CN1644678A - 一株可高效降解噻吩硫的古地分枝杆菌 - Google Patents

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CN1644678A CN 200410024513 CN200410024513A CN1644678A CN 1644678 A CN1644678 A CN 1644678A CN 200410024513 CN200410024513 CN 200410024513 CN 200410024513 A CN200410024513 A CN 200410024513A CN 1644678 A CN1644678 A CN 1644678A
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李福利
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马翠卿
郑媛
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Abstract

本发明公开了一株可高效降解噻吩硫的古地分枝杆菌，名为Mycobacterium goodii SDU－B，已于2004年1月13日保藏于“德国微生物菌种保藏中心”，其保藏号为DSM16135；该菌株不能运动，不产芽孢，形态为棒杆状，长2μm，直径1μm，菌落颜色为金黄色，结核菌脂酸和脂肪酸分析表明，该菌株与Mycobacterium goodii DSM 44492非常相似；本发明还公开了该菌株的细胞培养液通过氧化断裂C－S键高效脱除石油及其产品中的含硫化合物中的硫的应用方法。

Description

一株可高效降解噻吩硫的古地分枝杆菌
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说涉及一株新分离的可高效降解噻吩硫的古地分枝杆菌。
背景技术
化石燃料煤和石油中所含有的有机硫和无机硫是环境的重要污染源，这些硫化物燃烧时排放出大量的二氧化硫等毒性气体，由此造成大面积酸雨，严重污染大气和水源，破坏生态平衡，危害人类生存。多年的持续开发使得现存含硫量较低的化石燃料越来越少。随着能源危机的逐步加剧，高硫化石燃料的开采成为必然。高硫化石燃料必须预先经过脱硫处理才能进一步使用。物理的和化学的脱硫方法成本巨大，而微生物脱硫工艺由于操作压力、温度低，运转成本少，具有广阔的前景。化石燃料中含有的有机硫化合物成分复杂，大部分是杂环化合物，其中的C-S化学共价键十分牢固，用一般常规的物理和化学方法无法高效地除去有些杂环中的有机硫。
2000年夏天，我国开始实施新的燃油标准。根据新标准的规定，汽油中硫化物的含量不得超过800ppm(part per million，百万分之，质量百分比)。此项标准自2000年7月1日首先在北京、广州和上海等城市实施，到2003年1月1日，国内其它地区也将执行这一标准。与旧标准中1200ppm的含硫量相比，新标准更加严格。与此同时，最新的《世界汽车燃油规范》要求使用“无硫”或硫含量为5～10ppm的汽油和柴油。目前，我国仍然缺少有关低硫柴油的标准。据估计，现今国内使用的大部分柴油的含硫量都在3000ppm左右。这一现象引起了人们的广泛关注，因为最新的环保柴油和汽油发动机都需要使用含硫量低的燃油，三元催化剂和微粒过滤装置也会因硫化合物过多而中毒失效。如何降低化石燃料中的硫含量成为各国研究者关注的焦点。
现今主要的燃油脱硫方法是物理化学及生物处理这两种方法。物理化学的脱硫方法(Hydrodesulfurization，简称HDS)是脱除燃料油中硫的主要的方法，HDS通过催化过程，将有机硫转化成H2S气体，反应需要1033.5～20670kpa(千帕斯卡)的压力和290～450℃的高温。大部分的无机硫及沸点较低的有机硫化合物在此过程中很容易的脱去，但是沸点较高的杂环类含硫化合物却很难脱除。
生物脱硫方法(Biodesulfurization，简称BDS)条件温和，设备简单，且具有高度的专一性，能够脱除燃料中杂环含硫化合物中的有机硫且不损失燃料的热值，是一种很有前途的脱硫方法，应用前景十分广泛。该方法具有成本廉价、高度专一性、反应的条件温和等一系列的优点已被许多厂家所关注，很多国内外的研究机构也对BDS方法进行了深入的研究。
最近几年，发现能够专一性降解苯并噻吩(Benzothiophene，简称BT)的菌株，主要有戈登氏菌213E(Gordonia)，类芽孢杆菌A11-2(Paenibacillus)，红球菌T09(Rhodococcus)，根瘤菌KT55(Sinorhizobium)及红球菌KT462。它们的降解途径已经分析的较为清楚(如图1)。其中Paenibacillus sp.A11-2，Sinorhizobium sp.KT55和Rhodococcus KT462菌株的BT降解途径和二苯并噻吩(Dibenzothiophene，简称DBT)的“4S”降解途径比较类似。而Gordonia sp.213E和Rhodococcus sp.T09菌株BT降解途径和上面的类似，只不过降解BT的终产物不是氧-羟基苯乙烯(o-hydroxystyrene)，而是2-(2’-羟苯基)乙醛(2-(2‘-hydroxyphenyl)ethan-1-al)。
目前，经检索能够具有同时降解二苯并噻吩和苯并噻吩的能力的古地分枝杆菌还未见报道。
技术方案
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一株新分离的可高效降解噻吩硫的古地分枝杆菌，该菌具有可同时降解二苯并噻吩和苯并噻吩的能力，这种能力在古地分枝杆菌中是首次发现。
本发明涉及的古地分枝杆菌为Mycobacterium goodii SDU-B，已于2004年1月13日保藏于德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany)，其保藏号为DSM 16135。
