CN1699547A - 一株土生戈登氏新菌株及其脱硫作用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株土生戈登氏新菌株及其脱硫作用，该菌名称为Gordona terrae C－6，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号CGMCC NO.1361。该菌株是从高硫油井周围被油水污染的土壤中分离得到的，可作为催化剂脱除苯并噻吩类含硫有机化合物中的硫原子，尤其适用于化石燃料，如煤炭，石油及其产品中苯并噻吩类有机杂环硫的脱除，解决了传统脱硫菌株如红球菌不能脱除苯并噻吩类有机含硫化合物中有机硫的缺点，同时具备与红球菌相同的为工业应用菌株的优良特性，是燃料油深度脱硫的有益补充，使得混合发酵脱硫成为可能，菌株具有广阔的工业应用潜力。

Description

一株土生戈登氏新菌株及其脱硫作用

技术领域

本发明属于放线菌脱硫领域，涉及一种土生戈登氏菌(Gordona terrae)新菌株C-6，以及用该菌株作为催化剂脱除苯并噻吩(Benzothiophene，简称BT)类有机硫化合物中的硫元素，达到辅助燃料油深度脱硫的应用。

背景技术

21世纪是环保世纪，作为化学工业主力军的能源工业在环保和工艺方面都面临许多挑战和机遇，并由此诞生了生物化工和环保领域交叉的一门新兴学科。随着全球工业化进程的迅猛发展，对能源的需求量剧增，而当今世界的主要能源仍来自于石油燃料。石油中的硫主要以硫醇、硫醚、噻吩、苯并噻吩(BT)、二苯并噻吩(Dibenzothiophene，DBT)及它们的烷基取代物和衍生物等有机硫化物的形式存在，这些化合物在燃烧时产生大量的硫氧化物，带来多种危害。其中最为严重的是燃烧所产生的SO₂和SO₃极易与大气中的水蒸气化合形成酸雨，造成严重污染，破坏生态平衡，危害人体健康(Monticello D J.Microbial desulfurization of fossilfuels.Ann Rev Microbiol.1985，39：371～389)。目前，我国燃料油尤其是车用柴油质量严重滞后于汽车工业发展的需要和环保的要求，汽、柴油深度脱硫已成为世界强化环境法规的一大趋势。美国环保局(EPA)已提出将柴油含硫量由现在300mg/L减少到2006年15mg/L的提案，并将在2008年达到无硫的水平。欧盟已经要求到2005年汽油和柴油含硫量都达到最大50mg/L。随着我国工业技术的迅猛发展和人们环保意识的日益增强，我国出台了一系列政策法规限制燃料油中的硫含量，并规定从2006年开始在北京率先实行欧洲3号标准，即含硫量不大于50mg/L。与旧标准中800mg/L的含硫量限值相比，新标准更加严格，但与其他国家相比仍有很大差距。燃料油中的硫处理技术将是今后几十年石油加工工业所面临的迫切问题，这对各国传统的脱硫工业都将是一场严峻的挑战。

燃料油的脱硫方法主要有加氢脱硫和非加氢脱硫，其中非加氢脱硫方法包括选择性氧化/萃取法，吸附脱硫法，生物脱硫法等。近年来，随着生物技术的发展，采用生物技术脱硫越来越为人们所关注。生物催化脱硫(BDS)是利用微生物特有的酶以生化裂解的方式将化石燃料中的硫除去，是在常温常压和不需要氢气的条件下进行，能专一性切断碳硫键而使化石燃料中的硫以硫酸盐的形式释放出来，其设备投资比HDS低50％，操作费用低15％，因此应用前景十分广阔(MacFarland B L.Biodesulfurization.Curr Opin Microbiol，1999，2：257～264)。利用微生物进行石油馏份的脱硫始于20世纪30年代，50年代美国率先发表了第一个关于生物脱硫的专利。1992年，美国休斯顿能源生物公司买断美国天然气研究所专利“带硫杂环分子的连续生物催化脱硫方法”，投资5500万美元用于应用研究。随后分子生物学的发展使生物脱硫技术有了长足的进展。1993年，美国能源生物系统公司申请了“编码脱硫生物催化剂的重组DNA”的专利(J.拉姆伯塞克，C.S.比丁顿，B.R.科瓦斯维奇.编码脱硫微生物催化剂的重组DNA，中国专利93116500.8)；此后又发表柴油脱硫新工艺，解决了反应器设计，脱硫后油、水和催化剂的分离等问题。此后，日本、韩国、法国、德国、比利时、英格兰、墨西哥、伊朗等国家都开展了此项研究，重点在于开发新菌种、构建工程菌株、优化脱硫工艺，并在脱硫机理研究方面取得了一定的进展。

