CN108251412A - 红球菌菌株yf28-1-4的诱变筛选方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种红球菌菌株YF28‑1‑4的诱变筛选方法及应用，首先通过重离子辐照对红球菌(Rhodococcus erythropolis YF28‑1(8))基因组进行初次诱变，筛选出降解效果好的菌株再次通过超强诱变剂NTG对其进行复诱变，得到红球菌突变体库，再通过原油平板和和GC‑MS的筛选，得到转录系统和翻译系统发生突变的菌株YF28‑1‑4；本发明提供的红球菌(Rhodococcus erythropolis)菌株YF28‑1‑4具有高效的原油降解能力，同时，上述诱导筛选方法具有操作简单，周期短，效率高的优点，不仅可适用于红球菌，也适用于其他具有一定原油降解能力的微生物，具有很好的推广使用价值。

Description

红球菌菌株YF28-1-4的诱变筛选方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及原油高效降解菌诱变及快速获取方法及其应用。

背景技术

原油及其副产品作为一种重要的能源物质和工业原料正在被世界各国的人们广泛开采，其在社会经济发展中具有非常广泛的作用与功能。但由于有限的技术及淡薄的环保意识，使得环境中原油污染日益严重，破坏了正常的生态平衡。仅1996-1999年间在阿拉斯加每年大概都有407起原油泄漏事故；2010年大连新港原油泄漏事件，至少污染了附近50平方公里的海域，影响范围达100平方公里。全世界每年约有800万吨石油进入环境，如何安全有效地对石油污染的水和土壤环境进行修复，降低生态风险，已成国际焦点问题。

常用的原油污染修复手段有物理法、化学法及生物修复法。近年来，物理法和化学法因为成本高，操作复杂，对设备要求高，会产生二次污染等缺点，逐渐被生物修复法代替。生物修复法是利用微生物自身的代谢来分解污染物，其最终产物是CO2、H2O等物质，不会对环境产生二次污染，所以被认为是一种绿色的处理方法，而且利用菌株能降解一些用物理、化学方法不易降解的物质。

环境中主要参与烷烃降解的有细菌，真菌和酵母，目前研究发现降解活性最强，适用性最广的是细菌。目前，现代分子生物学技术发展迅速，已在诸多工业微生物菌种改造方面获得成功，但传统的诱变育种技术仍是获得优良菌株的重要手段。所以寻找一种新的高效的降解菌株的方法很有必要。

目前，研究表明原油降解基因的表达由多种转录调控因子调控。在Pseudomonasputida GPo1菌株中，在alkB基因上游的alkS基因是烷烃诱导的转录激活因子，烷烃的出现能够诱导alkB表达量升高。与以丙酮酸盐为碳源生长相比，Alcanivorax borkumensis SK2细胞以十六烷为碳源生长时，alkS基因的表达量显著提高。除了alkS基因外，还有其他调控因子参与原油降解基因的表达调控。在Alcanivorax borkumensis菌株中，alkS基因负责调控alkB1但与alkB2的表达量没有相关性，alkB2可能受其上游相邻基因GntR调控因子的调控。在A. borkumensis菌株中还有编码细胞色素P450的三个基因，AraC位于P450-1基因的上游，可能调控该氧化酶的表达。因此，从这个角度来讲，如果通过某些方法使微生物转录、翻译这些基因，这将是获得高效降解菌株的一种有效办法。

重离子辐照技术是80年代兴起的一种材料表面处理技术，由我国科学工作者余增亮首创，将重离子辐照技术应用于农作物品种改良并获得成功。在后续研究中，重离子辐照技术被逐步应用于微生物诱变育种和肿瘤治疗中。余曾亮等对重离子的作用机制总结为4方面：即能量沉积、动量传递、离子注入和电荷交换。这四种过程在生物体内发生的理化反应，形成的生物效应，使离子注入法育种具有许多独特的特点，这些开创性的研究工作受到国内外学术界的关注，为离子束生物工程学的发展奠定了基础，它将对生命科学中一些重大问题的研究提供技术支撑。同样，其在微生物育种中独具特色，因其损伤小、突变率高、突变谱广、诱变效果好，而受到愈来愈广泛的关注，并取得了显著的经济效益和社会效益。