上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135不能运动，不产芽孢，形态为棒杆状，长2μm，直径1μm，在MAMD培养基上以二苯并噻吩作为唯一硫源培养36小时后，菌落颜色为金黄色，由德国微生物菌种保藏中心所作的鉴定表明，上述Mycobacteriumgoodii SDU-B DSM 16135含有结核菌脂酸，并且上述结核菌脂酸的高效液相层析洗脱特征与Mycobacterium goodii DSM 44492非常相似，德国微生物菌种保藏中心所作的鉴定表明，上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135的脂肪酸图谱与Mycobacteriumgoodii DSM 44492非常相似，上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135不含有二级醇。
上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135可以在基本无机盐培养基(MAMD)上以无机硫，如Na2SO4，或有机含硫化合物如二甲基亚砜和噻吩类化合物作为唯一硫源生长，也可以在LB培养基上生长；
上述基本无机盐培养基配方如下，1升蒸馏水中含：10克葡萄糖，0.5克KH2PO4，4克K2HPO4，1克NH4Cl，2mL质量百分比为1％的CaCl2，2mL质量百分比为10％的MgCl2·6H2O，200μL质量百分比为1％的FeCl3，200μL质量百分比为5％的NaCl，5mL质量百分比为1％的酵母粉，200μL的维生素混合液，5mL的金属离子混合液，加蒸馏水到1升，115℃条件下灭菌20分钟；固体基本无机盐培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.6％的琼脂粉，115℃条件下灭菌20分钟；其中微量元素混合液组成为：1升蒸馏水中含：ZnCl2 0.5g，FeCl2 0.5g，MnCl2·4H2O 0.5g，Na2MoO4·2H2O0.1g，CuCl2·2H2O 0.05g，Na2WO4·2H2O 0.05g，HCl 120mmol/L，维生素混合物的配方为，每升蒸馏水含有：400mg泛酸钙(Calcium pantothenate)，200mg肌醇(Inositol)，400mg尼克酸/烟酸(Niacin)，400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)，200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)，0.5mg VB12(Cyanocobalamin)；
上述LB培养基配方如下，1升蒸馏水中含：10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，固体LB培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.6％的琼脂粉，121℃条件下灭菌15分钟。
上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135的生理生化特征，请参见说明书附图5，附图6和附图7。
本发明的菌株Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135的16S rDNA基因序列长度为1384bp，序列如下：
ACATGCAAGTCGAACGGAAAGGCCCTTCGGGGTGCTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGAATATACCCTGCTGGTCGCATGGCCTGGTGGGGGAAAGCTTTTGCGGTGTGGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCACAGACGAAGCGTAAGTGACGGTATGTGCAGAAGAAGGACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTCCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGTTTGTCGCGTTGTTCGTGAAAACTCACAGCTTAACTGTGGGCGTGCGGGCGATACGGGCAGACTAGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTCCTTCCTTGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATGCACAGGACGCCCGTAGAGATATGGGTTCCCTTGTGGCCTGTGTGCAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTCATGTTGCCAGCACGTGATGGTGGGGACTCGTGAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCGATGCCGTGAGGTGGAGCGAATCCTTTCAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGTGGGA
通过在美国生物工程信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)查阅国际相关的基因库，本发明的菌株SDU-B其中有关菌株的16S rDNA基因序列虽有相似性(如表1所示)，但却不完全相同，说明本菌株是首次分离鉴定。
表1  菌株SDU-B的16S rDNA与GenBank提交菌株序列相似性比较
登陆路径及菌相关菌株名称                              分值(Bits)  相似性
gi|30065752|gb|AY177352.2|   Mycobacterium sp.I5      1379        99％
gi|2072383|emb|Y12872.1|MSY12872      Mycobacterium goodii                    1326    99％
gi|23477179|emb|AJ509013.1|MSP509013  Mycobacterium sp.CF1                    1326    99％
