CN1323160C - 一株红平红球菌及其在原油脱硫中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)，该菌株于2005年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国 武汉)，保藏中心编号为：M205068。本发明还公开了所述的红平红球菌在原油脱硫中的应用，其脱硫方法包括(1)斜面培养，(2)种子培养，(3)扩大培养，(4)收集菌体，(5)制备休止细胞，(6)处理原油样品，(7)样品检测等步骤；该方法具有操作简单，脱硫率高等特点，在石油炼制及大气污染治理方面具有很大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株红球菌及其脱除化石燃料中有机硫的方法，具体地说，尤其涉及一株红平红球菌及其在原油脱硫中的应用。
背景技术
化石燃料煤和石油中所含有的有机硫和无机硫是环境的重要污染源，这些硫化物燃烧时排放出大量的二氧化硫等毒性气体，由此转化成的大面积酸雨严重污染大气和水源，破坏生态平衡，危害人类生存。有关资料披露中国的SO2排放量约占世界15％左右，是仅次于美国、原苏联而居世界第三位的SO2的排放大国。日本SO2年排放量仅为中国SO2排放量的1/15。为减少污染，世界各国对含硫量高的化石燃料的开采都有严格的规定。多年的持续开发使得现存含硫量低的化石燃料越来越少。随着能源危机的逐步加剧，高硫化石燃料的开采成为必然。高硫化石燃料必须预先经过脱硫处理才能进一步使用。物理的和化学的脱硫方法成本巨大，而微生物脱硫工艺由于操作压力、温度低，运转成本少，具有广阔的前景。为了保护环境，要求使用低硫含量的化石燃料。目前世界上低硫含量的化石燃料储备正在急剧减少，需要对含硫高的化石燃料进行脱硫处理。随着汽车排放控制新技术的发展和应用，以及对燃油质量的深入研究，国际上对燃料油的硫含量要求越来越严格。随着汽车工业的发展和环保要求日益严格，国产燃油质量问题越来越引起社会的关注。我国政府把控制汽车尾气排放分三个阶段，第一阶段从1999年到2003年，新车要达到欧1排放标准，第二阶段从2004年开始，新车要达到欧2排放标准，第三阶段2010年将和国际同步。1993年欧洲标准的汽油硫含量要求不大于0.1％，我国新标准规定不大于0.08％。因此要使我国燃油质量与国际接轨，还要做大量的工作。
化学脱硫方法-加氢脱硫(Hydrodesulfurization，HDS)通过催化过程，将有机硫转化成H2S气体，反应是在1～20Mpa的压力和290～450℃的温度下进行的。由于对化石燃料中的硫含量有严格规定，再加上HDS方法耗费比较高，而且难以脱去化石燃料中的有机硫，而生物催化法脱硫(Biodesulfurization，BDS)成本低，在常温下即可进行，并且具有高专一性，这使得BDS方法成为一种可供选择的方法。现在国际上比较接受的观点是生物脱硫可以作为常规加氢脱硫一个补充及下游精制技术。
原油中的硫含量相差很大，其中主要是有机硫，也存在少量元素硫、H2S、FeS2等溶解或悬浮在油中。有机硫化物包括硫醇、硫化物及含硫的杂环化合物如噻吩等。原油中的硫醇大部分是低分子量的，在石油的炼制过程中被除去，200℃以上沸点的石油产品中几乎很少存在。脂肪族硫化物是沸点200℃以上石油产品如柴油中硫化物的主要成分，芳香族硫化物在较重的馏分中含量较低。虽然噻吩在原油中很少见，但噻吩的衍生物很多。苯噻吩、二苯噻吩、萘噻吩是高硫原油的重要组成，这些硫化物与长链脂肪烃有机的结合在一起。很难在下一步的加氢脱硫中去除，也是现使用的燃料油中主要的含硫化合物。
现在原油冶炼行业中都是把原油分成各种组分后再分别加氢脱硫，这也造成了整个脱硫成本的提高。如果能在原油冶炼前把原油的硫含量降低到一个比较低的水平这也可以减轻下游处理的压力，节约加氢脱硫的成本。另一个方面，现在我国大量油田进入了开采的后期，必须使用各种手段提高原油的开采率，注水驱油是国内现在大量使用的一个方法。1995年统计，我国老油田中就有87％的油井采用注水驱油，到2004年我国老油田中开采的大部分原油中含水量超过80％，有些油井甚至超过90％。如此高的含水量虽然提高了原油下一步处理的费用，但是也为生物法处理原油创造了条件。因为含有如此高的水分，就解决了长期困扰生物脱硫的一个难题——必须提供较高比例的水相体系来保证生物催化剂的存活问题。
化石燃料中的有机硫主要是噻吩(Thiophene，T)、苯并噻吩(Benzothiophene，BT)、二苯并噻吩(Dibenzothiophene，DBT)以及含有更多苯环的含硫化合物等，生物脱有机硫的研究主要是以较为简单的DBT为模式化合物来进行。现在已经发现许多微生物，如红球菌属(Rhodococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒杆菌属(Corynebacterium)、分支杆菌属(Mycobacterium)和节杆菌属(Arthrobacter)等，能够沿着硫专一途径降解DBT。它们不打开这些含硫化合物的苯环结构，因而保留了燃料的热值，具有较大的应用前景，成为近年来研究的热点。
发明内容
针对现有技术中，脱除原油中有机硫的方法的不足，本发明要解决的问题是提供一株红平红球菌，以及利用红平红球菌休止细胞在原油脱硫中应用，所述应用的方法是基于现在国内原油开采的现状提出的使用生物法脱除原油中有机硫的方法。
本发明提供的一株能够专一性降解DBT生成不破坏碳架的终产物2-羟基联苯的菌株，经过鉴定确认为红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)。该菌株于2005年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国武汉)，保藏中心编号为：M205068。