NTG是亚硝基胍，是一种非常强的化学诱变剂。NTG诱发的突变主要是GC-AT转换，另外还有小范围切除、移码突变及GC对的缺失。利用重离子和NTG突变改变了原来的转录系统，从而对蛋白质翻译能力出现一定程度的改变，以提高微生物的原油降解能力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供了红球菌（Rhodococcus erythropolis）菌株YF28-1-4的诱变筛选方法及应用，此菌株YF28-1-4是以高效表达原油降解基因代谢基因簇的方法得到的。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：一种红球菌菌株YF28-1-4的诱变筛选方法，首先通过重离子辐照对红球菌（Rhodococcus erythropolis YF28-1（8））基因组进行初次诱变，筛选出降解效果好的菌株再次通过超强诱变剂NTG对其进行复诱变，得到红球菌突变体库，再通过原油平板和和GC-MS的筛选，得到转录系统和翻译系统发生突变的菌株YF28-1-4。

作为优选，红球菌菌株YF28-1-4的诱变筛选方法，包括以下步骤：

重离子辐照对红球菌进行初次诱变：将红球菌（Rhodococcus erythropolis YF28-1（8））制备为菌悬液，通过重离子辐照对菌悬液进行初次诱变，重离子束流为12C6+离子束，能量为831 MeV， LET 为45 keV/μm，得到重离子辐照过的初次诱变菌悬液，通过原油平板筛选出降解效果好的菌株得到初次诱变红球菌；

2）接着用化学诱变剂NTG对红球菌进行复诱变：将初次诱变红球菌制备为菌悬液，以NTG母液对菌悬液进行复诱变，得到NTG处理过的复诱变菌悬液；

3）用原油平板筛选转录翻译系统发生突变的菌株：将步骤2）得到的NTG处理过的复诱变菌悬液培养至对数生长期前中期后，用牙签将菌液接种于以原油为唯一碳源的MM琼脂糖培养基中，在25℃的条件下培养7-15 d，观察菌株在培养基上的生长情况，挑选菌落直径大的单菌落分别接于装有5mL液体培养基LB的试管中至对数生长期后，然后再接种于含有1%原油为唯一碳源的MM液体培养基中，进行GC-MS筛选，得到高效原油降解菌株YF28-1-4。

作为优选，MM液体培养基的配方为：氯化镁3.5g，硝酸铵1.0g，氯化钾0.35g，氯化钙0.05g，溴化钾0.08g，氯化铁0.01g，硫酸锌0.01%与氯化锶2.4%混合的金属盐溶液1mL，磷酸氢二钾10%与磷酸二氢钾10%混合的磷酸盐溶液10mL，ddH2O 989mL，pH调节至7.5左右。

作为红球菌菌株YF28-1-4的应用，菌株YF28-1-4应用在原油降解中。

作为红球菌菌株YF28-1-4的诱变筛选方法的应用，红球菌菌株YF28-1-4的诱变筛选方法应用在激活降解基因中。

与现有技术相比，本发明的有益之处是：

1、首先通过重离子辐照对红球菌基因组进行初次诱变，筛选出降解效果好的菌株再次通过超强诱变剂NTG对其进行复诱变，NTG的诱变率能达到百分之几十，而且是随机的，这样就能得到一个比较全面的红球菌突变体库。然后再利用原油平板和GC-MS进行筛选，得到高效的基因转录系统发生突变而能在含有原油的平板上大量生长的菌株。这些突变改变了原来的转录系统，从而对蛋白质翻译能力出现一定程度的改变。

2、本发明提供的红球菌（Rhodococcus erythropolis）菌株YF28-1-4具有高效的原油降解能力，同时，上述诱导筛选方法具有操作简单，周期短，效率高的优点，不仅可适用于红球菌，也适用于其他具有一定原油降解能力的微生物，具有很好的推广使用价值。

