CN104651269A - 一株高效降解dbt类的脱硫菌及其在脱硫方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株高效降解DBT类的脱硫菌及其在脱硫方面的应用,属于生物脱硫技术领域。本发明的戈登氏菌Gordonia sp.JDZX5,保藏编号为:CCTCC NO:M2014650。该菌株对4,6-二甲基二苯并噻吩,二苯并噻吩,苯并噻吩,噻吩都具有降解能力,说明该菌株具有较宽的底物利用能力和较强的有机溶剂耐受性。用该菌的生长态细胞和静息态细胞在单水相和油水两相体系中对二苯并噻吩为模式的有机含硫化合物进行脱硫试验时发现该菌能在油水两相体系中迅速的生长,说明该菌株具有较强的有机溶剂耐受性,同时发现该菌株在油水两相体系中脱硫效率更高。该菌适于工业燃料油的脱硫,有望广泛用于工业燃料油的脱硫。
Description
技术领域
本发明涉及一株高效降解DBT类的脱硫菌及其在脱硫方面的应用,属于生物脱硫技术领域。
背景技术
石油的开发与利用在促进经济快速发展的同时,也带来了一系列问题,其中最突出的是其燃烧所释放的硫氧化物,会对人体健康,环境和国民经济带来恶劣影响。如硫氧化物所形成酸雨酸雾,会腐蚀建筑,酸化土壤,河流,造成农作物减产,大批水生物死亡等。随着人们环保意识的加强,国家相应出台了一系列的法律法规来限制车用燃料油的含硫量。中国在2003年允许车用汽油的硫含量为800ppm,到2011年时,车用汽油的硫含量要控制在50ppm以下。这些越来越苛刻的控制硫含量的指标给石油精炼产业带来了巨大的成本压力。目前燃料油深度脱硫的主要技术为加氢脱硫。加氢脱硫即在高温高压和催化剂的作用下,利用氢气还原硫化物中的硫形成硫化氢而将硫化物中的硫脱除。该技术均有反应条件苛刻,需要高温高压,消耗大量的氢气,产生大量的二氧化碳,反应成本高等缺点。此外,该技术还有一个致命的弱点是对二苯并噻吩(DBT)类含硫化合物脱硫效率低。为此新的脱硫技术的研发势在必行。生物脱硫技术即利用微生物的自身代谢,通过体内的酶促作用将燃料油中硫在温和条件下高效脱除。该技术因其能在常温常压不影响石油热值的情况下,高效的脱除二苯并噻吩类顽固性硫化物中的硫,而受到世界各国研究者的广泛重视。但该技术要用到实际生产中仍然有很多瓶颈,其中最大的一个问题是目前国际上所分离的脱硫菌株的脱硫效率不高,对有机溶剂的耐受性差。
因此,筛选一株耐有机溶剂并能高效降解二苯并噻吩类顽固性含硫化合物的脱硫菌株,对进一步促进生物脱硫技术在燃料油脱硫的应用及为重要。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足,提供一株能高效降解二苯并噻吩类的脱硫菌株及其在车用柴油中的应用。
本发明解决的第一个问题是提供了一株能高效降解二苯并噻吩类的脱硫菌,所述菌株命名为戈登氏菌(Gordonia sp.)JDZX5,于2014年12月19日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址为中国武汉大学,保藏编号为CCTCC NO:M 2014650。
所述菌株筛选来自克拉玛依油田井口采集的被原油污染的土样,是通过构建快速筛选方法而得到的。
所述菌株的筛选方法:在克拉玛依油田井口取样,采用加有DBT的BSM的液体培养基富集培养2次以上,取培养液分析其代谢产物,对含有二羟基联苯峰的培养液,再于加有DBT的BSM的固体培养基进行分离,挑取单菌落入BSM-DBT液体培养基培养并测定代谢产物,将能代谢二苯并噻吩并能转化为二羟基联苯的菌株进行纯化获得纯菌。
所述菌株为短杆状、革兰氏阳性、无鞭毛、有荚膜。经过16S rRNA鉴定,JDZX5与戈登氏菌属的亲缘关系超过了99%。所述菌株能以4,6-二甲基二苯并噻吩、二苯并噻吩(DBT)、苯并噻吩(BTH)或噻吩(TH)为硫源生长。还能脱除二苯并噻吩中的硫元素,同时不影响燃料油的热值。
