12H₂O 14.03g；NH₄Cl，2.00g；MgCl₂·6H₂O，0.36g；CaCl₂·2H₂O，1；FeCl₃1mg；MnCl·4H₂O，4mg；CuCl₂，0.755mg；丙三醇0.8ml或葡萄糖1-3g，20分钟121℃高压灭菌)中，置摇床中混合30分钟后，静置，吸取上层悬浮液转接到营养培养基(组成g/g：NaCl 1.0％；酵母浸膏粉0.5％，胰蛋白胨1％，20分钟高压灭菌)中，置摇床中以150转/分培养24小时。吸取5ml菌液加入100ml灭菌基础培养基中，再在其中加入二苯并噻吩DBT-乙醇溶液使培养液中DBT浓度为0.1mM。在摇床中以150转/分培养2-3天后在喷有DBT的琼脂培养基上划线分离。分离得到的单菌落分别接种于含DBT浓度为0.2mM的基础培养基中，在摇床中以150转/分30℃作用2-3天。经生物作用后的样品用1N盐酸调节pH为1.0，在5000转/分下离心20分钟，上清液用等体积的乙酸乙酯振荡萃取。萃取有机相回流浓缩至1ml，进行GC-MS分析。挑选产物中有二苯并噻吩DBTO₂及羟基联苯的菌株进行优良菌株的逐步驯化。结果，选择到了对二苯并噻吩具有专一性脱硫能力的Nocardia globerula R-9菌株，其脱硫产物为不含硫的羟基联苯。

本发明提供的Nocardia globerula R-9菌株特征如下：

1.其细菌学形态特征：菌株基内菌丝体有横隔，并从菌落中央开始断裂成越来越小的节段或圆形及卵圆形小体，菌落边缘有初级分枝，形成未断裂的波曲形的基内菌丝体，无气生菌丝体。断裂小体表面光滑。

2.在各种培养基上的的培养特征：

该菌株适宜在中性及极弱酸性培养介质中常温培养，在五种培养基上28℃培养2-5天后进行观察，其培养特征见表1；

表1：

培养基气生基内菌丝体色素

菌丝呈色质地

葡萄糖天门冬素琼无微粉黄色膏状无

脂

桑塔斯琼脂无污米黄色由膏状变为粘液状无

营养琼脂无淡粉黄色膏状无

无机盐淀粉琼脂无蛋壳黄色老龄变为粘液状无

马铃薯甘油琼脂无米黄色幼龄膏状后变为粘液状无

3.细胞壁化学组份：

按Hasegawa T.等快速薄层层析法进行全细胞水解液分析的结果表明：R-9细胞壁化学组分含有meso-DAP(二氨基庚二酸)和甘氨酸。细胞水解液含有特征性半乳糖和阿拉伯糖。细胞壁化学组成属于IV型。

4.生理生化特征；

从D-葡萄糖、D-果糖、甘露糖、海藻糖、丙三醇、山梨醇产酸。可利用D-葡萄糖、D-果糖、甘露糖、海藻糖、丙三醇、甘露醇、山梨醇、丙酸钠、丁酸钠、苹果酸钠、丙酮酸钠作为唯一碳源。明胶不液化。牛奶不胨化。硝酸盐不还原。水解淀粉。吲哚反应阴性。生长温度10-40℃；生长pH范围5-10；对青霉素、溶菌酶敏感。不产生黑色素。不产生H₂S。见表2；

表2：

实验名称结果利用糖产酸结果

明胶液化 - D-葡萄糖 +

牛奶凝固 + 麦芽糖 -

牛奶胨化 - D-果糖 +

淀粉水解 + 甘露糖 +

硝酸盐还原 - 甘露醇 -

吲哚试验 - 山梨醇 +

纤维素上生长 - 海藻糖 +

H₂S反应 - 甘油 +

黑色素产生 - 蜜二糖 -

丙酸钠 + 棉子糖 -

丁酸钠 +

苹果酸钠 -

5.16S rDNA的序列：

收集适量培养48h的菌体(12 000r/min)于1.5mL离心管中，用溶菌酶缓冲液充分悬浮菌体，通过细胞裂解，酚/氯仿/异戊醇及氯仿抽提，无水乙醇沉淀搅丝，将搅起的DNA丝溶于TE缓冲液，加Rnase除去蛋白，再用酚/氯仿/异戊醇及氯仿抽提，上清液中加3M NaAc及无水乙醇沉淀收集DNA，吸出乙醇，用TE缓冲液溶解DNA，用于PCR扩增。

