CN101851587B - 一株腐皮镰孢菌及其在降解二苯并噻吩中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株可以高效降解二苯并噻吩的腐皮镰孢菌菌株。本发明的目的是提供一种二苯并噻吩降解菌及利用该菌进行二苯并噻吩降解的应用。本发明提供的二苯并噻吩降解菌为腐皮镰孢菌（Fusarium solani ）CGMCC No.3653。所说的腐皮镰孢菌（ Fusarium solani ）CGMCCNo.3653用于降解二苯并噻吩。本发明提供的菌株具有生长速度快、降解速度快、易成为优势菌株且可对多环芳烃菲和萘同时具有降解效果等优势。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及一株二苯并噻吩降解菌及其在环境污染控制中的应用。
背景技术
除了炼焦废水中含有有机硫杂环化合物如二苯并噻吩等，硫在石油中的含量也比较高，原油中硫含量在0.025-5％之间，大部分以硫化物、硫醇、噻吩、苯并噻吩(benzothiophene，BT)或者二苯并噻吩(dibenzothiophene，DBT)等有机硫存在，二苯并噻吩是硫杂质中的主要成分，在一些石油中占据总硫的40％-70％。石油、石化产品以及炼焦生产在生产、运输以及使用过程中会产生大量污染，如土壤污染以及地下水的污染以及大量的废水，二苯并噻吩作为一种主要的污染物之一的降解对于土壤生物修复以及石化污水、炼焦废水的处理具有重要作用，此外这些污染中往往还含有一定的苯酚、多环芳烃以及甲苯等苯系污染物。
生物治理是微生物利用污染物作为碳源或其他营养源如氮源、硫源等，将其分解利用转化为二氧化碳、水以及无机矿物质等。生物治理/处理因为成本低、操作简单、条件温和以及无二次污染等优势，在土壤生物修复以及石化污水、炼焦废水的处理的过程中具有绝对的优势，筛选、获得具有对二苯并噻吩具有快速降解能力以及对苯酚、多环芳烃以及甲苯等苯系污染物同时具有降解作用的高效微生物菌株，可以将其投加于待修复的土壤以及污水处理中，来大幅提高生物降解的效果，这对保护生态具有主要意义。
一般来说生物降解菌要求具有对生长环境要求低、生长速度快、降解速度快以及可耐受或可降解多种污染物的优势。
本发明提供的一株二苯并噻吩降解菌具有上述优势。
发明内容
本发明的目的是提供一株可降解二苯并噻吩的菌株及其应用。
本发明从中国某油田污泥中以二甲基亚砜为唯一硫源筛选得到的腐皮镰孢菌Fusariumsolani S1菌株具有快速降解二苯并噻吩的能力。该菌株属于真菌类；在二苯并噻吩为唯一硫源的选择性固体培养基上生长有大量繁密菌丝，初期白色，长时间后变淡土黄色，于30℃左右生长，具有典型镰刀型孢子。
该菌株为镰孢菌属菌株(Fusarium solani)，保藏号CGMCC No.3653。
本发明的另一个目的是提供该菌株的应用方法：降解含二苯并噻吩污染物，具有降解速度快，可同时降解多种有机污染物能力。
本发明提供的腐皮镰孢菌，不但生长迅速、容易成为优势菌株、可高效、快速降解二苯并噻吩外，并具有降解利用环丁砜、二甲基亚砜、菲、萘、2-羟基联苯、苯酚以及甲苯的能力，适合进行石油、炼焦废水的处理以及石油污染土壤和地下水的修复。通过下面的附图和详细描述，本发明这些方面的特征和优点将更为清楚。
附图说明
图1是腐皮镰孢CGMCC No.3653的菌丝及孢子图片。
图2是腐皮镰孢CGMCC No.3653以二苯并噻吩为唯一硫源的生长曲线。
图3是腐皮镰孢CGMCC No.3653在不同氯化铵浓度下利用二苯并噻吩的生长情况。
图4是腐皮镰孢CGMCC No.3653利用不同碳源的生长情况。
本发明中，除非特别指明，术语“二苯并噻吩降解菌”是指可以二苯并噻吩为唯一碳源、能源以及硫源进行生长的微生物菌株，即菌株在增殖或代谢过程中可将二苯并噻吩降解为二氧化碳、水以及无机矿物质而去除。
本发明中，除非特别指明，术语“含二苯并噻吩污染物”是指工业过程中产生的明显含有二苯并噻吩的石化、炼焦废水或者石油污染土壤、地下水等。
本发明中，除非特别指明，术语“碳源”是指微生物可利用的含碳物质，微生物利用该含碳物质合成自身细胞的含碳物质。术语“能源”是微生物细胞可氧化其产生电子，在电子传递过程中产生ATP供细胞利用的物质。术语“硫源”是指微生物可利用的含硫物质，微生物利用含硫物质来提供自身对硫的需求。
具体实施方式
(1)培养基
基本盐溶液(BSM)：KH2PO4：2.5g，NaHPO4·12H2O：12.0g，MgCl2·6H2O：0.8g，NH4Cl：2.0g，CaCl2：0.07g，FeCl3·6H2O：0.1g，MnCl4·4H2O：0.4g，溶于1000ml去离子水中，制成盐溶液。
富集、筛选培养基：BSM溶液中加入甘油15.0g/L，二甲基亚砜800mg/L。
液体、固体培养基：BSM溶液中加入甘油15.0g/L，DBT 800mg/L，固体培养基中加入20g/L琼脂，湿热灭菌备用，条件改变另作说明。
(2)菌株的筛选与分离纯化
来自油田污水池的污泥置于250ml三角烧瓶中30℃摇床活化2天，用移液管移取10ml活化污泥加入选择性培养基中，于摇床培养三天后4000rpm离心5分钟，倒掉上清液，部分底部泥菌转移到相应的新鲜富集培养基，如此每三天重复一次，共3次。然后移取适量驯化菌液进行稀释涂布平板，于30℃培养箱中培养后选取数量多、长势良好、外观不同的菌落，进行多次划线分离纯化得到纯种菌株，将纯化的菌株接种斜面培养基培养后于4℃冰箱保藏，每隔3-4个月转接一次。
(3)菌株的形态观察与分子生物学鉴定
菌丝采用光学显微镜观察(如图1)，具有典型镰刀状孢子和真菌菌丝。