我国的生物脱硫技术虽刚刚起步，但是目前许多炼厂都设有加氢脱硫装置，利用原有装置组成加氢法——生物法联合脱硫装置是生产低硫燃料的可行途径。然而生物脱硫工业化还存在一些问题，制约脱硫技术的瓶颈主要体现在：1、化石燃料中的硫化物种类多，结构复杂，生物催化剂分解代谢某些特殊含硫有机物的效果很好，但对其他一些硫化物却没有效果，所以继续探索有效的适应于不同底物的生物催化剂和人为改造以拓宽菌种摄取含硫底物范围是我们研究的方向之一，也可将适应于不同底物的脱硫菌种混合培养，同时对燃料中的各种硫化物进行脱硫；2、生物脱硫反应的速率和生物催化剂在运行过程中的稳定性问题，可以通过基因工程提高细菌或酶的浓度来提高反应速率，或通过反应器和反应条件的优化来提高反应速率，并保持菌种的遗传稳定性；3、微生物在培养基中生长而必须要充分接触有机相以摄取有机含硫化合物，因此存在一个油水混合发酵工艺的改进的问题。如果能在这些方面继续改善该技术，生物脱硫的应用将具有非常广阔的前景。

在国内外已发现的专一性脱硫的微生物中以红球菌(Rhodococcus sp.)居多，其中最早研究的玫瑰红球菌(Rhodococcus rhodochrous)IGTS8在美国已经进入中试阶段。因此红球菌被广泛认为是最具应用发展前景的脱硫菌株。在分类学上红球菌与戈登氏菌同属于诺卡菌型放线菌，具有相似的细胞外被结构和摄取有机物的能力。目前经工艺条件优化或基因改造后的红球菌能完全降解柴油中DBT及其烷基取代物中的有机硫，但是对诸如硫醇、苯并噻吩及其烷基取代物等其它含硫有机化合物却没有作用。因此要想进一步拓宽底物范围，首先要筛选到降解其它有机含硫化合物的菌株，进而研究其代谢机理并找到其相关的脱硫基因，为人为改造菌种以拓宽菌种摄取含硫底物范围及适应于不同底物脱硫菌种的混合培养做准备。到目前为止国内外对红球菌专一性降解DBT已经进行了很多实验研究，但是对鲜有涉及降解BT及其烷基取代物的研究报道。目前国外报道的特异性降解BT的菌株有：Gordoniarubropertinctus strain T08(T.Matsui，T.Onaka，K.Maruhashi，R.Kurane.Benzo[b]thiophenedesulfurization by Gordonia rubropertinctusstrain T08.Appl Microbiol Biotechnol，2001，57：212-215)，Sinorhizobium sp.KT55(Yasuhiro Tanaka，Toshimitsu Onaka，Toru Matsui，et al.Desulfurization of Benzothiophene by the Gram-Negative Bacterium，Sinorhizobium sp.KT55.Current Microbiology.2001，43：187-191)，Gordona sp.strain 213E(Steven C.Gilbert，JohnMorton，Sheena Buchanan，et al.Isolation of a unique benzothiophene desulphurizing bacterium，Gordona sp.strain 213E(NCIMB 40816)，and characterization of the desulphurization pathway.Microbiology.1998，144：2545-2553)和Rhodococcus sp.strain WU-K2R(Kohtaro Kirimura，Toshiki Furuya，Rika Sato，et al.Biodesulfurization of Naphthothiophene and Benzothiophenethrough Selective Cleavage of Carbon-Sulfur Bonds by Rhodococcus sp.strain WU-K2R.ApplEnviron Microbiol，2002，68(8)：3867-3872)；同时能脱除DBT和BT中有机硫的菌株有：Rhodococcus erythropolis KA2-5-1(Morio Kobayashi，Toshimitsu Onaka，Yoshitaka Ishii，et al.Desulfurization of alkylated forms of both dibenzothiophene and benzothiophene by a singlebacterial strain.FEMS Microbiology Letters.2000，187：123-126)，Paenibacillus sp.strain A11-2(Jin Konishi，Toshimitsu Onaka，Yoshitaka Ishii，Masanori Suzuki.Demonstration of thecarbon-sulfur bond targeted desulfurization benzothiophene by thermophilic Paenibacillus sp.strainA11-2 capable of desulfurizing dibenzothiophene.FEMS Microbiology Letters.2000，187：151-154)。本发明的戈登氏菌株C-6与土生戈登氏菌(Gordona terrae)的16S rDNA序列相似率最高，它作为催化剂能脱除BT类有机硫化合物中的硫元素，达到辅助燃料油深度脱硫的作用，因此具有广泛的工业应用前景和理论研究价值。

发明内容

本发明的目的在于克服红球菌不能脱除BT类含硫有机化合物中硫元素的缺陷，从自然界筛选得到一株能脱除BT类含硫有机化合物中硫元素的菌株。

本发明的第二个目的是提供该菌株的鉴定特征和16S rRNA序列。

本发明的第三个目的是提供该戈登氏菌株脱除BT类含硫有机化合物中硫元素的方法，即以生长细胞、固定化细胞和休止细胞脱硫的步骤。

本发明是应用于燃料油生物深度脱硫单独或混合发酵过程。

本发明的技术方案概述如下：

本发明所提供的土生戈登氏菌，其特征在于：该菌株为Gordona terrae C-6，2005年4月26日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)”，其保藏号为NO.1361。