gi|27527623|emb|AJ536041.1|MSM536041  Mycobacterium smegmatis                 1317    98％
gi|44526|emb|X52922.1|MSM16SRN        Mycobacterium smegmatis                 1311    98％
gi|707597|emb|Y08453.1|MS16S23S5      M.smegmatis                             1311    98％
gi|4107272|emb|AJ131761.1|MSM131761   Mycobacterium smegmatis                 1311    98％
gi|2072189|gb|U94745.1|MDU94745       Mycobacterium duvalii                   1300    98％
gi|1226011|emb|X93026.1|MCRO1016S     Mycobacterium sp.                       1296    98％
gi|18447869|emb|AJ429044.1|MMO429044  Mycobacterium                           1291    98％
moriokaense
gi|44274|emb|X52932.1|MFL16SRN        Mycobacterium flavescens                1284    98％
gi|19387302|gb|AF480575.1|            Mycobacterium acapulcensis              1279    98％
gi|45771901|emb|AJ634379.1|           Mycobacterium confluentis               1278    98％
gi|19387305|gb|AF480578.1|            Mycobacterium flavescens strain ATCC    1277    98％
23008
gi|27650897|emb|AJ536100.1|MEL536100  Mycobacterium elephantis                1275    98％
gi|18447871|emb|AJ429046.1|MPU429046  Mycobacterium pulveris                  1273    98％
gi|23955535|gb|AF544639.1|            Mycobacterium vaccae                    1272    97％
gi|23955534|bg|AF544638.1|            Mycobacterium vaccae                    1272    97％
gi|14583102|gb|AF385898.1|            Mycobacterium elephantis                1271    98％
gi|1226013|emb|X93028.1|MCRO1716S     Mycobacterium sp                        1265    98％
进一步通过软件在美国生物工程信息中心使用BLASTN程序比对，对给出的序列使用Vector NTI软件构建进化树，SDU-B和古地分枝杆菌位于同一个分支上，鉴定SDU-B为Mycobacterium goodii，如附图8所示。
上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135在脱除石油及其产品中有机硫化合物的硫中的应用。
上述脱硫的应用方法中，Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135脱除含硫有机化合物中的硫，是通过氧化断裂C-S键的途径实现的。
上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135的应用方法有：(1)用二苯并噻吩为唯一硫源培养，收集菌体后用于化石燃料的脱硫；(2)用硫酸钠为唯一硫源培养，收集菌体，直接用DBT诱导后用于化石燃料的脱硫；(3)用冷冻干燥的菌体细胞进行脱硫；(4)用该细胞的片段或者细胞提取液进行脱硫；(5)用该菌株中提纯的生物活性物质进行脱硫；(6)该菌进一步诱变处理后进行脱硫。
上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135可有效降解二苯并噻吩(DBT)和苯并噻吩(BT)及它们的甲基衍生物。上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135降解苯并噻吩后的中间产物和终产物的质谱图请参见说明书附图2，附图3和附图4。上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135尤其可以脱除以二苯并噻吩(DBT)为代表的有机含硫化合物中的硫元素。在脱除以二苯并噻吩(DBT)为代表的一大类化石燃料中的含硫化合物时，专一性的攻击C-S键，对C-C键不起作用，保留的化合物的碳架结构。
上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135在MAMD培养基中以二甲基亚砜、4，6-二甲基-二苯并噻吩、DBT-砜、二苯并噻吩、4-甲基-二苯并噻吩、5-甲基-苯并噻吩、3-甲基-苯并噻吩、噻吩乙酸、噻吩羧酸、噻吩等含硫化合物作为硫源时生长良好。
上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135的生长和对不同硫源的利用情况见表2。
表2 Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135对不同硫源的生长、利用情况
                                生长情况       含硫化合物
 含硫化合物*