上述红平红球菌（Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068经德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany)鉴定，具有如下生物学特征：红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCCM205068生长初期形成短的分支菌丝体，然后分化成球菌及棒杆菌的形态；菌落有光泽，从奶白色逐渐变为粉红色；使用气相色谱分析碳链长度为32到44的分支菌酸，发现其与分支菌酸数据库中的红平红球菌的分支菌酸类型相似；所述红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)CCTCC M205068的脂肪酸类型为无分支，含有饱和及不饱和脂肪酸，同时还含有结核菌脂酸，与数据库中的红平红球菌脂肪酸类型有86.5％的同源性。
上述红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068的16S rDNA基因序列长度为1413个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068的培养温度为25～37℃，可以在基本无机盐培养基上以有机含硫化合物如噻吩类化合物作为唯一硫源生长，也可以在LB培养基上生长。
本发明涉及的红平红球菌在原油脱硫中的应用，其脱硫方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068；
(2)斜面培养：将菌种接种于含有质量体积比为1.5～2.0％的琼脂并加有质量体积比为0.003～0.01％的二苯并噻吩(DBT)的固体斜面无机盐基本培养基上，25～37℃条件下，静止培养24～48小时；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于20～100mL含有质量体积比为0.003～0.01％的二苯并噻吩的液体无机盐基本培养基中，25℃～37℃条件下，振荡培养24～48小时，制得种子液；
(4)扩大培养：以5～10％的体积比的接种量，将种子液接种于100～1000mL含有质量体积比为0.003～0.01％的二苯并噻吩液体无机盐基本培养基中，25～37℃条件下，振荡培养24～42小时；
(5)收集细胞：取步骤(4)所得的培养液5,000转/每分钟离心10～15分钟，收集沉淀细胞，使用pH 7.0磷酸缓冲液重悬细胞，再以相同的条件离心，重复2～3次，收集沉淀细胞；
(6)休止细胞制备：使用如步骤(5)的磷酸缓冲液重悬沉淀细胞，使菌体浓度达到10～30克干细胞/升，此细胞悬浊液即为制备好的红平红球菌休止细胞悬浊液，也称生物催化剂；
(7)处理样品：在反应体系中(100～1000mL)，以步骤(6)所得的休止细胞悬浊液作为水相，加入原油，使原油与水相的体积比为1∶10～20，在25～37℃条件下，250转/每分钟振荡48～72小时，进行样品处理；
(8)分离样品：以10,000转/每分钟离心5～10分钟分离步骤(7)中处理后的样品，得到上层原油样品；
(9)样品检测：取1～5μL步骤(8)中的原油样品，使用硫氮元素分析仪测定原油中残留的硫含量，然后对照未处理的样品硫含量，得出经红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)CCTCC M205068处理的原油脱除率。
其中，步骤(2)、(3)、(4)中所述的菌体培养温度优选是28～32℃；二苯并噻吩(DBT)的浓度优选为0.005～0.01％。
其中，步骤(3)、(4)中所述的菌体培养时间优选是36～42小时。
其中，步骤(6)中所述的生物催化剂的菌体浓度优选是每升12～18克干细胞重的菌体；
其中，步骤(7)所述原油与水相的体积比例优选为1∶15～20。
其中，步骤(7)中处理样品的温度优选为28～35℃，样品振荡时间优选为60～72小时。
其中，步骤(7)中处理样品时也可额外添加质量体积百分比浓度为2～5％的葡萄糖。
在上述利用红平红球菌休止细胞脱除原油中有机硫的方法中，菌株培养使用液体基本无机盐培养基(Basal Salts Medium，BSM)，配方为：
甘油4克/升，KH2PO4 2.44克/升，Na2HPO4 14.04克/升，NH4Cl2克/升，质量百分比为1％的CaCl2 100微升/升，质量百分比为10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，质量百分比为1％的FeCl3 100微升/升，维生素混合液200毫升/升的，离子混合液5毫升/升。121℃条件下灭菌20分钟。
以0.003～0.01％的DBT作为硫源。
上述固体斜面基本无机盐培养基为上述液体无机盐培养基成分添加质量体积百分比浓度为1.6％的琼脂粉。
上述的离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有：ZnCl2 0.5g；FeCl2 0.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120 mmol/L。
上述的维生素混合液的配方为，每升蒸馏水含有：400mg泛酸钙(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
上述LB培养基配方如下，1升蒸馏水中含：10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，固体LB培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.6％的琼脂粉，121℃条件下灭菌20分钟。
利用本发明所述的红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068可以降解3-甲基苯并噻吩(3-MBT)，DBT，4-甲基二苯并噻吩(4-MDBT)，4，6-二甲基二苯并噻吩(4，6-DMDBT)及萘噻吩(BNT)(如图1，图2，图3所示)，生成相应的不破坏碳架结构的产物，具有较大的应用前景。