所述菌株的最适生长pH为7.0,能在模拟柴油(正十六烷)与水混合的两相培养基中生长,并能完全脱除模拟柴油中的二苯并噻吩中的硫,将其转化为二羟基联苯(2-HBP)。
所述菌株降解燃料油中主要含硫化合物的最适pH范围是6.5-7.5。
所述菌株在最优的温度与pH条件下,在以4,6-二甲基二苯并噻吩,二苯并噻吩,苯并噻吩和噻吩为单一硫源的培养基中生长,其生长强度由高到低为:二苯并噻吩>4,6-二甲基二苯并噻吩>噻吩>苯并噻吩。
本发明解决的另一个技术问题是提供了一种所述戈登氏菌(Gordoniasp.)JDZX5在脱硫方面的应用。
所述应用,在本发明的一种实施方式中,是将对数生长期(即生长态细胞)的Gordonia sp.JDZX5接种于含有DBT类化合物(即4,6-二甲基二苯并噻吩,二苯并噻吩,苯并噻吩或噻吩)的油水两相体系的培养基中进行培养,脱除DBT类化合物中的硫元素。所述培养,在本发明的一种实施方式中,是指在28-37℃,pH 6-10,振荡培养20h以上。
所述应用,在本发明的一种实施方式中,是将对数生长期的Gordonia sp.JDZX5接种于含有DBT类化合物的油水两相体系的培养基中进行培养,培养条件为30-32℃,pH 6.5-7.5,振荡培养47h以上。在此条件下,脱硫率能达到100%。
所述应用,在本发明的一种实施方式中,是收集对数生长后期的Gordonia sp.JDZX5菌体添加到油水两相体系中进行培养,脱除DBT类化合物中的硫元素。所述培养,在本发明的一种实施方式中,是指在28-37℃,pH 6-10,振荡培养。
所述应用,在本发明的一种实施方式中,是收集对数生长后期的Gordonia sp.JDZX5菌体添加到油水两相体系中进行培养,脱除DBT类化合物中的硫元素,培养条件为30-32℃,pH 6.5-7.5,振荡培养14h以上。在此条件下,脱硫率能达到73.3%以上。
本发明提供的戈登氏菌(Gordoniasp.)JDZX5,与其进十年文献报道新发现的脱硫菌株相比,具有以下有益效果:(1)戈登氏菌(Gordonia sp.)JDZX5能脱除4,6-二甲基二苯并噻吩、二苯并噻吩、苯并噻吩和噻吩中的硫元素;(2)对二苯并噻吩具有较高的脱硫能力,脱硫率可达100%;(3)高效脱除二苯并噻吩中的硫元素的同时不影响燃料油的热值;(4)能够耐受有机溶剂,在20%的有机溶剂中能生长;(5)可于油水两相体系中,对各种燃料油进行脱硫。
生物材料保藏
戈登氏菌(Gordonia sp.)JDZX5,分类学命名为:戈登氏属JDZX5Gordonia sp.JDZX5,于2014年12月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏地址为中国武汉大学,保藏编号为CCTCC NO:M 2014650。
附图说明
图1:戈登氏菌(JDZX5)在透射电镜下的细胞形态;
图2:戈登氏菌JDZX5生长态细胞在水相和油水两相体系中降解二苯并噻吩的脱硫曲线;
图3:戈登氏菌JDZX5静息态细胞在水相和油水两相体系中降解二苯并噻吩的脱硫曲线。
具体实施方式
实施例1:菌株筛选
取新疆克拉玛依油田油井开采处被原油污染的土壤2g左右溶解于100mlBSM-DBT培养液中,富集培养4天,重复3-4次,再取培养液用乙酸乙酯萃取后进行高压液相分析其代谢产物,对含有二羟基联苯的培养液,采用画线法和涂布法在BSM-DBT固体选择培养基中进行分离,3天之后菌落生成,挑取单菌落放入BSM-DBT液体培养基中培养,培养四天后用上述方法测定代谢产物,将能代谢二苯并噻吩并能转化为二羟基联苯的菌株进行重复4次纯化获得纯菌。
实施例2:菌株鉴定
采用细菌全基因组快速抽提试剂盒,提取纯培养物的全基因组,并通过16S rDNA通用引物进行PCR,鉴定菌株属于戈登氏菌属,命名为戈登氏菌JDZX5(Gordonia sp.JDZX5)。
实施例3:菌株生理生化研究