                                (OD620)        的降解率(％)
对照                            0.75a           NTc
二甲基亚砜                      11.50a          NT
4，6-二甲基-二苯并噻吩          6.73a           45.8
DBT-砜                          7.75a           56.6
二苯并噻吩                      2.25a           74.4
4-甲基-二苯并噻吩               2.38b           61
苯并噻吩                        2.46a           NT
5-甲基-苯并噻吩                 4.63a           NT
3-甲基-苯并噻吩                 6.13a           NT
噻吩乙酸                        8.85a           NT
噻吩羧酸                        4.83a           NT
噻吩                            1.04a           NT
*所用培养基为MAM培养基，所有含硫化合物的浓度均为0.5mM
a以不同的含硫化合物作为硫源，在45℃下培养古地分枝杆菌SDU-B，培养时间为24小时。
b以不同的含硫化合物作为硫源，在45℃下培养古地分枝杆菌SDU-B，培养时间为48小时。
c代表没有检测。
上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135具有专一性的有效脱除含硫化合物的功能，特别是脱除石油及其产品中的硫的功能。该菌的休止细胞、固定化细胞和破碎的菌体片段以及细胞粗酶液和分离纯化的酶组分同样也具有专一性的有效脱除含硫化合物的功能。
附图说明
本发明涉及的一株可高效降解噻吩硫的古地分枝杆菌，名为Mycobacteriumgoodii SDU-B，已于2004年1月13日保藏于“德国微生物菌种保藏中心”(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany)，其保藏号为DSM 16135。
附图1为菌株代谢苯并噻吩(BT)的硫专一途径；其中A为苯并噻吩，B为苯并噻吩亚砜，C为苯并噻吩砜，D为苯并氧硫己二烯亚砜，E为苯并氧硫己二烯砜，F为氧-羟基苯乙烯。
附图2底物苯并噻吩(BT)质谱图
附图3产物苯并氧硫己二烯砜(benzo[c][1，2]oxathiin S，S-dioxide)质谱图
附图4产物氧-羟基苯乙烯(o-hydroxystyrene)质谱图
附图5为本发明的菌株Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135在德国微生物菌种保藏中心所作的可利用碳源的检测结果
附图6为本发明的菌株Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135在德国微生物菌种保藏中心所作的结核菌脂酸的高压液相检测结果
附图7为本发明的菌株Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135在德国微生物菌种保藏中心所作的结核菌脂酸高温分解产物的气相色谱检测结果
附图8为本发明的菌株Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135的进化树
附图9为本发明的菌株Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135的降解二苯并噻吩(DBT)的结果
附图10为本发明的菌株Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135的降解4，6-二甲基-二苯并噻吩(4，6-DM-DBT)的结果
附图11为本发明的菌株Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135的降解4-甲基-二苯并噻吩(4-M-DBT)的结果
附图12为本发明的菌株Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135的降解5-甲基-苯噻吩(5-M-BT)的结果
具体实施方式
实施例1：Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135菌株的筛选
从炼油厂污水排放口等地取得土样、水样，用基本无机盐培养基(MAMD)浸泡过夜，于45℃，200转/分振荡培养48小时。培养液去除土样后离心得到菌体，所得菌体用生理盐水洗涤两次，悬浮于浓度为100mM的pH7.0的磷酸钾缓冲液中，调整菌体浓度在2克干细胞/升。以体积百分比为10％的接种量将此菌液加入到含有0.5mM的DBT的上述基本无机盐培养基试管中，45℃培养48小时，再以体积百分比为10％的接种量转入新鲜的含有0.5mM的DBT的基本无机盐培养基中继续培养2天以上。用基本无机盐培养基作对照，有明显生长的，将此管的培养液稀释涂布在固体基本无机盐培养基上，培养挑出单菌落，扩大培养，得到能降解DBT的菌株。
该菌株不能运动，不产芽孢，形态为棒杆状，长2μm，直径1μm，在MAMD培养基上以二苯并噻吩作为唯一硫源培养36小时后，菌落颜色为金黄色。
由德国微生物菌种保藏中心所作的鉴定表明，该菌株含有结核菌脂酸，并且上述结核菌脂酸的高效液相层析洗脱特征与Mycobacterium goodii DSM 44492非常相似，德国微生物菌种保藏中心所作的鉴定表明，该菌株的脂肪酸图谱与Mycobacterium goodiiDSM 44492非常相似，该菌株不含有二级醇。
该菌株可以在基本无机盐培养基(MAMD)上以无机硫，如Na2SO4，或有机含硫化合物如二甲基亚砜和噻吩类化合物作为唯一硫源生长，也可以在LB培养基上生长。
该菌株定名为Mycobacterium goodii SDU-B，已于2004年1月13日保藏于德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany)，其保藏号为DSM 16135。