本发明采用红平红球菌休止细胞作为生物催化剂，能够有效地脱除原油中的含硫有机化合物。使用GC-PFPD(气相色谱-脉冲式火焰光度检测器)测定休止细胞处理前后的原油中的含硫化合物的变化。其总硫含量使用Antek7000硫氮元素分析仪(美国，Antek公司产品)进行分析测定为3,210ppm。图4所示的是经过休止细胞处理之后，GC-PFPD测定原油中的含硫化合物的分布情况，此时总硫含量为1,210ppm。处理前后含硫化合物的比较，可以明显看出经过休止细胞处理之后，原油中的大部分可检测到的含硫化合物，如噻吩类，二苯并噻吩类及更加复杂的含硫化合物都基本脱除，起到了很好的脱硫效果。例如：在30℃条件下，使用本发明所述的红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)CCTCC M205068休止细胞可将硫含量为3,210ppm的原油中的硫，降低到1,210ppm，脱除率达到了62.3％。
根据文献和专利检索，Setti等人1992年报道采用一株能降解烷烃的假单胞菌降解重油中的硫化合物，但是脱硫的过程也造成了烷烃的损失。Fedorak等人在1984年采用混合菌处理原油，也造成了烷烃的损失。生物脱硫模式菌株红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)ATCC 53968也进行了原油脱硫的试验，但是发现处理前后对原油总硫含量没有明显的变化，即没有明显的脱硫效果。
本发明的红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068是一个专一性降解含硫化合物的菌，不损失燃烧值。处理原油结果发现有明显的脱硫效果，本菌株具有重要的实际应用价值。
进一步利用本发明所述的红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068的休止细胞将硫含量为1,236ppm的粘度较大的原油进行处理。72小时后，原油硫含量为653ppm，脱除率为47.2％；
附图说明
本发明提供的一株红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)，于2005年6月20日保藏于中国典型微生物菌种保减中心，保藏地址：湖北省武汉市武汉大学，邮政编码：430072，其保藏编号为CCTCC M205068。
图1使用气相-质谱连用技术分析红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCCM205068降解模式化合物DBT及其产物的结构。
其中A：2-羟基联苯；B：二苯并噻吩；C：二苯并噻吩砜。
图2使用气相-质谱连用技术分析红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCCM205068降解复杂含硫模式化合物萘噻吩及其产物的结构。
其中A：α-羟基-β-苯基-萘；B：萘噻吩；C：萘噻吩砜。
图3红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068降解各种原油中含硫模式化合物的途径分析。
其中a二苯并噻吩的代谢分析；b 4-甲基二苯并噻吩的途径分析；c 4，6-二甲基-二苯并噻吩途径分析；d萘噻吩途径分析；e 3-甲基苯并噻吩途径分析。
图4使用GC-PFPD检测休止细胞处理前后，原油中的含硫化合物的变化。
其中：图空白是处理之前的原油含硫化合物的色谱图，图样品是处理之后的原油含硫化合物的色谱图。
具体实施方式
实施例1：红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068菌株的筛选
取油田附近或者炼油厂附近被污染过的各种土壤。各称取5克上述的土壤加入50mL含有质量体积比为0.01％的二苯并噻吩的液体无机盐基本培养基中，30℃，转速250转/每分钟条件下震荡培养48小时，然后以10％的体积比的接种量接种新的含有质量体积比为0.01％的二苯并噻吩的液体无机盐基本培养基中，30℃，转速250转/每分钟条件下，震荡培养48小时，再继续转接，重复这一过程3～5次。将培养的菌液稀释1,000,000倍涂布含有质量体积比为1.6％的琼脂并加有质量体积比为0.01％的二苯并噻吩的固体无机盐基本培养基上，30℃条件下静止培养72小时。选取长出的单菌落继续接种50mL含有质量体积比为0.01％的二苯并噻吩的液体无机盐基本培养基中，30℃，转速250转/每分钟条件下，震荡培养48小时，筛选能够利用二苯并噻吩作为唯一硫源生长的菌株，最终获得一株降解能力较好的菌株，即红平红球菌(Rhodococcuserythropolis) CCTCC M205068，经过稳定性实验表明该菌株具有非常高的稳定性，连续培养后降解二苯并噻吩的能力没有降低。
该菌株生长初期形成短的分支菌丝体，然后分化成球菌及棒杆菌的形态；菌落有光泽，从奶白色逐渐变为粉红色；使用气相色谱分析碳链长度为32到44的分支菌酸，发现其与分支菌酸数据库中的红平红球菌的分支菌酸类型相似；所述红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068的脂肪酸类型为无分支，含有饱和及不饱和脂肪酸，同时还含有结核菌脂酸。其最适生长温度在30℃。
上述菌株培养使用液体基本无机盐培养基(Basal Salts Medium，BSM)，配方为：甘油克/升，KH2PO4 2.44克/升，Na2HPO4 14.04克/升，NH4Cl2克/升，质量百分比为1％的CaCl2 100微升/升，质量百分比为10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，质量百分比为1％的FeCl3 100微升/升，维生素混合液200毫升/升的，离子混合液5毫升/升。121℃条件下灭菌20分钟。
固体基本无机盐培养基为上述液体无机盐培养基成分添加质量体积百分比为1.6％的琼脂粉。
上面所述的离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有：ZnCl20.5g；FeCl2 0.5g；MnCl2·4H2O 0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl120mmol/L。
上面所述的维生素混合物的配方为，每升蒸馏水含有：400mg泛酸钙(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mgVB12(Cyanocobalamin)。