附图说明：

下面结合附图对本发明进一步说明。

图1为本发明提供的红球菌（Rhodococcus erythropolis）菌株YF28-1-4的诱变筛选方法的具体工艺流程图

图2为野生型红球菌（Rhodococcus erythropolis YF28-1（8））及其突变株的GC-MS实物对比结果图

图3为野生型红球菌（Rhodococcus erythropolis YF28-1（8））及其突变株的GC-MS对比结果示意图

具体实施方式：

下面结合附图及具体实施方式对本发明进行详细描述：

实施例1：

本发明如图1工艺流程图所示包括以下步骤，

通过重离子辐照对红球菌进行诱变：

重离子辐照菌种的处理方法：

1、培养基及所用溶液的制备：

LB（1L）：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水至1000 ml，pH调节至7.6左右。

pH7.0磷酸缓冲液：K2HPO4 2g/L，KH2PO4 8 g/L，0.1 MPa灭菌20min。

MM培养基：氯化镁3.5g，硝酸铵1.0g，氯化钾0.35g，氯化钙0.05g，溴化钾0.08g，氯化铁0.01g，金属盐溶液1mL（硫酸锌0.01%，氯化锶2.4%），磷酸盐溶液10mL（磷酸氢二钾10%，磷酸二氢钾10%），琼脂糖15g，ddH2O 定容至1L，pH调节至7.5左右，最后加1%（v/v）原油。

2、菌种制备：

接一环活化的出发菌株 YF28-1（8）于盛有 50 mL无菌LB培养基的 250 mL三角瓶中恒温振荡培养200 r/min，于25℃培养24h得到种子液。用pH7.0 的0.1 mol/L磷酸缓冲液梯度稀释将菌体浓度稀释为108-109个/mL，制成靶子悬液。接着取制备的靶子悬液2mL分别加入到铺有纱布的无菌 30 mm 皿中，用封口膜密封，分别于 200、300、400、500 Gy辐照剂量下处理。

3、诱变处理筛选：

将不同辐照剂量处理后的菌液稀释后涂布于LB琼脂培养基平板上，将长出的单菌落分别接于装有5 mL液体培养基LB的试管中，培养2d后将获得的菌液用牙签接种到以原油为唯一碳源的 MM 固体培养基中，25℃下倒置培养。筛选出菌落直径较大的菌株进行复诱变。

NTG诱变菌种的处理方法：

1、培养基及所用溶液的制备：

所用培养基同实施例1步骤1。

NTG母液的制备：称取0.1 g NTG加助溶剂甲酰胺或丙酮1mL，然后加入0.1 mol/L pH7.0磷酸缓冲液9 mL，配置成10mg/mL的NTG母液。

2、菌种制备：

将实施例1步骤3中得到的诱变菌株培养后，接于装有5 mL液体培养基LB的试管中，在25 ℃，200 r/min的摇床上培养3-7 d。

3、诱变菌悬液的制备：

取培养液至2 mL doff管中，8000 r/min 离心1 min，用pH 7.0 的0.1 mol/L磷酸缓冲液洗涤两次，然后重悬于2 mL pH 7.0的缓冲悬液。

4、NTG诱变处理筛选：

在菌悬液中加入NTG母液，使其终浓度为1 mg/mL，处理60min。

处理完毕，将菌悬液8000 r/min离心1 min，用pH 7.0 的0.1 mol/L磷酸缓冲液洗涤两次，之后重悬于2 mL pH 7.0的缓冲悬液。处理后的菌液同实施例1步骤3操作进行筛选。