采用透射电镜观察上述JDZX5的形态如图1。由图可知该菌短杆状,有荚膜。该菌株的最适生长温度为30℃,在28-37℃也能较好生长。采取初始pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0在最适温度下进行培养,确定最适生长pH 7.0。该菌对碱的耐受性强于酸,在pH 6-10均能较好地生长,当pH在4.0以下时菌体几乎不生长,当pH为11时仍能缓慢生长。
通过对该菌株进行革兰氏染色,荚膜染色,氧化酶实验,接触酶实验等生理生化实验确定该菌为革兰氏阳性,无鞭毛,有荚膜,氧化酶阴性,接触酶阳性。
将对数生长期的细胞按1%的接种量接种到含车用柴油20%的BSM培养基中培养7天,结果发现油水界面处存在大量菌体。车用柴油为典型的有机溶剂,该菌体能在油水界面处大量生长,表明该菌体对有机溶剂有较强耐受性。
实施例4:菌株对硫源的利用
菌株在最优的温度与pH条件下,在以4,6-二甲基二苯并噻吩,二苯并噻吩,苯并噻吩和噻吩为单一硫源的培养基中生长,同时以不加硫源的培养基作为对照,菌体的生长情况如表1。由表1可知,菌体培养3天后,在不加硫源的培养基中菌体干重为0.054g/L,而在4,6-二甲基二苯并噻吩,二苯并噻吩,苯并噻吩,噻吩为唯一硫源的培养基中菌体干重分别为0.372g/L,0.714g/L,0.081g/L,0.156g/L。结果显示菌体在4,6-二甲基二苯并噻吩,二苯并噻吩,苯并噻吩,噻吩为硫源的培养基中菌体干重高于无硫源的培养基,说明菌体能利用这些硫源供其自身生长,同时根据菌体的细胞干重可得出菌体对不同硫源的偏好程度,由高到低为:二苯并噻吩>4,6-二甲基二苯并噻吩>噻吩>苯并噻吩。
表1:用戈登氏菌JDZX5处理不同有机含硫化合物的菌体生长情况
通过对该菌株处理二苯并噻吩的代谢产物进行气相分析,结果发现菌体仅脱除二苯并噻吩中的硫元素形成二羟基联苯,并不降解苯环结构。说明该菌体在脱硫的同时不影响燃料油的热值。
同时比较了该菌株与目前分离出来的一些脱硫菌菌株的脱硫能力,结果如表2:
表2不同脱硫菌对DBT的脱硫能力比较
实施例5:生长态细胞菌株在单水相和油水两相体系的脱硫应用
将处于对数生长期的细胞(即生长态细胞)戈登氏菌JDZX5按1%的接种量接种到100ml含0.3mmol/L DBT的BSM培养基中,控制初始pH为7.0,在30℃,170r/min摇床培养81h,每隔8h取一次样,用乙酸乙酯萃取后于气相中分析底物(DBT)和产物(HBP)的浓度。
其中BSM培养基组成为:10g甘油,5g K2HPO4,2g NaH2PO4·2H2O,2g NH4Cl,0.2g MgCl2·6H2O和1ml微量元素溶液溶于1000ml双蒸水(pH 7.0)。微量元素溶液组成:0.1g CuCl2·2H2O,0.2g ZnCl2,20g CaCl2,0.05g H3BO3,0.2g NH4Mo4·2H2O,4g FeCl3·6H2O,0.1gAlCl3·6H2O,0.8g MnCl2·4H2O和4g CoCl2·6H2O溶于1000ml双蒸水。
该菌株的生长态细胞在单水相和油水两相体系脱硫情况如图2所示。其中单水相体系指含有0.3mmol/L DBT的BSM培养液。油水两相体系指含有0.3mmol/L DBT的正十六烷与BSM混合培养液,其中正十六烷与BSM培养液的体积比为1:4。
由图2可看出,在单水相体系中反应57h,DBT去除率达到100%,在油水两相体系中反应47h即能100%去除DBT,说明该菌株在油水两相体系中脱硫速率明显高于单水相体系,在油水两相体系中二苯并噻吩中硫全部脱除所用时间比单水相提前10h左右。
实施例6:静息态细胞菌株在单水相和油水两相体系的脱硫应用
将对数生长后期的戈登氏菌JDZX5细胞在8000r,5min离心收集菌体,后用磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗两次,得到菌体浓度为9.6g/L。在单水相体系中,将DBT直接加到含菌体的磷酸缓冲液中,30℃,170r/min培养14h,每隔两小时取一次样。在油水两相体系中,含菌体的磷酸缓冲液与正十六烷的比值为1:1,在相同培养条件下,每隔两小时取一次样。