实施例2：上述红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068菌株16SrDNA基因的提取
培养5ml的细菌培养物至饱和状态，取1.5ml培养物，6000转/每分钟离心2分钟；沉淀物加入565μl的TE缓冲液，TE缓冲液配方如下：10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、用盐酸调整pH为8.0，用吸管反复吹打使之重悬，加入30μl质量体积比为10％的十二烷基磺酸钠(SDS)和5μl 20mg/mL的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1小时；加入100μl，5mol/L NaCl，充分混匀，再加入80μl的CTAB/NaCl溶液，所述CTAB/NaCl溶液配方如下：质量体积比为10％的十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)溶解于0.7mol/L的NaCl中，混匀，于65℃温育10分钟；加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，12000转/每分钟离心5分钟，将上清液转入一个新管中；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，12000转/每分钟离心5分钟，将上清转入一支新管中；加入0.6倍体积异丙醇，轻轻混匀直到DNA沉淀下来，用一个封口的离心管将沉淀转移至1ml的70％乙醇中洗涤；12000转/每分钟离心5分钟，弃上清，用冻干机稍加干燥，重溶于50μl的TE缓冲液。以提取的基因组DNA为模板，利用购自上海博亚生物技术有限公司的真细菌引物27f和1492r，进行PCR扩增，在50μl反应体系依次混匀下列试剂：35μl H2O，5μl 10倍浓度的PCR反应缓冲液，10倍浓度的PCR反应缓冲液配方如下：500mmol/L的KCl、30mmol/L的二硫苏糖醇(DTT)、100mmol/L的用盐酸调整pH为8.8的Tris缓冲液、1mg/ml的牛血清白蛋白、15mmol/L的MgCl5，4μl 25mmol/L MgCl2，1μl4种dNTP的混合物，0.5μl上游引物，0.5μl下游引物.0.5μl模板DNA即上述红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCCM205068的基因组DNA，0.5μl Taq DNA聚合酶，混匀后离心5秒钟。加入50μl矿物油再离心5秒钟；将混合物在94℃加热5分钟。94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，总共30个循环。最后一个循环后，于72℃下保温10分钟，使反应混合物扩增充分，得到红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068的16S rDNA的PCR扩增产物，将产物测序。
测序结果：红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068菌株16S rDNA基因序列长度为1413 bp，核苷酸序列如下：
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实施例3：利用红平红球菌休止细胞脱除原油中有机硫的方法，其中加入的原油与水相的体积比为1∶10，处理温度为25℃
本发明利用红平红球菌在原油脱硫中的应用，其脱硫方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用红平红球菌（Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068；
(2)斜面培养：将菌种接种于含有质量体积比为1.6％的琼脂并加有质量体积比为0.005％的二苯并噻吩的固体斜面无机盐基本培养基上，25℃条件下，静止培养42小时；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于100mL含有质量体积比为0.005％的二苯并噻吩的液体无机盐基本培养基中，25℃条件下，振荡培养40小时，制得种子液；
(4)扩大培养：以10％的体积比的接种量，将种子液接种于100mL含有质量体积比为0.005％的二苯并噻吩液体无机盐基本培养基中，25℃条件下，振荡培养42小时；
(5)收集细胞：取步骤(4)所得的培养液5,000转/每分钟离心15分钟，收集沉淀细胞，使用pH 7.0磷酸缓冲液重悬细胞，再以相同的条件离心，重复2次，收集沉淀细胞；
(6)休止细胞制备：使用如步骤(5)的磷酸缓冲液重悬沉淀细胞，使菌体浓度达到25克干细胞/升，此细胞悬浊液即为制备好的红平红球菌休止细胞悬浊液，也称生物催化剂；
(7)处理样品：在100mL的反应体系中，以步骤(6)所得的休止细胞悬浊液作为水相，加入原油，使原油与水相的体积比为1∶10，在25℃条件下，250转/每分钟振荡48小时，进行样品处理；
(8)分离样品：以10,000转/每分钟离心10分钟分离步骤(7)中处理后的样品，得到上层原油样品；
(9)样品检测：取1μL步骤(8)中的原油样品，使用Antek7000硫氮元素分析仪(美国，Antek公司产品)测定原油中残留的硫含量，然后对照未处理的样品硫含量，得出经红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068处理的原油脱除率为22.7％；
在上述利用红平红球菌休止细胞脱除原油中有机硫的方法中，菌株培养使用液体基本无机盐培养基(Basal Salts Medium，BSM)，配方为：
甘油4克/升，KH2PO4 2.44克/升，Na2HPO4 14.04克/升，NH4Cl2克/升，质量百分比为1％的CaCl2 100微升/升，质量百分比为10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，质量百分比为1％的FeCl3 100微升/升，维生素混合液200毫升/升的，离子混合液5毫升/升。121℃条件下灭菌20分钟。
以0.005％的DBT作为硫源。