上述MAMD培养基组成：1升蒸馏水中含：10克葡萄糖，0.5克KH2PO4，4克K2HPO4，1克NH4Cl，2mL质量百分比为1％的CaCl2，2mL质量百分比为10％的MgCl2·6H2O，200μL质量百分比为1％的FeCl3，200μL质量百分比为5％的NaCl，5mL质量百分比为1％的酵母粉，200μL的维生素混合液，5 mL的金属离子混合液，加蒸馏水到1升。115℃条件下灭菌20分钟。固体基本无机盐培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.6％的琼脂粉，115℃条件下灭菌20分钟。其中微量元素混合液组成为：1升蒸馏水中含：ZnCl2 0.5g；FeCl2 0.5g；MnCl2·4H2O 0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。维生素混合物的配方为，每升蒸馏水含有：400mg泛酸钙(Calcium pantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoicacid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
上述LB培养基配方如下，1升蒸馏水中含：10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，固体LB培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.6％的琼脂粉，121℃条件下灭菌15分钟。
实施例2：上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135菌株16S rDNA基因的提取
培养5ml的细菌培养物至饱和状态，取1.5ml培养物，6000g离心2分钟；沉淀物加入565μl的TE缓冲液，TE缓冲液配方如下：10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、用盐酸调整pH为8.0，用吸管反复吹打使之重悬，加入30μl质量体积比为10％的十二烷基磺酸钠(SDS)和5μl 20mg/mL的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1小时；加入100μl，5mol/LNaCl，充分混匀，再加入80μl的CTAB/NaCl溶液，CTAB/NaCl溶液配方如下：质量体积比为10％的十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)溶解于0.7mol/L的NaCl中，混匀，于65℃温育10分钟；加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，12000g离心5分钟，将上清液转入一个新管中，如果难以移出上清，先用牙签除去界面物质；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，12000g离心5分钟，将上清转入一支新管中；加入0.6倍体积异丙醇，轻轻混匀直到DNA沉淀下来，用一个封口的离心管将沉淀转移至1ml的70％乙醇中洗涤；12000g离心5分钟，弃上清，用冻干机稍加干燥，重溶于100μl的TE缓冲液。以提取的基因组DNA为模板，利用购自上海博亚生物技术有限公司的真细菌引物27f和1492r，进行PCR扩增，在50μl反应体系依次混匀下列试剂：35μl H2O，5μl10倍浓度的PCR反应缓冲液，10倍浓度的PCR反应缓冲液配方如下：500mmol/L的KCl、30mmol/L的二硫苏糖醇(DTT)、100mmol/L的用盐酸调整pH为8.8的Tris缓冲液、1mg/ml的牛血清白蛋白、15mmol/L的MgCl2，4μl 25mmol/LMgCl2，1μl 4种dNTP的混合物，0.5μl上游引物，0.5μl下游引物，0.5μl模板DNA即上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135的基因组DNA，0.5μl Taq DNA聚合酶，混匀后离心5秒钟。加入50μl矿物油再离心5秒钟；将混合物在94℃加热5分钟。94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，总共25个循环。最后一个循环后，于72℃下保温10分钟，使反应混合物扩增充分。PCR反应产物测序。该菌的16S rDNA基因序列长度为1384bp，序列如下：
ACATGCAAGTCGAACGGAAAGGCCCTTCGGGGTGCTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGAATATACCCTGCTGGTCGCATGGCCTGGTGGGGGAAAGCTTTTGCGGTGTGGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCACAGACGAAGCGTAAGTGACGGTATGTGCAGAAGAAGGACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTCCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGTTTGTCGCGTTGTTCGTGAAAACTCACAGCTTAACTGTGGGCGTGCGGGCGATACGGGCAGACTAGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTCCTTCCTTGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATGCACAGGACGCCCGTAGAGATATGGGTTCCCTTGTGGCCTGTGTGCAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTCATGTTGCCAGCACGTGATGGTGGGGACTCGTGAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCGATGCCGTGAGGTGGAGCGAATCCTTTCAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGTGGGA
实施例3：制备上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135菌株的细胞液体培养物：
挑取营养琼脂斜面培养古地分枝杆菌Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135菌株一环接种在装有灭菌50ml的基本无机盐培养基的300ml锥形瓶中，加入已灭菌的DBT-二甲基甲酰胺储液，使DBT浓度为0.5mM，于45℃，180转/分在摇床上培养36小时。吸取培养获得的菌液5ml接种在装有100ml的基本无机盐培养基的500ml锥形瓶中，再加入已灭菌的DBT-二甲基甲酰胺储液，使DBT浓度为0.1～0.5mM。将该锥形瓶放在摇床中，45℃，180转/分培养48小时，制得Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135细胞的液体培养液。
实施例4：制备上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135菌株休止细胞液：
将通过实施例3的方法获得菌株SDU-B的细胞的液体培养液5000g，离心10分钟，倒去上清液。用适量生理盐水洗涤离心3次，将所获得的离心沉淀物悬浮于生理盐水中，然后冷冻保藏于冰箱中，即制得Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135菌株的休止细胞。
实施例5：上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135在脱除二苯并噻吩(DBT)中有机硫的应用：
(1)将DBT配成50mM的DBT-二甲基甲酰胺储液，并过滤除菌；
(2)在300ml锥形瓶中依次放入灭菌培养基50ml，DBT-二甲基甲酰胺储液0.5ml，使锥形瓶中DBT的浓度为0.5mM；
(3)将实施例3制得的Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135菌株的细胞培养液5ml加入上述步骤(2)锥形瓶中，将锥形瓶放置在摇床中，于45℃，180转/分培养，隔1小时取样测定。其DBT降解的测定结果见附图9，结果表明，Mycobacteriumgoodii SDU-B DSM 16135可以较好的脱除DBT中的硫，在6小时可以将0.5mM的DBT降解完全。
实施例6：上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135在脱除4，6-二甲基-二苯并噻吩(4，6-DM-DBT)中有机硫的应用：
(1)将4，6-DM-DBT配成50mM的4，6-DM-DBT-二甲基甲酰胺储液，并过滤除菌；
(2)在300ml锥形瓶中依次放入灭菌培养基50ml，4，6-DM-DBT-二甲基甲酰胺储液0.5ml，使锥形瓶中4，6-DM-DBT的浓度为0.5mM；
(3)将实施例3制得的Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135菌株的细胞培养液，或将实施例4制得的休止细胞培养液5ml加入上述步骤(2)锥形瓶中，将锥形瓶放置在摇床中，于45℃，180转/分培养，隔1小时取样测定。其4，6-DM-DBT降解的测定结果见附图10，结果表明，Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135可以较好的脱除4，6-DM-DBT中的硫，在12小时可以将0.5mM的4，6-DM-DBT降解掉93％。
实施例7：上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135在脱除4-甲基-二苯并噻吩(4-M-DBT)中有机硫的应用：
(1)将4-M-DBT配成50mM的4-M-DBT-二甲基甲酰胺储液，并过滤除菌；
(2)在300ml锥形瓶中依次放入灭菌培养基50ml，4-M-DBT-二甲基甲酰胺储液0.5ml，使锥形瓶中4-M-DBT的浓度为0.5mM；
(3)将实施例3制得的Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135菌株的细胞培养液，或将实施例4制得的休止细胞培养液5ml加入上述步骤(2)锥形瓶中，将锥形瓶放置在摇床中，于45℃，180转/分培养，隔1小时取样测定。其4-M-DBT降解的测定结果见附图11，结果表明，Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135可以较好的脱除4-M-DBT中的硫，在12小时可以将0.5mM的4-M-DBT降解掉70.6％。
实施例8：上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135在脱除5-甲基-苯噻吩(5-M-BT)中有机硫的应用：
(1)将5-M-BT配成50mM的5-M-BT-二甲基甲酰胺储液，并过滤除菌；
(2)在300ml锥形瓶中依次放入灭菌培养基50ml，5-M-BT-二甲基甲酰胺储液0.5ml，使锥形瓶中5-M-BT的浓度为0.5mM；
(3)将实施例3制得的Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135菌株的细胞培养液，或将实施例4制得的休止细胞培养液5ml加入上述步骤(2)锥形瓶中，将锥形瓶放置在摇床中，于45℃，180转/分培养，隔1小时取样测定。其5-M-BT降解的测定结果见附图12，结果表明，Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135可以较好的脱除5-M-BT中的硫，在4小时可以将0.5mM的5-M-BT降解完全。

Claims (9)

1.一株可高效降解噻吩硫的古地分枝杆菌，其特征在于：该古地分枝杆菌名为Mycobacterium goodii SDU-B，2004年1月13日保藏于“德国微生物菌种保藏中心”，其保藏号为DSM 16135。