该Gordona terrae C-6菌株是从高硫油井周围被油水污染的土壤中分离得到的，其具体筛选步骤如下：

从中国山东孤岛油田高硫油油井周围采集油浸土样品，取样品5g悬浮于250mL三角瓶内的无硫培养基WS(WS培养基组成：1000mL去离子水中含：2.56g的K₂HPO₄，2.08g的KH₂PO₄，1.00g的NH₄Cl，0.25g的MgCl₂，0.001g的CaCl₂，0.005g的柠檬酸三铵，5.00g的琥珀酸钠，0.1～0.3％无硫碳源，pH7.2)中，三角瓶内装10～20粒玻璃珠以打散土样混和悬液，培养基预先在121℃高压灭菌25min。置于气浴摇床中混合30min，静置后取上层液体1mL，加入富集培养基中(其成分为上述基础盐培养基中加0.01％～0.05％的BT)。在富集培养基中30℃培养2～3天后在含有BT的琼脂平板上划线分离单菌落。得到的单菌落做新一轮的培养并进行代谢途径分析，其代谢途径鉴别方法如下：将在富集培养基培养2～3天的菌液离心除菌体，取上清液并将其pH调至8.0，加少量Gibb’s试剂，呈现蓝色说明培养液中有BT降解后的羟基苯类产物存在。

菌株C-6的菌落形态、菌体显微镜、电镜照片如图1、2、3所示，菌体为革兰氏阳性菌，专性好氧，无鞭毛，不运动，无芽孢和荚膜，有明显的异染粒。菌体大小为0.8μm～1.0μm×2μm～3μm，不运动，具有典型的八字型排列。菌体培养初期为杆状，有时有分枝产生，随培养时间的延长菌体断裂，呈短杆状。

C-6菌株在4种培养基的培养特征见表1，表明C-6在不同的培养基上有不同的生长特征，无水溶性色素。插片培养表明，C-6无气生菌丝，有很不发达的基内菌丝。

                          表1菌株C-6的培养及生理特征

培养基	菌落形态	基内菌丝	气生菌丝
				葡萄糖酵母膏LBWS+BT高氏一号	橙红色，生长迅速，圆形菌落，边缘整齐，橙色，菌落圆形，湿润，略隆起粉红色，菌落圆形，蜡状质地，较粘稠，边缘整齐浅粉色，生长缓慢，菌落细小	有有不明显不明显	无无无无

           表2菌株C-6 16S rDNA与GenBank提交菌株序列相似性比较

登陆路径及菌相关菌株名称	分值(Bits)	相似性
			gi|60502321|gb|AY927227.1|  Gordonia sp.DEOB200gi|18698655|gb|AF467984.1|  Gordonia terrae strain COE-O1gi|54873345|gb|AY771333.1|  Gordonia terrae strain CC-S5-2gi|54873342|gb|AY771330.1|  Gordonia terrae strain CC-S2dgi|562306|emb|X79286.1|GT43249RR  G.terrae(DSM 43249)gi|54873341|gb|AY771329.1|  Gordonia terrae strain CC-S2agi|5031498|gb|AF154833.1|AF154833  Gordonia terraegi|22036526|gb|AF397061.1|  Gordonia terrae AB111113gi|19568803|gb|AF479377.1|  Glacial ice bacrerium SIA1K-2A1gi|1418308|emb|X87318.1|AS16SR259  Actinomycetaceaegi|15420685|gb|AF380931.1|  Gordonia namibiensis NAM-BN063Bgi|1562304|emb|X80632.1|GR16SR  Gordonia rubripertinctusgi|562300|emb|X79287.1|GB43247RR  Gbronchialis(DSM 43247)gi|3820897|emb|X92483.1|GS16SRRN  Gordona sp.gi|31871801|gb|AY277554.1|  Gordonia rubripertinctusgi|37936112|emb|AJ586615.1|  Gordonia rubripertinctus partia.gi|5689069|dbj|AB023368.1|  Gordonia rhizospheragi|1061117|emb|X81922.1|GT16RNA1  G.terraegi|3820934|emb|X92482.1|GTl6SRR  G.terraegi|1061114|emb|X81915.1|GR16RNA1  G.rubropertinctusgi|1061112|emb|X81919.1|GB16RNA1  G.bronchalisgi|14715571|dbj|AB065369.1|  Gordonia alkalivoransgi|13992476|emb|AJ312907.1|GWE312907 Gordonia westfalica	29832946292829242920291428962837279727672746273627362712262926112611258925852573254924882470	99％99％99％100％99％99％99％99％99％99％98％98％98％99％98％98％98％99％99％98％98％98％98％

经过16SrRNA序列分析比对，C-6与Gordona terrae的亲缘关系最为接近，相似率达到99％(表2)：经过生理生化指标(表3)和对有机硫化合物的摄取范围等特征鉴定，本发明中的戈登氏菌C-6的特点在于和其它已经报道的脱除BT中有机硫的戈登氏菌株Gordoniarubropertinctus T08和Gordona desulfuricans 213E均不是同一种，而且本发明的戈登氏菌C-6菌株与Gordona terrae在尿囊素水解，鼠李糖产酸，半乳糖、D-甘露糖、蔗糖、琥珀酸、缬氨酸、丝氨酸利用等生理生化指标上存在明显不同。