上述固体斜面基本无机盐培养基为上述液体无机盐培养基成分添加质量体积百分比为1.6％的琼脂粉。
上述的离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有：ZnCl2 0.5g；FeCl2 0.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl120mmol/L。
上述的维生素混合液的配方为，每升蒸馏水含有：400mg泛酸钙(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
实施例4：利用红平红球菌休止细胞脱除原油中有机硫的方法，其中加入的原油与水相的体积比为1∶20，处理温度为30℃
本发明利用红平红球菌在原油脱硫中的应用，其脱硫方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068；
(2)斜面培养：将菌种接种于含有质量体积比为1.6％的琼脂并加有质量体积比为0.01％的二苯并噻吩的固体斜面无机盐基本培养基上，28℃条件下，静止培养42小时；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于100mL含有质量体积比为0.01％的二苯并噻吩的液体无机盐基本培养基中，28℃条件下，振荡培养36小时，制得种子液；
(4)扩大培养：以10％的体积比的接种量，将种子液接种于100mL含有质量体积比为0.01％的二苯并噻吩液体无机盐基本培养基中，28℃条件下，振荡培养36小时；
(5)收集细胞：取步骤(4)所得的培养液5,000转/每分钟离心15分钟，收集沉淀细胞，使用pH7.0磷酸缓冲液重悬细胞，再以相同的条件离心，重复2次，收集沉淀细胞；
(6)休止细胞制备：使用如步骤(5)的磷酸缓冲液重悬沉淀细胞，使菌体浓度达到16克干细胞/升，此细胞悬浊液即为制备好的红平红球菌休止细胞悬浊液，也称生物催化剂；
(7)处理样品：在100mL的反应体系中，以步骤(6)所得的休止细胞悬浊液作为水相，加入原油，使原油与水相的体积比为1∶20，在30℃条件下，250转/每分钟振荡65小时，额外添加质量体积比为2％的葡萄糖，进行样品处理；
(8)分离样品：以10,000转/每分钟离心10分钟分离步骤(7)中处理后的样品，得到上层原油样品；
(9)样品检测：取1μL步骤(8)中的原油样品，使用Antek7000硫氮元素分析仪(美国，Antek公司产品)测定原油中残留的硫含量，然后对照未处理的样品硫含量，得出经红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068处理的原油脱除率为43.7％；
在上述利用红平红球菌休止细胞脱除原油中有机硫的方法中，菌株培养使用液体基本无机盐培养基(Basal Salts Medium，BSM)，配方为：
甘油4克/升，KH2PO4 2.44克/升，Na2HPO4 14.04克/升，NH4Cl 2克/升，质量百分比为1％的CaCl2 100微升/升，质量百分比为10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，质量百分比为1％的FeCl3 100微升/升，维生素混合液200毫升/升的，离子混合液5毫升/升。121℃条件下灭菌20分钟。
以0.01％的DBT作为硫源。
上述固体斜面基本无机盐培养基为上述液体无机盐培养基成分添加质量体积百分比为1.6％的琼脂粉。
上述的离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有：ZnCl2 0.5g；FeCl2 0.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl120mmol/L。
上述的维生素混合液的配方为，每升蒸馏水含有：400mg泛酸钙(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
实施例5：利用红平红球菌休止细胞脱除原油中有机硫的方法，其中加入的原油与水相的体积比为1∶20，处理温度为30℃
本发明利用红平红球菌在原油脱硫中的应用，其脱硫方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068；
(2)斜面培养：将菌种接种于含有质量体积比为1.6％的琼脂并加有质量体积比为0.01％的二苯并噻吩的固体斜面无机盐基本培养基上，30℃条件下，静止培养42小时；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于100mL含有质量体积比为0.01％的二苯并噻吩的液体无机盐基本培养基中，30℃条件下，振荡培养42小时，制得种子液；
(4)扩大培养：以10％的体积比的接种量，将种子液接种于100mL含有质量体积比为0.01％的二苯并噻吩液体无机盐基本培养基中，30℃条件下，振荡培养36小时；
(5)收集细胞：取步骤(4)所得的培养液5,000转/每分钟离心15分钟，收集沉淀细胞，使用pH7.0磷酸缓冲液重悬细胞，再以相同的条件离心，重复2次，收集沉淀细胞；
(6)休止细胞制备：使用如步骤(5)的磷酸缓冲液重悬沉淀细胞，使菌体浓度达到18克干细胞/升，此细胞悬浊液即为制备好的红平红球菌休止细胞悬浊液，也称生物催化剂；
(7)处理样品：在100mL的反应体系中，以步骤(6)所得的休止细胞悬浊液作为水相，加入原油，使原油与水相的体积比为1∶20，在30℃条件下，250转/每分钟振荡72小时，额外添加质量体积比为5％的葡萄糖，进行样品处理；
(8)分离样品：以10,000转/每分钟离心10分钟分离步骤(7)中处理后的样品，得到上层原油样品；
(9)样品检测：取1μL步骤(8)中的原油样品，使用Antek7000硫氮元素分析仪(美国，Antek公司产品)测定原油中残留的硫含量，然后对照未处理的样品硫含量，得出经红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068处理的原油脱除率为63.2％；
在上述利用红平红球菌休止细胞脱除原油中有机硫的方法中，菌株培养使用液体基本无机盐培养基(Basal Salts Medium，BSM)，配方为：
