CN106350454A - 一种石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的筛选方法 - Google Patents

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张玥
王志成
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Abstract

本发明公开了一种石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的筛选方法，其步骤如下：一、取含油土壤放入三角瓶中，摇匀，静止至完全沉降；二、取上清液接入含有基础培养液的三角瓶中，富集培养；三、取富集培养液接入含有基本培养液的三角瓶中，震荡培养；四、将培养液倍比稀释，取培养液涂布在含基本培养基的固体平板上，将平板放在培养箱中培养直至长出菌落；五、将单菌落划线纯化后进行低温氨氮降解试验，即可得到石油产品脱硫菌株。本发明筛选出的石油产品脱硫巨大芽孢杆菌能够广泛降解石油产品中的DBT，对降低空气污染和酸雨以及生态环境修复具有重要意义。

Description

一种石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的筛选方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种巨大芽孢杆菌的筛选方法。
背景技术
在环境法规所要求的硫含量变得越来越低的同时，世界上大多数国家对汽油和柴油的需求量却在持续增加。
硫主要以杂环化合物的形式存在于化石燃料中，包括二甲基亚砜、噻吩、二苯并噻吩(DBT)及其他噻吩。化石燃料燃烧后，硫主要以SO2形式排入大气，不仅腐蚀设备，还会对空气造成严重污染，甚至形成酸雨。因此，世界各国都制定了日益严格的环保法规对清洁燃料的生产提出了更为苛刻的要求。解决这一问题的重要途径之一是对油品进行深度脱硫，传统的加氢脱硫方法(HDS)成本较高，需要高温高压条件，操作较困难，而且去除噻吩及其衍生物的杂环硫成本较高。因此，HDS已经难以满足日益严格的脱硫要求。
生物脱硫是在温和的反应条件下，以酶为催化剂，首先在细菌帮助下，将有机硫化物分子从油中转移到细胞中，然后在酶的作用下发生氧化反应，除去有机硫化物。
发明内容
本发明的目的是提供一种石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的筛选方法，该方法筛选出的石油产品脱硫巨大芽孢杆菌能够广泛降解石油产品中的DBT，对降低空气污染和酸雨以及生态环境修复具有重要意义。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的筛选方法，包括如下步骤：
一、取80～120g含油土壤放入500mL三角瓶中，摇匀，静止至完全沉降；
二、取上清液接入含有80～120mL基础培养液的250mL三角瓶中，25～35℃，150～200r/min富集培养5～10天；
三、取1～5mL富集培养液接入含有100mL基本培养液的三角瓶中，3个平行样，20～40℃，150～200r/min震荡培养3～5天；
四、将培养液倍比稀释至1000倍，取100μL培养液涂布在含基本培养基的固体平板上，将平板放在20～40℃培养箱中培养直至长出菌落；
五、将单菌落划线纯化后进行低温氨氮降解试验，即可得到石油产品脱硫菌株。
本发明中，所述基本培养液由6.0～10.0g/L葡萄糖、2.0～3.0g/L NH4Cl、6.0～7.0g/L KH2PO4、8.0～9.0g/L K2HPO4、0.2～0.4g/L MgCl2·6H2O、0.5～1.5mL/L微量元素溶液母液、0.5～1.5mL/L维生素溶液母液和余量的蒸馏水组成，总体积为100mL，121℃灭菌30min。
本发明中，所述微量元素母液由0.6～1.0g/L FeCl2·4H2O、0.6～1.0g/L ZnCl2、0.6～1.0g/L MnCl2·4H2O、0.1～0.3g/L NaMoO4·2H2O、0.06～0.10g/L CuCl2、0.06～0.10g/L NaWO4·2H2O和140～160mmol/L HCl组成。
本发明中，所述维生素母液由400～600mg/L泛酸钙、200～400mg/L肌醇、400～600mg/L烟酸、400～600mg/L盐酸吡哆醇、200～400mg/L对氨基甲苯和0.6～0.8mg/L维生素B12组成。
本发明中，所述基本培养基由基本培养液和琼脂组成。
本发明具有如下优点：
1、本发明筛选得到的石油产品脱硫巨大芽孢杆菌可以在常温条件下降解石油产品中的DBT，48h对DBT降解率为40～50％。
2、本发明筛选得到的石油产品脱硫巨大芽孢杆菌为好氧菌，可在30℃条件下进行好氧脱硫反应，可独立高效完成石油产品脱硫全过程。初始二苯并噻吩为50mg/L，30℃，48h能够将40～50％的二苯并噻吩转化为2-羟基联苯。
3、本发明筛选得到的石油产品脱硫巨大芽孢杆菌能够广泛降解石油产品中的DBT，降低空气污染和酸雨以及生态环境修复具有重要意义。
附图说明
图1为石油产品脱硫巨大芽孢杆菌在培养基上的菌落形态图；
图2为石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的系统进化树图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
本发明提供了一种石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的筛选方法，该石油产品脱硫巨大芽孢杆菌是从黑龙江省大庆油田含油土壤中分离筛选得到，具体筛选过程如下：
一、取100g含油土壤放入500mL三角瓶中，摇匀，静止至完全沉降；