通过GC-MS筛选转录系统发生突变的菌株：

将复诱变筛选得到的菌株接种于LB液体培养基中，25℃培养2 d离心，弃掉上清后用无菌生理盐水洗涤并调整菌液浓度至OD600=0.7，接种菌液到以原油（1%（v/v））为唯一碳源的MM液体培养基中，25℃震荡培养7-10d。用正己烷洗涤菌液并全部倒入60ml的分液漏斗，充分震荡使其中剩余原油充分萃取到有机溶剂相中，静置分层后用无水Na2SO4脱水，用 0.22µm耐有机溶剂滤膜过滤，将过滤后的溶液进行GC-MS分析。

实验所用色谱柱为VARIAN（30 m×0.25 mm×0.25 µm）石英毛细管柱；检测器温度为280℃；升温程序：60℃恒温2min，以升温速率为8℃/min升温到280℃，然后再恒温5min；载气（N2）流量为1 mL/min；进样口温度为270℃；进样量为2 µL；分流比为1:1 （V/V）。

从图3的结果可以看出，经此方法处理后，野生型红球菌（Rhodococcus erythropolisYF28-1（8））的原油降解能力发生了很大改变，其突变株4的降解能力约为野生型的6倍，且复诱变的方法比单个诱变后的效果强。野生型Rhodococcus erythropolis YF28-1（8）本身的原油降解能力并不是很高，经此方法处理后，其突变株4、9都有了明显的降解活性，说明突变株产生了具有高效降解原油的物质。这说明此方法能激活微生物的一些沉默基因，提高菌株对原油污染物的降解能力及适应能力。

需要强调的是：对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (5)

1.一种红球菌菌株YF28-1-4的诱变筛选方法，其特征在于：首先通过重离子辐照对红球菌(Rhodococcus erythropolis YF28-1(8))基因组进行初次诱变，筛选出降解效果好的菌株再次通过超强诱变剂NTG对其进行复诱变，得到红球菌突变体库，再通过原油平板和和GC-MS的筛选，得到转录系统和翻译系统发生突变的菌株YF28-1-4。

2.根据权利要求1所述的红球菌菌株YF28-1-4的诱变筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)重离子辐照对红球菌进行初次诱变：将红球菌(Rhodococcus erythropolis YF28-1(8))制备为菌悬液，通过重离子辐照对菌悬液进行初次诱变，重离子束流为12C6+离子束，能量为831MeV，LET为45keV/μm，得到重离子辐照过的初次诱变菌悬液，通过原油平板筛选出降解效果好的菌株得到初次诱变红球菌；

2)接着用化学诱变剂NTG对红球菌进行复诱变：将初次诱变红球菌制备为菌悬液，以NTG母液对菌悬液进行复诱变，得到NTG处理过的复诱变菌悬液；

3)用原油平板筛选转录翻译系统发生突变的菌株：将步骤2)得到的NTG处理过的复诱变菌悬液培养至对数生长期前中期后，用牙签将菌液接种于以原油为唯一碳源的MM琼脂糖培养基中，在25℃的条件下培养7-15d，观察菌株在培养基上的生长情况，挑选菌落直径大的单菌落分别接于装有5mL液体培养基LB的试管中至对数生长期后，然后再接种于含有1％原油为唯一碳源的MM液体培养基中，进行GC-MS筛选，得到高效原油降解菌株YF28-1-4。

3.根据权利要求2所述的红球菌菌株YF28-1-4的诱变筛选方法，其特征在于：MM液体培养基的配方为：氯化镁3.5g，硝酸铵1.0g，氯化钾0.35g，氯化钙0.05g，溴化钾0.08g，氯化铁0.01g，硫酸锌0.01％与氯化锶2.4％混合的金属盐溶液1mL，磷酸氢二钾10％与磷酸二氢钾10％混合的磷酸盐溶液10mL，ddH2O 989mL，pH调节至7.5左右。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的红球菌菌株YF28-1-4的应用，其特征在于：菌株YF28-1-4应用在原油降解中。

5.根据权利要求1所述的红球菌菌株YF28-1-4的诱变筛选方法的应用，其特征在于：红球菌菌株YF28-1-4的诱变筛选方法应用在激活降解基因中。