甘油4克/升，KH2PO4 2.44克/升，Na2HPO4 14.04克/升，NH4Cl2克/升，质量百分比为1％的CaCl2 100微升/升，质量百分比为10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，质量百分比为1％的FeCl3 100微升/升，维生素混合液200毫升/升的，离子混合液5毫升/升。121℃条件下灭菌20分钟。
以0.01％的DBT作为硫源。
上述固体斜面基本无机盐培养基为上述液体无机盐培养基成分添加质量体积百分比为1.6％的琼脂粉。
上述的离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有：ZnCl2 0.5g；FeCl2 0.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl120mmol/L。
上述的维生素混合液的配方为，每升蒸馏水含有：400mg泛酸钙(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-arninobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
实施例6：利用红平红球菌休止细胞脱除原油中有机硫的方法，其中加入的原油与水相的体积比为1∶15，处理温度为35℃
本发明利用红平红球菌在原油脱硫中的应用，其脱硫方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用红平红球菌（Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068；
(2)斜面培养：将菌种接种于含有质量体积比为1.6％的琼脂并加有质量体积比为0.008％的二苯并噻吩的固体斜面无机盐基本培养基上，32℃条件下，静止培养48小时；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于100mL含有质量体积比为0.008％的二苯并噻吩的液体无机盐基本培养基中，32℃条件下，振荡培养48小时，制得种子液；
(4)扩大培养：以10％的体积比的接种量，将种子液接种于100mL含有质量体积比为0.008％的二苯并噻吩液体无机盐基本培养基中，32℃条件下，振荡培养28小时；
(5)收集细胞：取步骤(4)所得的培养液5,000转/每分钟离心15分钟，收集沉淀细胞，使用pH 7.0磷酸缓冲液重悬细胞，再以相同的条件离心，重复2次，收集沉淀细胞；
(6)休止细胞制备：使用如步骤(5)的磷酸缓冲液重悬沉淀细胞，使菌体浓度达到12克干细胞/升，此细胞悬浊液即为制备好的红平红球菌休止细胞悬浊液，也称生物催化剂；
(7)处理样品：在100mL的反应体系中，以步骤(6)所得的休止细胞悬浊液作为水相，加入原油，使原油与水相的体积比为1∶15，在35℃条件下，250转/每分钟振荡60小时，进行样品处理；
(8)分离样品：以10,000转/每分钟离心10分钟分离步骤(7)中处理后的样品，得到上层原油样品；
(9)样品检测：取1μL步骤(8)中的原油样品，使用Antek7000硫氮元素分析仪(美国，Antek公司产品)测定原油中残留的硫含量，然后对照未处理的样品硫含量，得出经红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068处理的原油脱除率为39.5％；
在上述利用红平红球菌休止细胞脱除原油中有机硫的方法中，菌株培养使用液体基本无机盐培养基(Basal Salts Medium，BSM)，配方为：
甘油4克/升，KH2PO4 2.44克/升，Na2HPO4 14.04克/升，NH4Cl 2克/升，质量百分比为1％的CaCl2 100微升/升，质量百分比为10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，质量百分比为1％的FeCl3 100微升/升，维生素混合液200毫升/升的，离子混合液5毫升/升。121℃条件下灭菌20分钟。
以0.008％的DBT作为硫源。
上述固体斜面基本无机盐培养基为上述液体无机盐培养基成分添加质量体积百分比为1.6％的琼脂粉。
上述的离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有：ZnCl2 0.5g；FeCl2 0.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl120mmol/L。
上述的维生素混合液的配方为，每升蒸馏水含有：400mg泛酸钙(Calciumpantothenate)；200 mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
实施例7：利用红平红球菌ATCC 53968休止细胞脱除原油中有机硫的方法，其中加入的原油与水相的体积比为1∶20，处理温度为30℃；
(1)菌种选择：红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)ATCC 53968〖该菌株保藏于美国典型微生物收藏中心(12301 Park Lawn Drive，Rockville，Md.20852)〗；
(2)斜面培养：将菌种接种于含有质量体积比为1.6％的琼脂并加有质量体积比为0.01％的二苯并噻吩的固体斜面无机盐基本培养基上，30℃条件下，静止培养42小时；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于100mL含有质量体积比为0.01％的二苯并噻吩的液体无机盐基本培养基中，30℃条件下，振荡培养42小时，制得种子液；
(4)扩大培养：以10％的体积比的接种量，将种子液接种于100mL含有质量体积比为0.01％的二苯并噻吩液体无机盐基本培养基中30℃条件下，振荡培养36小时；
(5)收集细胞：取步骤(4)所得的培养液5,000转/每分钟离心15分钟，收集沉淀细胞，使用pH7.0磷酸缓冲液重悬细胞，再以相同的条件离心，重复2次，收集沉淀细胞；