二、取上清液接入含有100mL基础培养液的250mL三角瓶中，30℃，160r/min富集培养5天；
三、取1mL富集培养液接入含有100mL基本培养液的三角瓶中，3个平行样，30℃，160r/min震荡培养3天；
四、将培养液倍比稀释至1000倍，取100μL培养液涂布在含基本培养基的固体平板上，将平板放在30℃培养箱中培养直至长出菌落；
五、将单菌落划线纯化后进行低温氨氮降解试验，即可得到石油产品脱硫菌株，该菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)HNHHJ-1。
本发明中，所述基本培养液由8.0g/L葡萄糖、2.5g/L NH4Cl、6.5g/L KH2PO4、8.5g/L K2HPO4、0.3g/L MgCl2·6H2O、1.0mL/L微量元素溶液母液、1.0mL/L维生素溶液母液和余量的蒸馏水组成，总体积为100mL，121℃灭菌30min。
本发明中，所述微量元素母液由0.8g/L FeCl2·4H2O、0.8g/L ZnCl2、0.8g/LMnCl2·4H2O、0.2g/L NaMoO4·2H2O、0.08g/L CuCl2、0.08g/L NaWO4·2H2O和150mmol/LHCl组成。
本发明中，所述维生素母液由500mg/L泛酸钙、300mg/L肌醇、500mg/L烟酸、500mg/L盐酸吡哆醇、300mg/L对氨基甲苯和0.8mg/L维生素B12组成。
本发明中，所述基本培养基由基本培养液和琼脂组成。
对上述方法所得到的菌株进行形态、培养特性和生理生化特性鉴定，具体步骤如下：将低温培养48小时的菌体进行革兰氏染色后在1000倍显微镜下观察菌体大小和菌体颜色；将菌液倍比稀释后涂布在基本培养基平板上，观察菌落形态和颜色；将液体菌液培养4-7天，观察有无色素产生；将菌株进行氧化酶、接触酶、精氨酸双水解酶、葡萄糖和蔗糖发酵，V.P、M.R和明胶液化试验。
结果：
形态特征：杆状，末端圆，有芽孢，大小为1.2～1.5μm×2.0～4.0μm；菌落圆形，在培养基上菌落乳白色(图1)。
生理生化特征：革兰氏阳性好氧菌，氧化酶阴性，接触酶阴性，精氨酸双水解酶阴性，利用葡萄糖和蔗糖，V.P阳性，M.R阴性，液化明胶慢；生长温度为4～37℃，最适生长温度为25～30℃，生长pH值为5.0～11.0，最适生长pH值为7.0～8.0，C/N＝1～20，最适C/N＝12。
对所得到的菌株进行16S rDNA序列分析：取4mL液体样品，分多次加入灭菌的2mL离心管中，10000rpm室温离心3min，弃置上层液体，倒置2mL管于吸水纸上1min，直至没有液体流出，获得总DNA，用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，将PCR产物进行琼脂凝胶电泳，回收大小在400bp以上的PCR产物，选用0.6倍的磁珠(Agencourt AMPure XP)处理，结果得到480bp DNA序列，利用软件RDP classifier进行同源序列比对，用MEGAN软件构建系统发育树(如图2)，结果与巨大芽孢杆菌的16S rDNA序列最为接近，相似性为99％；结合菌体形态特征、生长特性、生理生化特性，确定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)。
石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的好氧脱硫：
菌株对不同碳源的利用：以氯化铵为唯一氮源，改变碳源，碳源分别为葡萄糖、麦芽糖和可溶性淀粉。培养液中的氯化铵含量为2.5g/L，碳源含量为葡萄糖或麦芽糖8g/L，可溶性淀粉3g/L，微量元素母液和维生素母液各1mL，pH7.2。100mL培养液装在250mL三角瓶中，30℃，160r/min震荡培养2天，每个处理3个平行，测定菌浊度(OD660)。结果见表1，菌株能够很好利用3种碳源，对可溶性淀粉的利用效果最好。
表1不同碳源对菌株生长的影响
碳源 葡萄糖 麦芽糖 可溶性淀粉
初始OD660 0.054±0.09 0.051±0.09 0.032±0.11
OD660(24h) 0.383±0.10 0.365±0.10 0.297±0.13
OD660(48h) 0.652±0.19 0.667±0.16 0.636±0.15
菌株对不同氮源的利用：以葡萄糖为唯一碳源，改变氮源，氮源分别为尿素、酵母提取物、蛋白胨、亚硝酸钠、氯化铵、硝酸铵。培养液中的葡萄糖含量为8g/L，氮源含量为2.5g/L，微量元素母液和维生素母液各1mL，pH7.2。100ml培养液装在250ml三角瓶中，30℃，160r/min震荡培养2天，每个处理3个平行，测定菌浊度(OD660)。结果见表2，菌株能够很好利用6种氮源，对氯化铵的利用效果最好。
表2不同氮源对菌株生长的影响
不同浓度的氮源对菌株降解DBT的能力：以葡萄糖为唯一碳源，氯化铵为唯一氮源，浓度分别为0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L和3.0g/L，将100mL培养液装在250mL三角瓶中，30℃，160r/min震荡培养3天，每个处理3个平行，用循环水真空过滤器进行过滤，取200mL抽滤后的发酵液，加入等体积的正己烷，振荡2min，充分混匀萃取两次，合并正己烷，旋转蒸发除去正己烷，蒸发瓶内残留物用甲醇定容至10mL，用UPLC样品过滤专用滤膜过滤后，用超高效液相色谱分析(超高效液相色谱检测分析条件：PDA检测器，色谱柱为ACQVITY DPLC@BEH C18，柱温30℃，流动相为甲醇:水(90:10，V/V)，使用超声脱气，各样品均用0.22μm滤膜过滤并经过脱气处理；流速0.2mL/min，进样量2μL。)。测定二苯并噻吩残余量和2-羟基联苯生成量。结果见表3，菌株降解DBT和生成2-HBP的效果。
表3不同浓度氮源对菌株降解DBT和2-HBP生成的效果