                     表3菌株C-6的生理生化特征

鉴定项目	Gordona sp.C-6	鉴定项目	Gordona sp.C-6
				氧化酶接触酶葡糖氧化发酵乙醇氧化发酵M.R.(甲基红)V-P测定淀粉水解硝酸盐还原产氨实验吲哚产生色氨酸脱氨酶明胶液化尿素水解七叶树素水解尿囊素水解鼠李糖产酸海藻糖产酸碳源利用：糊精D-阿拉伯糖醇D-纤维二糖半乳糖麦芽糖	-+++---+----+++++-----	内消旋肌醇D-棉子糖L-鼠李糖D-核糖2，3-丁二醇D-山梨糖醇蔗糖D-木糖L-苹果酸琥珀酸柠檬酸丙三醇L-丙氨酸亮氨酸脯氨酸L-缬氨酸L-丝氨酸降解率(％，w/v)酪氨酸(0.5)淀粉(1)吐温80(1)尿酸(0.5)G-C％	--++---++++----+----+68.3

本发明的戈登氏菌C-6在应用前以BT为唯一硫源的情况下反复传代驯化，在此期间不接触任何其它有机或无机硫源，菌株在30℃条件下好氧培养。

本发明的戈登氏菌C-6菌株，可以用新鲜培养的生长期菌株或有脱硫活性的冷冻非生长期静止细胞及其变异菌株作脱硫生化催化剂，也可用该菌株或其变异菌株的细胞中得到的有脱硫活性的一个或儿个酶作脱硫生物催化剂，还可以用吸附或包埋在载体上固定化细胞作脱硫生物催化剂。

本发明的戈登氏菌C-6菌株既可以在营养培养基上生长，也可以在含有硫源(无机硫如Na₂SO₄，或有机含硫化合物如二甲基亚砜等)的基本无机盐培养基中生长。

本发明的戈登氏菌C-6菌株的应用方法有：1、用酵母粉为唯一硫源培养，收集休止细胞，直接用BT诱导后用于化石燃料的脱硫；2、用冷冻干燥的菌体细胞进行脱硫；3、用该细胞或者细胞提取液直接进行脱硫；4、用该菌株海藻酸纳-聚乙烯醇固定化细胞进行脱硫；5、菌株进一步诱变处理后进行直接或间接脱硫。

本发明以其产物的结构类似物苯酚、邻甲酚、邻羟基苯乙酸、邻氯苯酚和邻硝基苯酚为标准品，在浓度0.05～0.30mmol/L范围内与Gibb’s试剂反应，用分光光度法测定了五条标准曲线(图4)。

图4中五种标准品分别表示如下：

+，邻硝基苯酚；○，邻氯苯酚；×，邻羟基苯乙酸；□，邻甲酚；，苯酚

结果表明，当酚羟基的邻位为弱电子基团时只是对反应速度有影响，而对反应结果影响很小。当酚羟基的邻位为强吸电子基团时对反应速度和结果都有较大影响。以邻羟基苯乙酸为标准品拟合的标准曲线，可以使以苯酚、邻甲酚和邻羟基苯乙酸为标准品测定的点都落在置信度为95％的置信区间内(图5)。

图5中各标准品的表示如下：

+，邻硝基苯酚；○，邻氯苯酚；×，邻羟基苯乙酸；□，邻甲酚；，苯酚图5可以反映苯并噻吩及其衍生物经微生物脱硫后产物的生成量。

本发明的戈登氏菌C-6菌株可有效降解苯并噻吩(BT)及其烷基衍生物，而不能降解二苯并噻吩及其烷基取代物。0.5mmol的BT在3天内BT可完全降解；产物分析表明3天内产生0.2mmol的羟基联苯类产物，产物生成率约为40％，证明只有40％的BT被菌株C-6脱硫降解，其余60％均在有氧发酵过程中挥发掉了。BT甲基衍生物5-MBT的降解情况也要好于BT，3天内底物降解率为100％，产物生成率为48％(图6)。

图6中各标准品的表示如下：

+，邻硝基苯酚；○，邻氯苯酚；×，邻羟基苯乙酸；□，邻甲酚；，苯酚

此外，该菌能在3天内完全降解62％的含0.5mmol/L BT的十六烷模拟柴油中BT的有机硫(图7)。

本发明的有益效果是该菌可作为催化剂脱除苯并噻吩类含硫有机化合物中的硫原子，尤其适用于化石燃料(如煤炭，石油及其产品)中苯并噻吩类有机杂环硫的脱除，较适合于石油生物脱硫的实际应用所述的含硫化合物为有机含硫化合物，解决了传统脱硫菌株如红球菌不能脱除苯并噻吩类有机含硫化合物中有机硫的缺点，同时具备与红球菌相同的为工业应用菌株的优良特性，是燃料油深度脱硫的有益补充，使得混合发酵脱硫成为可能。该菌制备的休止细胞再3天内完全降解水相中0.5mmol/L的BT，能降解油相中62％的BT。菌株具有广阔的工业应用潜力。