(6)休止细胞制备：使用如步骤(5)的磷酸缓冲液重悬沉淀细胞，使菌体浓度达到18克干细胞/升。此细胞悬浊液即为制备好的红平红球菌休止细胞，也称生物催化剂；
(7)处理样品：在100mL的反应体系中，以步骤(6)所得的休止细胞悬浊液作为水相，加入原油，使原油与水相的体积比为1∶20，在30℃条件下，250转/每分钟振荡72小时，额外添加质量体积比为5％的葡萄糖，进行样品处理；
(8)分离样品：以10,000转/每分钟离心10分钟分离步骤(7)中处理后的样品，得到上层原油样品；
(9)样品检测：取1μL步骤(8)中的原油样品，使用Antek7000硫氮元素分析仪(美国，Antek公司产品)测定原油中残留的硫含量。对照未处理的样品硫含量，得出原油脱除率为15.3％。
在上述利用红平红球菌休止细胞脱除原油中有机硫的方法中，菌株培养使用液体基本无机盐培养基(Basal Salts Medium，BSM)，配方为：
甘油4克/升，KH2PO4 2.44克/升，Na2HPO4 14.04克/升，NH4Cl2克/升，质量百分比为1％的CaCl2 100微升/升，质量百分比为10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，质量百分比为1％的FeCl3 100微升/升，维生素混合液200毫升/升的，离子混合液5毫升/升。121℃条件下灭菌20分钟。
以0.01％的DBT作为硫源。
上述固体基本无机盐斜面培养基为上述液体无机盐培养基成分添加质量体积百分比1.6％的琼脂粉。
上述的离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有：ZnCl2 0.5g；FeCl2 0.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl120mmol/L。
上面所述的维生素混合物的配方为，每升蒸馏水含有：400mg泛酸钙(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
通过实施例7与实施例5的对比可以看到，红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068对原油的总硫含量达到62.3％的脱除率；同样条件下红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)ATCC 53968对相同原油只有15.3％的脱除率，说明上述的红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068具有更好的处理效果，在实际应用比ATCC 53968具有更大的价值。
序列表
SEQ ID N0.1
<110>山东大学
<120>一株红平红球菌及其在原油脱硫中的应用
<141>2005-9-11
<211>1413
<212>DNA
<213>红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)
<221>红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068 16S rDNA
<222>(1)…(1413)
<400>
ccctgacgaa cgctggcggc gtgcttaaca catgcaagtc gagcggtaag gcctttcggg 60
gtacacgagc ggcgaacggg tgagtaacac gtgggtgatc tgccctgcac ttcgggataa 120
gcctgggaaa ctgggtctaa taccggatat gacctcctat cgcatggtgg gtggtggaaa 180
gatttatcgg tgcaggatgg gcccgcggcc tatcagcttg ttggtggggt aatggcctac 240
caaggcgacg acgggtagcc gacctgagag ggtgaccggc cacactggga ctgagacacg 300
gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcga aagcctgatg 360
cagcgacgcc gcgtgaggga tgacggcctt cgggttgtaa acctctttca gcagggacga 420
agcgcaagtg acggtacctg cagaagaagc accggctaac tacgtgccag cagccgcggt 480
aatacgtagg gtgcaagcgt tgtccggaat tactgggcgt aaagagttcg taggcggttt 540
gtcgcgtcgt ttgtgaaaac cagcagctca actgctggct tgcaggcgat acgggcagac 600
ttgagtactg caggggagac tggaattcct ggtgtagcgg tgaaatgcgc agatatcagg 660
aggaacaccg gtggcgaagg cgggtctctg ggcagtaact gacgctgagg aacgaaagcg 720
tgggtagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacggtg ggcgctaggt 780
gtgggttcct tccacggaat ccgtgccgta gctaacgcat taagcgcccc gcctggggag 840
tacggccgca aggctaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggcggagcat 900
gtggattaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctgggt ttgacatata ccggaaagct 960
gcagagatgt ggcccccctt gtggtcggta tacaggtggt gcatggctgt cgtcagctcg 1020
tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccctatctta tgttgccagc 1080