Claims (8)

1.一种石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于所述方法步骤如下
一、取80～120g含油土壤放入500mL三角瓶中，摇匀，静止至完全沉降；
二、取上清液接入含有80～120mL基础培养液的250mL三角瓶中，25～35℃，150～200r/min富集培养5～10天；
三、取1～5mL富集培养液接入含有100mL基本培养液的三角瓶中，3个平行样，20～40℃，150～200r/min震荡培养3～5天；
四、将培养液倍比稀释至1000倍，取100μL培养液涂布在含基本培养基的固体平板上，将平板放在20～40℃培养箱中培养直至长出菌落；
五、将单菌落划线纯化后进行低温氨氮降解试验，即可得到石油产品脱硫菌株。
2.根据权利要求1所述的石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于所述基本培养液由6.0～10.0g/L葡萄糖、2.0～3.0g/L NH4Cl、6.0～7.0g/L KH2PO4、8.0～9.0g/LK2HPO4、0.2～0.4g/L MgCl2·6H2O、0.5～1.5mL/L微量元素溶液母液、0.5～1.5mL/L维生素溶液母液和余量的蒸馏水组成，总体积为100mL，121℃灭菌30min。
3.根据权利要求1所述的石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于所述基本培养液由8.0g/L葡萄糖、2.5g/L NH4Cl、6.5g/L KH2PO4、8.5g/L K2HPO4、0.3g/L MgCl2·6H2O、1.0mL/L微量元素溶液母液、1.0mL/L维生素溶液母液和余量的蒸馏水组成，总体积为100mL，121℃灭菌30min。
4.根据权利要求2所述的石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于所述微量元素母液由0.6～1.0g/L FeCl2·4H2O、0.6～1.0g/L ZnCl2、0.6～1.0g/L MnCl2·4H2O、0.1～0.3g/L NaMoO4·2H2O、0.06～0.10g/L CuCl2、0.06～0.10g/L NaWO4·2H2O和140～160mmol/L HCl组成。
5.根据权利要求2所述的石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于所述微量元素母液由0.8g/L FeCl2·4H2O、0.8g/L ZnCl2、0.8g/L MnCl2·4H2O、0.2g/L NaMoO4·2H2O、0.08g/L CuCl2、0.08g/L NaWO4·2H2O和150mmol/L HCl组成。
6.根据权利要求2所述的石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于所述维生素母液由400～600mg/L泛酸钙、200～400mg/L肌醇、400～600mg/L烟酸、400～600mg/L盐酸吡哆醇、200～400mg/L对氨基甲苯和0.6～0.8mg/L维生素B12组成。
7.根据权利要求2所述的石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于所述维生素母液由500mg/L泛酸钙、300mg/L肌醇、500mg/L烟酸、500mg/L盐酸吡哆醇、300mg/L对氨基甲苯和0.8mg/L维生素B12组成。
8.根据权利要求1、2或3所述的石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于所述基本培养基由基本培养液和琼脂组成。
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