附图说明

图1：戈登氏菌C-6的电镜照片；

图2：戈登氏菌C-6的菌落照片

图3：戈登氏菌C-6的菌体照片；

图4：五种标准品Gibb’s反应的拟合曲线；

图5：邻羟基苯乙酸Gibb’s反应的拟合曲线及各标准品在95％置信区间的分布；

图6：戈登氏菌株C-6脱除BT及其烷基取代物中有机硫的结果；

图7：戈登氏菌株C-6在模拟柴油脱硫中的应用效果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明。

实施例1  本发明提供的Gordona terrae C-6菌株的筛选步骤

从中国山东孤岛油田高硫油油井周围采集油浸土样品，取样品5g悬浮于250mL三角瓶内的无硫培养基WS(WS培养基组成：1000mL去离子水中含：2.56g的K₂HPO₄，2.08g的KH₂PO₄，1.00g的NH₄Cl，0.25g的MgCl₂，0.001g的CaCl₂，0.005g的柠檬酸三铵，5.00g的琥珀酸钠，pH7.2)中，三角瓶内装10～20粒玻璃珠以打散土样混和悬液，培养基预先在121℃高压灭菌25分钟。置于气浴摇床中混合30分钟，静置后取上层液体1mL，加入富集培养基中(其成分为上述基础盐培养基中加0.1～0.3％无硫碳源和0.01％～0.05％的BT)。在富集培养基中30℃培养2～3天后在含有BT的琼脂平板上划线分离单菌落。得到的单菌落做新一轮的培养并进行代谢途径分析，其代谢途径鉴别方法如下：将在富集培养基培养2～3天的菌液离心除菌体，取上清液并将其pH调至8.0，加少量Gibb’s试剂，呈现蓝色说明培养液中有BT降解后的羟基苯类产物存在。挑选产物中有羟基苯类化合物的菌株进行优良菌株的逐步驯化，得到Gordona terrae C-6菌株，并将该菌株于2005年4月26日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC NO.1361；

菌株C-6为革兰氏阳性菌，专性好氧，无鞭毛，不运动，无芽孢和荚膜，有明显的异染粒。菌体大小为0.8～1.0μm×2～3μm，不运动，具有典型的八字型排列。菌落橙红色，湿润粘液。菌体培养初期为杆状，有时有分枝产生，随培养时间的延长菌体断裂，呈短杆状。C-6菌株在不同的培养基上有不同的生长特征，无水溶性色素。插片培养表明，C-6无气生菌丝，有很不发达的基内菌丝。

实施例2  本发明Gordona terrae C-6菌株的16S rRNA序列PCR扩增、测序和比对1、小量提取细菌总DNA

①挑LB平板上新鲜活化的单菌落于5mL LB培养基中，37℃震荡培养12小时；

②转移3mL菌液于5mL离心管中，4℃，12000转/分，离心5分钟，弃掉上清；

③将细菌沉淀物用0.5mol/L NaCl洗一次，尽量控干上清；

④将细菌沉淀物用液氮充分研磨至粉末状；

⑤将研磨后得菌体重悬于1mL 50mmol/L Tris(pH 8.0)缓冲液中，然后加入0.2mL新鲜配置的溶菌酶溶液(10mg/mL in 0.25mol/L Tris，pH8.0)和0.8mL 0.25mol/L的EDTA溶液，混匀后于37℃处理1小时，再加入200μL 10％SDS溶液，混匀后放置于55℃处理5分钟；

⑥加入等体积的氯化苄充分混匀，用大口吸头抽吸3分钟，12000转/分，离心10分钟；

⑦转移上相至一新的离心管中，重复上个步骤直到无白色变性蛋白层出现；

⑧取上清，加入3μL 10mg/mL的去DNase的RNase溶液，37℃水浴1小时；

⑨在上相中加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH 5.2)和2倍体积的冷无水乙醇，-20℃放置30分钟；

⑩4℃，12000转/分，离心10分钟，弃上清，沉淀用70％乙醇洗两次，干燥后溶于100μL的TE中，-20℃保存备用。

2、PCR扩增16S rDNA

①扩增所用引物

      上游(27F)

         5’-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’

      下游(1541R)

         5’-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3’

②PCR反应体系

反应组分            加入量    终浓度

模板(cDNA & DNA)    2μL      0.1～1ng

MgCl₂(25mmol/L)    5μL      2.5mmol/L

缓冲液(10倍)        5μL      1倍

dNTP(10mmol/L)      2μL      0.4mmol/L

上游引物(1μmol/L)  5μL      0.1μmol/L

下游引物(1μmol/L)  5μL      0.1μmol/L

Taqase(5u/μL)      0.5μL    2.5u/反应

H₂O                25.5μL

——————————————————————

总体积              50μL

③PCR反应条件

94℃预变性5分钟，94℃ 45秒，55℃ 45秒，72℃ 1.5分钟，30个循环；72℃ 9 分钟，4℃停止。

④纯化PCR产物

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，使用宝生物柱式回收试剂盒回收纯化PCR产物。

⑤PCR产物测序

直接采用Promega公司的pGEM-T easy载体试剂盒，4℃连接过夜，转化CaCl₂法制备的DH5α感受态，转化子在含X-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB平板上，进行兰白斑筛选，选择有合适大小插入片段的单克隆测序，测序工作由大连宝生物公司完成。

测序引物

    引物1(27F)：

    5’-GAG AGT TTG ATG ATC CTG GCT CAG-3’