用于16S rDNA的PCR反应的引物为一通用引物。PCR反应体系为：PCR程序为：94℃预变性2min，94℃1min，56℃1min，72℃2min；第二步循环29次，72℃10min，60℃10min，室温放置。PCR产物经纯化后，由上海生工技术有限责任公司完成。获得菌株16S rDNA的序列，共510bp(见图8)，Genebank登录号为AF543313。

参照《Bergy’s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol.VIII的内容，根据形态特征与细胞壁化学组份定属的原则，证明菌株R-9为革兰氏阳性菌，抗酸染色阴性。菌株基内菌丝体有横隔，并从菌落中央开始断裂成越来越小的节段或圆形及卵圆形小体，菌落边缘有初级分枝，形成未断裂的波曲形的基内菌丝体，无气生菌丝体。断裂小体表面光滑。细胞壁化学组分含有meso-DAP(二氨基庚二酸)和甘氨酸细胞水解液含有特征性半乳糖和阿拉伯糖。细胞壁化学组成属于IV型。结合各项生理生化特征及16S rDNA的序列确定该菌株为小球诺卡氏菌(Nocardia globerula)。

本发明的小球诺卡氏菌(Nocardia globerula)R-9菌株既可以在营养培养基中培养，也可在含硫源(MgSO₄，二甲基亚砜，DBT或其他有机硫化合物)的基础培养基中培养。应用前需在有机硫源存在的条件下驯化。菌株在25-35℃之间一适当温度下，进行中性好氧培养。

本发明提供的Nocardia globerula R-9菌株脱硫能力强，脱硫底物范围广，适用于化石燃料(如煤炭，石油及其产品)中有机杂环硫的脱除。

Nocardia globerula R-9菌株，可以用新鲜培养的生长期菌种或有脱硫活性的冷冻非生长期静止细胞及其变异菌株作脱硫生物催化剂，也可用该菌株或其变异菌株的细胞中得到的有脱硫活性的一个或几个酶作脱硫生物催化剂，还可用吸附或包埋在载体上的固定化细胞作脱硫生物催化剂。

本发明提供的Nocardia globerula R-9菌株可作为催化剂选择性断裂含硫有机化合物中C-S键，脱除硫原子，尤其适用于化石燃料(如煤炭，石油及其产品)中有机杂环硫的脱除；该菌株通过专一性‘4S’途径脱除燃料中有机化合物中的杂环硫，而不破坏有机化合物的C-C骨架，不降低燃料的燃烧热值，解决了已有石油加氢工艺处理成本高、不易于脱除杂环化合物中硫等缺点。该菌广泛存在于原油污染的环境中，具有许多作为工业应用菌株的优良特性，耐有机溶剂的能力强，因此菌株具有广阔的工业应用潜力。

附图说明

图1为燃料中的几类含硫有机化合物的结构图

图2为脱硫的C-C键断裂途径

图3为脱硫的C-S键断裂途径，既′4S′途径

图4为多通道轻重相反应器的结构图

其中：1反应器上端盖 2进气孔 3进样孔

4电加热管 5反应器外筒 6轻相取样孔

7进气管 8重相取样孔 9垫圈

10螺杆 11螺母 12法兰

13测温孔 14温度计 15圆形环

16轻相分布管

图5为十六烷、乙醇及二甲基酰胺中二苯并噻吩降解速率图

图6A为DBT降解过程中中间产物及终产物的气相色谱图

图6B为HBP质谱(t＝15.23)

图6C为DBTO₂质谱(t＝27.07)

图7为DBT降解途径

图8为本发明菌株16S rDNA的序列

具体实施方式

实施例1：

筛选Nocardia globerula R-9菌株，其步骤如下：

从中国大港石油化工公司炼油厂污水处理池中取好氧活性污泥样品，取样品5克悬浮于无硫基础培养基(培养基组成：1000ml水，KH₂PO₄，2.44g；Na₂HPO₄·12H₂O 14.03g；NH₄Cl，2.00g；MgCl₂·6H₂O，0.36g；CaCl₂·2H₂O，1；FeCl₃1mg；MnCl·4H₂O，4mg；CuCl₂，0.755mg；丙三醇0.8ml或葡萄糖1-3g，20分钟121℃高压灭菌)中，置摇床中混合30分钟后，静置，吸取上层悬浮液转接到营养培养基(组成g/g：NaCl 1.0％；酵母浸膏粉0.5％，胰蛋白胨1％，20分钟高压灭菌)中，置摇床中以150转/分培养24小时。吸取5ml菌液加入100ml灭菌基础培养基中，再在其中加入二苯并噻吩DBT-乙醇溶液使培养液中DBT浓度为0.1mM。在摇床中以150转/分培养2-3天后在喷有DBT的琼脂培养基上划线分离。分离得到的单菌落分别接种于含DBT浓度为0.2mM的基础培养基中，在摇床中以150转/分30℃作用2-3天。经生物作用后的样品用1N盐酸调节pH为1.0，在5000转/分下离心20分钟，上清液用等体积的乙酸乙酯振荡萃取。萃取有机相回流浓缩至1ml，进行GC-MS分析。挑选产物中有二苯并噻吩DBTO₂及羟基联苯的菌株进行优良菌株的逐步驯化。