2.如权利要求1所述的古地分枝杆菌，其特征在于：该Mycobacterium goodiiSDU-B DSM 16135菌株，其细菌学特征是：形态为棒杆状，长2μm，直径1μm，菌落颜色为金黄色，不能运动，不产芽孢；
上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135含有结核菌脂酸，并且上述结核菌脂酸的高效液相层析洗脱特征与Mycobacterium goodii DSM 44492非常相似；
上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135的脂肪酸图谱与Mycobacteriumgoodii DSM 44492非常相似，上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135不含有二级醇；
上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135可以在基本无机盐培养基(MAMD)上以噻吩类化合物作为唯一硫源生长，也可以在LB培养基上生长；
上述基本无机盐培养基配方如下，1升蒸馏水中含：10克葡萄糖，0.5克KH2PO4，4克K2HPO4，1克NH4Cl，2mL质量百分比为1％的CaCl2，2mL质量百分比为10％的MgCl2·6H2O，200μL质量百分比为1％的FeCl3，200μL质量百分比为5％的NaCl，5mL质量百分比为1％的酵母粉，200μL的维生素混合液，5mL的金属离子混合液，加蒸馏水到1升，115℃条件下灭菌20分钟；固体基本无机盐培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.6％的琼脂粉，115℃条件下灭菌20分钟；其中微量元素混合液组成为：1升蒸馏水中含：ZnCl2 0.5g，FeCl2 0.5g，MnCl2·4H2O 0.5g，Na2MoO4·2H2O0.1g，CuCl2·2H2O 0.05g，Na2WO4·2H2O 0.05g，HCl 120mmol/L，维生素混合物的配方为，每升蒸馏水含有：400mg泛酸钙(Calcium pantothenate)，200mg肌醇(Inositol)，400mg尼克酸/烟酸(Niacin)，400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)，200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)，0.5mg VB12(Cyanocobalamin)；
上述LB培养基配方如下，1升蒸馏水中含：10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，固体LB培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.6％的琼脂粉，121℃条件下灭菌15分钟。
3.如权利要求1或2所述的古地分枝杆菌，其特征在于：所述菌株Mycobacteriumgoodii SDU-B DSM 16135可在MAMD培养基中以二苯并噻吩、二苯并噻吩衍生物、苯并噻吩、苯并噻吩衍生物和噻吩衍生物为唯一硫源生长。
4.如权利要求3中所述的古地分枝杆菌，其特征在于，所述的二苯并噻吩衍生物包括4，6-二甲基-二苯并噻吩、DBT-砜、4-甲基-二苯并噻吩。
5.如权利要求3中所述的古地分枝杆菌，其特征在于，所述的苯并噻吩衍生物包括5-甲基-苯并噻吩、3-甲基-苯并噻吩。
6.如权利要求3中所述的古地分枝杆菌，其特征在于，所述的噻吩衍生物包括噻吩乙酸、噻吩羧酸。
7.如权利要求1或2所述的古地分枝杆菌，其特征在于：所述菌株Mycobacteriumgoodii SDU-B DSM 16135的16S rDNA基因序列长度为1384bp，其序列如下：ACATGCAAGTCGAACGGAAAGGCCCTTCGGGGTGCTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGAATATACCCTGCTGGTCGCATGGCCTGGTGGGGGAAAGCTTTTGCGGTGTGGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCACAGACGAAGCGTAAGTGACGGTATGTGCAGAAGAAGGACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTCCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGTTTGTCGCGTTGTTCGTGAAAACTCACAGCTTAACTGTGGGCGTGCGGGCGATACGGGCAGACTAGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTCCTTCCTTGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATGCACAGGACGCCCGTAGAGATATGGGTTCCCTTGTGGCCTGTGTGCAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTCATGTTGCCAGCACGTGATGGTGGGGACTCGTGAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCGATGCCGTGAGGTGGAGCGAATCCTTTCAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGTGGGA
8.如权利要求1或2所述的古地分枝杆菌在脱除石油及其产品中有机硫化合物的硫中的应用。
9.如权利要求7所述的古地分枝杆菌在脱除石油及其产品中有机硫化合物的硫中的应用，其特征在于：脱硫的应用方法中，Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135脱除含硫有机化合物中的硫，是通过氧化断裂C-S键的途径实现的。
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