    引物2(1541R)：

    5’-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3’

    引物3(T7)：

    5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’

    引物4(SP6)：

    5’-ATT TAG GTG ACA CTA TAG-3’

⑥16SrDNA同源性与进化距离分析

3、将菌株16SrDNA的序列与从GenBank/EMBL/DDBJ等数据库中获得的16SrRNA序列，用Clustal W version 1.8和PHYLIP package programme进行各序列间的同源性和进化距离的分析与比较。

实施例3  制备Gordona terrae C-6菌株的细胞液体培养物

挑取营养琼脂平板培养的戈登氏菌C-6单菌落在装有灭菌5mL的基本无机盐培养基WS-酵母粉的试管中，180转/分在摇床上培养36-48小时。吸取试管中的1mL菌液加入装有100mL的基本无机盐培养基WS的500mL锥形瓶中，再加入已灭菌的BT-乙醇储液(使BT浓度为0.5mmol/L)和终浓度为1％的灭菌葡萄糖储液。将该锥形瓶放在摇床中，30℃，180转/分培养48小时，制得戈登氏菌C-6细胞的液体培养液。菌浓测定利用细胞干重与细胞悬液在660nm的光密度(OD₆₆₀)之间的线性关系，通过测定培养物的OD值得出。

实施例4  制备Gordona terrae C-6菌株的固定化细胞

将2g干重实施例3制备的细胞液体培养物与20mL海藻酸钠-聚乙烯醇溶液(8g聚乙烯醇+2g海藻酸钠/100mL水)混合，振荡形成均匀的菌悬液，通过蠕动泵逐滴加入4℃，0.1mol/L，pH7.2的无菌饱和硼酸-CaCl₂溶液中，制备固定化细胞放置24小时后备用。

实施例5  制备Gordona terrae C-6菌株的休止细胞

将实施例3  制得的戈登氏菌C-6的细胞培养液接入装有100mL WS-酵母粉培养基的500mL三角瓶中，30℃培养至对数生长末期。4000转/分钟，离心8分钟收集细胞，用生理盐水洗两次，沉淀悬浮于pH 8.0的0.1mol/L磷酸钾缓冲液中制成菌悬液，使菌浓为2～5×10⁹细胞/mL。

实施例6  本发明Gordona terrae C-6菌株在脱除苯并噻吩(BT)中有机硫的应用

将BT配成50mmol/L的DBT-无水乙醇储液，在250mL锥形瓶中依次放入灭菌WS培养基50mL，DBT-无水乙醇储液0.5mL，使锥形瓶中BT的浓度为0.5mmol/L；

将实施例3制得的戈登氏菌C-6的细胞培养液1mL，或将实施例4制得的固定化细胞25g，或将实施例5制得的休止细胞培养液5mL加入上述锥形瓶中，将锥形瓶放置在摇床中，于30℃，200转/分钟培养，隔24小时取样测定BT含量。其BT降解的测定结果见图6，结果表明，菌株C-6可以较好的脱除BT中的硫，在72小时可以将0.5mmol/L的BT完全降解，生成0.2mmol/L的苯酚类产物。

实施例7  本发明在脱除模拟燃油体系中BT类有机硫化合物中的应用

因BT在水或乙醇中易挥发，故将BT溶于十六烷中制成含50mmol/L BT的模拟柴油，按20％的体积比加入到无菌的WS培养基中，其它脱硫方法和条件同实施例6。

实施例8  实施例6的反应液中BT含量的测定

发酵过程中定时取样，加入等体积的乙酸乙酯充分抽提，8000转/分，离心取有机相，用高效液相色谱法(HPLC)测定有机相中BT的浓度(见图7)，色谱条件如下：

分析仪器：Waters 600E HPLC 996PDA

色谱柱：Xterra RP18，5m，150×3.9mm

流动相：甲醇/水＝0.8/0.2

流速：1mL/分

检测波长：254nm

实施例9  实施例6的反应液中BT降解产物的定量测定

根据色谱分析，证明反应液中BT的含量，因为发酵过程中BT易挥发，所以HPLC定量测定BT剩余的量不能代替降解后生成产物的量。化学分子的结构类似物以其含有相同的官能团，具有相似的化学性质，在参与化学反应时结果也比较相似，因此在生产和实验上当没有所要的产物时可以用它们的结构类似物为标准品，经过分析比较得到比较接近的标准曲线来衡量目的产物的生成量。由于没有商品化的降解产物邻羟基苯乙烯或邻羟基苯乙醛，所以这里采用一种变通的测定方法：用10％的Na₂CO₃溶液将菌种发酵液调pH 8.0，5000转/分，离心10分钟除菌体，取上清4mL，加入Gibb’s试剂40μL，混匀，30℃反应30分钟后，测其在610nm处吸光度。如果溶液中存在酚类化合物，按照以上条件反应后，溶液将成为亮蓝色，通过0.05～0.3mM邻羟基苯乙酸制成的标准曲线得出溶液中酚类产物的量。