结果如图3所示,由图可知,在油水两相体系中反应14h,DBT浓度由0.3mmol/L降低到了0.08mmol/L,DBT的脱硫率达到了73.3%,而单水相体系反应14h后DBT的去除率为38.89%。说明该菌的静息态细胞更适合于在油水两相体系中脱硫。
综上实施例5-6分析,戈登氏菌JDZX5能在含有机溶液的培养基中快速生长,具有较强的有机溶剂耐受性。同时该菌生长态细胞和静息态细胞在油水两相体系脱硫效率都明显高于单水相体系,这一结果表明该菌株非常适合燃料油的脱硫。有望应用于大规模燃料油脱硫。
实施例7:戈登氏菌JDZX5菌株的脱硫应用
将对数生长期(即生长态细胞)的Gordonia sp.JDZX5接种于含有DBT类(即4,6-二甲基二苯并噻吩,二苯并噻吩,苯并噻吩或噻吩)浓度为0.3mmol/L的油水两相体系的培养 基中进行培养。培养条件为28-37℃,pH 6-10,振荡培养20h以上。结果发现菌株能够脱除DBT类化合物中的硫元素。
实施例8:戈登氏菌JDZX5菌株的脱硫应用
收集对数生长后期的Gordonia sp.JDZX5菌体添加到含有DBT类(即4,6-二甲基二苯并噻吩,二苯并噻吩,苯并噻吩或噻吩)浓度为0.3mmol/L的油水两相体系中进行培养,培养条件为28-37℃,pH 6-10,振荡培养。结果发现菌株脱除DBT类化合物中的硫元素。
在此说明书中,本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是,很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此,说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。
Claims (10)
1.一株戈登氏菌(Gordonia sp.)JDZX5,于2014年12月19日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址为中国武汉大学,保藏编号为CCTCC NO:M 2014650。
2.根据权利要求1所述的戈登氏菌JDZX5,其特征在于,所述戈登氏菌能以4,6-二甲基二苯并噻吩、二苯并噻吩、苯并噻吩或噻吩为硫源生长。
3.根据权利要求1所述的戈登氏菌JDZX5,其特征在于,所述戈登氏菌能脱除二苯并噻吩中的硫元素,同时不影响燃料油的热值。
4.权利要求1所述戈登氏菌JDZX5在脱硫方面的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述应用是脱除噻吩类含硫有机物中的硫元素。
6.根据权利要求4或5所述的应用,其特征在于,所述脱硫是脱除4,6-二甲基二苯并噻吩,二苯并噻吩,苯并噻吩或噻吩中的硫元素。
7.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述脱除二苯并噻吩中硫元素的最适pH为6.5-7.5。
8.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述应用是将生长态的Gordonia sp.JDZX5接种于含有DBT类化合物的油水两相体系的培养基中进行培养。
9.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述应用是将静息态的戈登氏菌JDZX5菌体添加到含有DBT类化合物的油水两相体系中培养。
10.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述脱硫是指燃料油脱硫。
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