结果，选择到了对二苯并噻吩具有专一性脱硫能力的Nocardiagloberula R-9菌株，其脱硫产物为不含硫的羟基联苯。

实施例2：

制备Nocardia globerula R-9菌株的细胞液体培养物：

挑取营养琼脂斜面培养的小球诺卡氏Nocardia globerula R-9菌株一铂环接种在装有灭菌的试管中，加入已灭菌的DBT-乙醇溶液，使DBT浓度为0.1mmol，于30℃，150转/分下在生物培养箱中培养16-24小时。吸取培养获得的菌液1ml接种在装有100ml基础无机盐培养基(pH＝7.0)的300ml锥形瓶中，再加入已灭菌的DBT-乙醇溶液，使DBT浓度为0.1-0.5mmol。将该锥形瓶放置在生物培养箱中于30℃，150转/分培养48小时，获得Nocardia globerula菌株R-9细胞的液体培养液。

实施例3：

制备Nocardia globerula菌株R-9的非生长期静止细胞液：

将通过实施例2的方法所获得的菌株R-9细胞的液体培养液离心(8000转/分)10分钟，倒去上层悬浮液。用适量生理盐水洗涤离心沉淀3次，将所得离心沉淀物悬浮于生理盐水中，然后冷冻保藏在冰箱中，即制得Nocardiagloberula菌株R-9的非生长期静止细胞液。

实施例4：

制备Nocardia globerula菌株R-9的粗酶萃取液：

将通过实施例3的方法所获得的菌株R-9的离心细胞冷冻干燥，冷冻干燥后的细胞先在匀浆器中研磨，然后在20Hz下超声破碎，加入适量生理盐水后以8000转/分离心10分钟，弃去离心沉淀的固体残渣，其上层粗酶离心萃取液即为制得的Nocardia globerula菌株R-9的粗酶离心萃取液。

实施例5：

制备Nocardia globerula菌株R-9的固定化细胞：

物理吸附：将清洗、干燥、灭菌后的硅藻土加入灭菌培养介质，接种新鲜培养的Nocardia globerula菌株R-9，常温培养；

凝胶包埋：制备海藻酸钠溶液，灭菌，接种新鲜培养的Nocardiagloberula菌株R-9，把混合物分散，加入反离子溶液(钙盐或铝盐)，形成包有Nocardia globerula株菌R-9的固定化细胞的均匀、球形、有高度微孔结构的凝胶。

实施例6：

本发明在脱除二苯并噻吩(DBT)中有机硫的应用及脱硫途径：

1)将已灭菌的DBT配成0mmol/L的DBT-二甲基酰胺(也可以是乙醇)储液；

2)在100ml锥形瓶中依加入灭菌培养基30ml、DBT-二甲基酰胺储液0.06ml，使锥形瓶中DBT的浓度为0.2mmol/L；

3)将实施例2获得的Nocardia globerula菌株R-9的细胞培养液，或实施例3获得的Nocardia globerula菌株R-9的非生长期静止细胞液，或实施例4获得的Nocardia globerula R-9菌株的粗酶萃取液(加还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH)3ml或实施例5获得的Nocardia globerula菌株R-9的固定化细胞加入上述步骤(2)锥形瓶中，将锥形瓶放置在生物培养箱中，于30℃，150转/分培养，隔12小时取样测定。

实施例2的Nocardia globerula菌株R-9的细胞培养液作为催化剂得到的DBT降解通过高效液相色谱测定，降解结果见图5，图5中的二甲基酰胺和乙醇代表的曲线即表示本方法处理DBT-二甲基酰胺或DBT-乙醇得到的降解结果图。降解中间产物及产物通过高效液相色谱及气相色谱/质谱联用仪确定，降解中间产物及产物的质谱图见图6，推测其降解途径见图7。