脱硫活力的测定：以单位时间一定量的菌体降解BT产生羟基联苯类化合物的量来比较脱硫活力。

实施例10  实施例7的反应液中模拟燃油体系中含硫化合物的定量分析

发酵过程中定时取有机相，8000转/分，离心5分钟脱水，用实施例8中的高效液相色谱法(HPLC)测定有机相中BT的浓度。

实施例11  本发明在脱除柴油中含硫有机化合物中混合菌发酵脱硫中的应用

柴油脱硫中的辅助作用和混合发酵：将脱除DBT中有机硫的红萍红球菌和本发明菌株C-6按一定比例混合培养，以实施例4、5或6的方法作用柴油或20％的柴油-无硫培养基溶液，以达到分别脱除柴油中DBT、DBT烷基取代物、BT及BT烷基取代物的效果。

实施例12  实施例7或实施例11的反应液中模拟燃油或柴油体系中总硫含量的测定

发酵过程中定时取有机相，8000转/分，离心5分钟脱水，用WK-2D型微库仑仪检测模拟柴油或柴油中的总含硫量。条件：裂解炉温度(稳定段700℃、燃烧段800℃、气化段600℃)，偏压＞180mV，放大倍数200，积分电阻2000Ω，转化率应在75％～115％之间。

SEQUENCE LISTING

<110>南开大学

<120>一株土生戈登氏新菌株及其脱硫作用

<130>20050516

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1516

<212>DNA

<213>Gordona terrae C-6

<220>

<221>rRNA

<222>(1)..(1516)

<223>

<400>1

gagagtttga tcctggctca ggacgaacgc tggcggcgtg cttaacacat gcaagtcgaa    60

cggaaaggcc cagcttgctg ggtactcgag tggcgaacgg gtgagtaaca cgtgggtgat    120

ctgccctgca ctctgggata agcctgggaa actgggtcta ataccggata tgaccaactg    180

tcgcatggtg gttggtggaa agcttttgcg gtgtgggatg ggcccgcggc ctatcagctt    240

gttggtgggg taatggccta ccaaggcgac gacgggtagc cgacctgaga gggtgatcgg    300

ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc    360

acaatgggcg caagcctgat gcagcgacgc cgcgtgaggg atgacggcct tcgggttgta    420

aacctctttc accagggacg aagcgtgagt gacggtacct ggagaagaag caccggccaa    480

ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag ggtgcgagcg ttgtccggaa ttactgggcg    540

taaagagctc gtaggcggtt tgtcgcgtcg tctgtgaaat tctgcaactc aattgtaggc    600

gtgcaggcga tacgggcaga cttgagtact acaggggaga ctggaattcc tggtgtagcg    660

gtgaaatgcg cagatatcag gaggaacacc ggtggcgaag gcgggtctct gggtagtaac    720

tgacgctgag gagcgaaagc gtgggtagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc    780

cgtaaacggt gggtactagg tgtgggttcc ttttcacggg atccgtgccg tagctaacgc    840

attaagtacc ccgcctgggg agtacggccg caaggctaaa actcaaagga attgacgggg    900

gcccgcacaa gcggcggagc atgtggatta attcgatgca acgcgaagaa ccttacctgg   960

gtttgacata caccagacgc ggctagagat agtcgttccc ttgtggttgg tgtacaggtg   1020

gtgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca   1080

acccttgtcc tgtattgcca gcgggttatg ccggggactt gcaggagact gccggggtca   1140

actcggagga aggtggggat gacgtcaagt catcatgccc cttatgtcca gggcttcaca   1200

catgctacaa tggctggtac agagggctgc gataccgtga ggtggagcga atcccttaaa   1260

gccagtctca gttcggattg gggtctgcaa ctcgacccca tgaagtcgga gtcgctagta   1320

atcgcagatc agcaacgctg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca   1380

cgtcatgaaa gtcggtaaca cccgaagccg gtggcctaac cccttgtggg agggagctgt   1440

cgaaggtggg atcggcgatt gggacgaagt cgtaacaagg tagccgtacc ggaaggtgcg   1500

gctggatcac ctcctt                                                   1516

Claims (10)

1.一株土生戈登氏苯并噻吩类脱硫菌，其特征在于，名称为Gordona terrae C-6，已保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号CGMCC NO.1361。

2.根据权利要求1所述的一株土生戈登氏苯并噻吩类脱硫菌，其特征在于，菌体为革兰氏阳性菌，专性好氧，无鞭毛，不运动，无芽孢和荚膜，有明显的异染粒，菌体大小为0.8～1.0μm×2～3μm，不运动，具有典型的八字型排列，菌体培养初期为杆状，有时有分枝产生，随培养时间的延长菌体断裂，呈短杆状。