acgttatggt ggggactcgt aagagactgc cggggtcaac tcggaggaag gtggggacga 1140
cgtcaagtca tcatgcccct tatgtccagg gcttcacaca tgctacaatg gccagtacag 1200
agggctgcga gaccgtgagg tggagcgaat ccct taaagc tggtctcagt tcggatcggg 1260
gtctgcaact cgaccccgtg aagtcggagt cgctagtaat cgcagatcag caacgctgcg 1320
gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcacg tcatgaaagt cggtaacacc 1380
cgaagccggt ggcttaaccc cttgtgggag gga 1413
Claims (9)
1.一株红平红球菌，其特征在于：该菌名为红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)，已于2005年6月20日保藏于中国典型微生物菌种保藏中心，其保藏编号为CCTCC M205068。
2.如权利要求1所述的红平红球菌在原油脱硫中的应用。
3.如权利要求2所述的红平红球菌在原油脱硫中的应用，其脱硫方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCC M205068；
(2)斜面培养：将菌种接种于含有质量体积比为1.5～2.0％的琼脂并加有质量体积比为0.003～0.01％的二苯并噻吩的固体斜面无机盐基本培养基上，25～37℃条件下，静止培养24～48小时；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于20～100mL含有质量体积比为0.003～0.01％的二苯并噻吩的液体无机盐基本培养基中，25～37℃条件下，振荡培养24～48小时，制得种子液；
(4)扩大培养：以5～10％的体积比的接种量，将种子液接种于100～1000mL含有质量体积比为0.003～0.01％的二苯并噻吩液体无机盐基本培养基中，25～37℃条件下，振荡培养24～42小时；
其中：上述液体基本无机盐培养基配方为：
甘油4克/升，KH2PO4 2.44克/升，Na2HPO4 14.04克/升，NH4Cl 2克/升，质量百分比为1％的CaCl2 100微升/升，质量百分比为10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，质量百分比为1％的FeCl3 100微升/升，维生素混合液200毫升/升的，离子混合液5毫升/升；
上述固体斜面基本无机盐培养基为上述液体无机盐培养基成分添加质量体积百分比为1.5～2.0％的琼脂粉；
上述的离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有：ZnCl2 0.5g；FeCl2 0.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L；
上述的维生素混合液的配方为，每升蒸馏水含有：400mg泛酸钙；200mg肌醇；400mg尼克酸/烟酸；400mg VB6；200mg对氨基苯甲酸；0.5mg VB12；
(5)收集细胞：取步骤(4)所得的培养液5,000转/每分钟离心10～15分钟，收集沉淀细胞，使用pH7.0磷酸缓冲液重悬细胞，再以相同的条件离心，重复2～3次，收集沉淀细胞；
(6)休止细胞制备：使用如步骤(5)的磷酸缓冲液重悬沉淀细胞，使菌体浓度达到10～30克干细胞/升，此细胞悬浊液即为制备好的红平红球菌休止细胞悬浊液，也称生物催化剂；
(7)处理样品：在反应体系中，以步骤(6)所得的休止细胞悬浊液作为水相，加入原油，使原油与水相的体积比为1∶10～20，在25～37℃条件下，250转/每分钟振荡48～72小时，进行样品处理；
(8)分离样品：以10,000转/每分钟离心5～10分钟分离步骤(7)中处理后的样品，得到上层原油样品；
(9)样品检测：取1～5μL步骤(8)中的原油样品，使用硫氮元素分析仪测定原油中残留的硫含量，然后对照未处理的样品硫含量，得出经红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)CCTCC M205068处理的原油脱除率。
4.如权利要求3所述的红平红球菌在原油脱硫中的应用，其特征在于，步骤(2)、(3)、(4)中所述的菌体培养温度是28～32℃；二苯并噻吩的浓度为0.005～0.01％。
5.如权利要求3所述的红平红球菌在原油脱硫中的应用，其特征在于，步骤(3)、(4)中所述的菌体培养时间是36～42小时。
6.如权利要求3所述的红平红球菌在原油脱硫中的应用，其特征在于，步骤(6)中所述的生物催化剂的菌体浓度是每升12～18克干细胞重的菌体。
7.如权利要求3所述的红平红球菌在原油脱硫中的应用，其特征在于，步骤(7)中所述的原油与水相的体积比例为1∶15～20。
8.如权利要求3所述的红平红球菌在原油脱硫中的应用，其特征在于，步骤(7)中处理样品的温度为28～35℃，样品振荡时间为60～72小时。
9.如权利要求3所述的红平红球菌在原油脱硫中的应用，其特征在于，步骤(7)中处理样品时额外添加质量体积百分比浓度为2～5％的葡萄糖。
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| CNB200510044599XA CN1323160C (zh) | 2005-09-14 | 2005-09-14 | 一株红平红球菌及其在原油脱硫中的应用 |
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| CNB200510044599XA CN1323160C (zh) | 2005-09-14 | 2005-09-14 | 一株红平红球菌及其在原油脱硫中的应用 |
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