实施例7：

本发明在脱除模拟柴油体系中DBT硫的应用：其步骤如下：

1)将要处理的液体油品(十二烷或十六烷加二苯并噻吩)过滤灭菌，通灭菌空气(或氧气)使油品氧张力增加。

2)将30mL含氧液体油品从如图4所示的反应器进样孔3引入多通道轻重相反应器，同时加入270ml灭菌水相(无机盐培养基)和27mL脱硫生物催化剂；生物催化剂可以是Nocardia globerula R-9菌株的生长期细菌液，也可以是Nocardia globerula R-9菌株的非生长期细胞液或从细胞中萃取得到的酶液；反应器内径为75mm，高120mm，体积529.9ml，有效容积300ml ml；多通道轻相分布器高30mm，上端圆形环16外径73mm，内径58mm，圆形环上凹槽14外径70mm，内径61mm，多通道轻相分布管17管径为30mm。

3)将进样孔3密封，反应器置于摇床培养箱中，空气经过滤灭菌后由上部通气管2引入，摇床温度控制为30℃，调节摇床转速使多通道轻重相反应器的上层轻油相18高于圆形环16，溢于凹槽14中，通过轻重相分布管17到达反应器底部，呈油珠冒出，由于比重小，又会由反应器底部浮至反应器上方，从而完成轻油相与重相中微生物发生反应的过程。

4)液体油品经生物脱硫催化剂作用后，从反应器外管上部轻相取样孔6吸取脱硫后的液体油品，从下部重相取样孔8放出剩余的生物催化剂及培养液。

5)反应后剩余的含有生物催化剂的液体产物经离心分离、洗涤，在适宜的条件下再生。

实施例3获得的Nocardia globerula菌株R-9的非生长期静止细胞液作为催化剂加入十六烷-二苯并噻吩中，得到的降解速率如图5所示。

实施例8：本发明在脱除加氢脱硫后柴油中的硫的应用：

将实施例7中的模拟柴油系换为过滤灭菌的不同加氢脱硫后的柴油，其他操作步骤和方法同实施例7。生物催化剂作用前后柴油中硫含量的气相色谱-原子发射光谱(GC-AED)检测结果见表3。由表中结果可以看出，本发明提供的菌株可以深化脱除加氢柴油中的杂环有机硫，对于总硫含量为925mg/L的加氢柴油，该菌株可以脱除41％的硫，其中DBT被完全脱除，而对于总硫含量为261mg/L的加氢柴油，该菌株可以脱除65％的硫，其中DBT也被完全脱除。

表3

硫含量，mg/L

杂环硫化合物

柴油样品1 生物脱硫柴油样品2 生物脱硫

二苯并噻吩 2.5 --- --- ---

4-乙基二苯并噻吩 17.6 14.8 4.1 1.9

4，6-二甲基二苯并 85.0 79.3 45.9 16.9

噻吩 (7％) (63％)

2，4-二甲基二苯并 47.5 41.3 10.4 4.1

噻吩

2，8-二甲基二苯并 63.5 56.6 12.5 4.7

噻吩

1，2-二甲基二苯并 45.0 40.8 24.4 7.6

噻吩

2，4，6-三甲基二苯并 52.2 31.3 17.3 6.3

噻吩

C₃-二苯并噻吩 49.2 40.9 13.5 7.2

C₃-二苯并噻吩 51.9 18.1 10.2 4.8

总硫 925 545 261 91

总硫脱除率％ 41％ 65％

Claims

1.一种小球诺卡氏菌菌株(Nocardia globerula)R-9，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0570。

2.权利要求1所述的小球诺卡氏菌菌株(Nocardia globerula)R-9在在脱除含硫化石燃料中有机硫的应用。

3.如权利要求2所述的小球诺卡氏菌菌株(Nocardia globerula)R-9的应用，其特征在于采用(Nocardia globerula)R-9菌株的细胞液体培养物脱除含硫化石燃料由的硫。

4.如权利要求2所述的小球诺卡氏菌菌株(Nocardia globerula)R-9的应用，其特征在于采用(Nocardia globerula)R-9菌株的非生长期静止细胞脱除含硫化石燃料中的硫。

5.如权利要求2所述的小球诺卡氏菌菌株(Nocardia globerula)R-9的应用，其特征在于采用(Nocardia globerula)R-9菌株的粗酶萃取液脱除含硫化石燃料中的硫。

6.如权利要求2所述的小球诺卡氏菌菌株(Nocardia globerula)R-9的应用，其特征在于采用(Nocardia globerula)R-9菌株的固定化细胞脱除含硫化石燃料中的硫。

7.如权利要求2所述的小球诺卡氏菌菌株(Nocardia globerula)R-9的应用，其特征在于含硫化石燃料为煤炭或石油。