3.根据权利要求1所述的一株土生戈登氏苯并噻吩类脱硫菌，其特征在于，所述的菌株从高硫油井附近的土壤中分离并经过驯化过程增强脱硫效果。

4.根据权利要求1所述的一株土生戈登氏苯并噻吩类脱硫菌，其特征在于，该戈登氏菌的16SrRNA序列如下：

   1 GAGAGTTTGA TCCTGGCTCA GGACGAACGC TGGCGGCGTG CTTAACACAT GCAAGTCGAA

  61 CGGAAAGGCC CAGCTTGCTG GGTACTCGAG TGGCGAACGG GTGAGTAACA CGTGGGTGAT

 121 CTGCCCTGCA CTCTGGGATA AGCCTGGGAA ACTGGGTCTA ATACCGGATA TGACCAACTG

 181 TCGCATGGTG GTTGGTGGAA AGCTTTTGCG GTGTGGGATG GGCCCGCGGC CTATCAGCTT

 241 GTTGGTGGGG TAATGGCCTA CCAAGGCGAC GACGGGTAGC CGACCTGAGA GGGTGATCGG

 301 CCACACTGGG ACTGAGACAC GGCCCAGACT CCTACGGGAG GCAGCAGTGG GGAATATTGC

 361 ACAATGGGCG CAAGCCTGAT GCAGCGACGC CGCGTGAGGG ATGACGGCCT TCGGGTTGTA

 421 AACCTCTTTC ACCAGGGACG AAGCGTGAGT GACGGTACCT GGAGAAGAAG CACCGGCCAA

 481 CTACGTGCCA GCAGCCGCGG TAATACGTAG GGTGCGAGCG TTGTCCGGAA TTACTGGGCG

 541 TAAAGAGCTC GTAGGCGGTT TGTCGCGTCG TCTGTGAAAT TCTGCAACTC AATTGTAGGC

 601 GTGCAGGCGA TACGGGCAGA CTTGAGTACT ACAGGGGAGA CTGGAATTCC TGGTGTAGCG

 661 GTGAAATGCG CAGATATCAG GAGGAACACC GGTGGCGAAG GCGGGTCTCT GGGTAGTAAC

 721 TGACGCTGAG GAGCGAAAGC GTGGGTAGCG AACAGGATTA GATACCCTGG TAGTCCACGC

 781 CGTAAACGGT GGGTACTAGG TGTGGGTTCC TTTTCACGGG ATCCGTGCCG TAGCTAACGC

 841 ATTAAGTACC CCGCCTGGGG AGTACGGCCG CAAGGCTAAA ACTCAAAGGA ATTGACGGGG

 901 GCCCGCACAA GCGGCGGAGC ATGTGGATTA ATTCGATGCA ACGCGAAGAA CCTTACCTGG

 961 GTTTGACATA CACCAGACGC GGCTAGAGAT AGTCGTTCCC TTGTGGTTGG TGTACAGGTG

1021 GTGCATGGCT GTCGTCAGCT CGTGTCGTGA GATGTTGGGT TAAGTCCCGC AACGAGCGCA

1081 ACCCTTGTCC TGTATTGCCA GCGGGTTATG CCGGGGACTT GCAGGAGACT GCCGGGGTCA

1141 ACTCGGAGGA AGGTGGGGAT GACGTCAAGT CATCATGCCC CTTATGTCCA GGGCTTCACA

1201 CATGCTACAA TGGCTGGTAC AGAGGGCTGC GATACCGTGA GGTGGAGCGA ATCCCTTAAA

1261 GCCAGTCTCA GTTCGGATTG GGGTCTGCAA CTCGACCCCA TGAAGTCGGA GTCGCTAGTA

1321 ATCGCAGATC AGCAACGCTG CGGTGAATAC GTTCCCGGGC CTTGTACACA CCGCCCGTCA

1381 CGTCATGAAA GTCGGTAACA CCCGAAGCCG GTGGCCTAAC CCCTTGTGGG AGGGAGCTGT

1441 CGAAGGTGGG ATCGGCGATT GGGACGAAGT CGTAACAAGG TAGCCGTACC GGAAGGTGCG

1501 GCTGGATCAC CTCCTT

5.一株土生戈登氏苯并噻吩类脱硫菌及其应用，其特征在于，该菌株脱除苯并噻吩类有机硫化合物生成酚类产物。

6.根据权利要求5所述的一株土生戈登氏苯并噻吩类脱硫菌及其应用，其特征在于，采用苯乙酸与Gibb’s反应测定产物的量。

7.根据权利要求5所述的一株土生戈登氏苯并噻吩类脱硫菌及其应用，其特征在于，脱硫采用生长细胞脱硫，其特征在于生长细胞脱硫过程为：菌种培养→加入待处理油品→常温处理→分离油相。

8.根据权利要求5所述的一株土生戈登氏苯并噻吩类脱硫菌及其应用，其特征在于，利用休止细胞进行脱硫，具体过程为：采用酵母粉为硫源进行菌种培养→收集细胞→悬浮于磷酸盐缓冲液中→加入待处理油品→常温处理→分离油相。

9.根据权利要求5所述的一株土生戈登氏苯并噻吩类脱硫菌及其应用，其特征在于，利用固定化细胞进行脱硫，具体过程为：采用海藻酸纳-聚乙烯醇为载体包埋制备固定化细胞→悬浮于磷酸盐缓冲液中→加入待处理油品→常温处理→分离油相→活化再生细胞→循环脱硫。

10.根据权利要求5所述的一株土生戈登氏苯并噻吩类脱硫菌及其应用，其特征在于，利用作用于不同含硫化合物底物的菌株配比进行混和菌发酵，以进一步降低燃料油或原油馏分脱硫中的含硫量。

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