菌株鉴定采用28S rDNA进行，正向引物5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′(SEQ ID NO.2)，反向引物：5′-GGTCCGTGTTT CAAGACGG-3′(SEQ ID NO.3)，PCR(ABI 9700)条件：94℃预变性2min，94℃变性10s，55℃退火5s，72延伸10s，35个循环，72延伸2min，测序使用ABI 3700 DNA测序仪。28S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。NCBIBLAST 28S rRNA序列搜索结果与Fusarium solani S1菌株同源性98％，2010年3月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC No.3653，分类命名为。
(4)二苯并噻吩降解以及细胞干重
平板的培养：菌种接种固体培养基后置于恒温培养箱30℃培养1-2天。
液体培养：菌种接种液体培养基，置于30℃，200r/min的摇床中进行振荡培养一定时间后利用等体积环己烷萃取剩余DBT，水相离心收集菌体，洗涤1-2次后放置烘箱中80℃烘干至恒重测细胞干重。
(5)二苯并噻吩测试：使用安捷伦气相色谱(6890)进行，FID检测器，50-300℃升温速度40℃/min，色谱柱HP-5毛细管色谱柱。
实施例1菌种接种分别含环丁砜、二苯并噻吩为唯一硫源，或接种分别含2-羟基联苯、萘、菲为唯一碳源的固体培养基，于恒温培养箱中培养2-3天。结果如表1所示。
表1 在不同硫源及碳源的培养基中的生长情况
实施例2菌种接种甘油15.0g/L，DBT 800mg/L，氯化铵浓度2g/L的液体培养基，置于30℃，180r/min的摇床中进行振荡培养一定时间后测细胞干重，结果如图2所示。
实施例3菌种接种甘油15.0g/L，DBT 800mg/L，不同氯化铵浓度的液体培养基，置于30℃，180r/min的摇床中进行振荡培养一定时间后测细胞干重，结果如图3所示。
实施例4菌种接种分别含甲醇、乙醇、正辛烷、正庚烷、吐温-80以及甲苯为碳源的液体培养基，置于30℃，180r/min的摇床中进行振荡培养2-3天，细胞干重如图4所示。
说明该菌对多种有机碳源具有利用能力。
实施例5菌种接种甘油15.0g/L，DBT 800mg/L，氯化铵浓度5g/L的液体培养基，置于30℃，180r/min的摇床中进行振荡培养24hrs后测DBT的降解率为84.5％。
SEQUENCE LISTING
<110>南京师范大学
<120>一株腐皮镰孢菌及其在降解二苯并噻吩中的应用
<130>
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>579
<212>DNA
<213>Fusarium solani S1
<400>1
caatgggtct tgccccagta acggcgagtg aagcggcaac agctcaaatt tgaaatctgg 60
ctctcgggcc cgagttgtaa tttgtagagg atgcttttgg tgaggtgcct tccgagttcc 120
ctggaacggg acgccataga gggtgagagc cccgtctggt tggacaccga tcctctgtaa 180
agctccttcg acgagtcgag tagtttggga atgctgctct aaatgggagg tatatgtctt 240
ctaaagctaa ataccggcca gagaccgata gcgcacaagt agagtgatcg aaagatgaaa 300
agaactttga aaagagagtt aaacagtacg tgaaattgtt gaaagggaag cgcttgtgac 360
cagacttggg cttggttgat catccggggt tctccccggt gcactcttcc ggctcaggcc 420
agcatcagtt cgccctgggg gataaaggct tcgggaatgt ggctctctcc ggggagtgtt 480
atagcccgct gcgtaatacc ctgtggcgga ctgaggttcg cgcattcgca aggatgctgg 540
cgtaatggtc atcagtgacc cgtcttgaaa cacggacca 579
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
gcatatcaat aagcggagga aaag 24
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ggtccgtgtt tcaagacgg 19
Claims (4)
1.一株腐皮镰孢菌（Fusarium solani ）菌株，其保藏号为CGMCC No3653。
2.如权利要求1所述的腐皮镰孢菌CGMCC No.3653，其特征是它的28S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的腐皮镰孢菌CGMCC No.3653菌株在降解二苯并噻吩中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，将腐皮镰孢菌CGMCC No. 3653菌株接种到含二苯并噻吩的培养基中进行降解。
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