CN1132934C - 德氏假单胞菌菌株及其在脱除含硫有机化合物中硫的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及的德氏假单胞菌菌株，为Pseudomonas delafildii R-8，于2001年4月29日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC NO.0570；是从含油污水处理池中的耗氧活性污泥、油井周围被油污染的土壤以及含硫量较高的煤矿矿坑周围土样中分离得到；该菌株的细胞液体培养、固定化细胞、非生长期静止细胞液和粗酶萃取液均可通过氧化断裂C-S键途径脱除含硫有机化合物中的硫。
Description
本发明涉及德氏假单胞菌菌株及其在脱除含硫有机化合物中硫的应用。
石油和煤炭是世界上最重要的能源，这些矿物燃料中含有硫化物，燃烧时会产生大量硫氧化物排放到大气环境中，形成酸雨，严重污染环境，破坏生态平衡，直接威胁着地球人类的生存空间。据有关报道，全世界每年排入大气中的SO2近两亿吨，在中国SO2的排放量达到了1795万吨。同时硫化物的存在还会影响燃料及其产品的外观，腐蚀燃烧及运输设备。为了避免有毒硫化物存在造成的危害，在燃料燃烧前，燃烧过程中或燃烧后必须把燃料中的硫脱除，这已成为全世界极待解决的重大课题。面对日益严峻的环保形势，人们的环保意识不断增强，对于环保的要求变得越来越严格。因此，发达国家越来越重视燃油质量的提高，美国1990年就通过了清洁空气法修正案，环保局提出了使用新配方汽油的要求。从1998年起，美国环保局采用复杂模型，进一步降低汽车排放污染，欧洲议会1998年曾立法要求2000年实施清洁汽油配方。总之，今后10年内，运输燃料(特别是汽油和柴油)的组成和质量指标将会有较大的改观，即要求燃料的H/C比有所上升，而硫及芳烃含量要大大降低。北美和欧洲国家要求到2005年汽油、柴油中硫含量要低于50ppm，2010年汽油、柴油中硫含量要低于30ppm，甚至10ppm。我国是一个发展中国家，石油生产和燃料消耗已成为世界大国之一，SO2的排放量远远超过世界平均水平。面对日益严峻的环保形势，我国实施了可持续发展战略，大力推行清洁生产，并颁布了一系列环保法规。初步提出将目前柴油硫含量从5000ppm降低到2000ppm以下，部分大城市车用柴油中硫含量低于500ppm的要求，因此，开发和加强高效、低成本的燃料燃前脱硫技术，将对我国实施的环境保护和可持续发展战略产生积极而深远的影响。
降低石油、石油产品和煤炭中含硫量的方法有物理、化学和生物法。物理和化学法的燃前脱硫技术能有效地脱除燃料中的无机硫，但是脱除有机硫的效果很差，因为矿物燃料中含有的有机硫化物成分复杂，大部分是杂环化合物，其中的C-S化学共价键十分牢固，用常规的物理和化学方法无法有效去除。
目前常用的加氢催化脱除燃料中有机硫(HDB)技术必须在高温(≥300℃)，高压(≥100atm)，加氢及金属催化剂存在的苛刻条件下脱硫，操作费用较高，而且金属催化剂易受底物硫原子周围取代基空间位阻影响，所以对于燃料中大量存在的甲基取代苯并噻吩、二苯并噻吩等结构复杂的杂环硫化物的脱除率较低。(e.g.Houalla，M.，Broderick，D.H.，Sapre，A.V.，Nag，N.K.，de Beer，V.H.J.，Gates，B.C.，Kwart，H.J.Catalt.，61，523-527(1980))。事实上，在轻汽油和柴油中，仍存在着多种二苯并噻吩的烃基取代物(e.g.Kabe，T.，Ishihara，A.and Tajima，H.Ind.Eng.Chem.Res.，31，1577-1580(1992))。低硫含量的要求使得HDS过程反应条件越来越苛刻，设备和操作费用增高，同时伴随着烯烃饱和反应，造成燃料燃烧值损失。因此，迫切需要寻找一种能从石油或石油产品中脱除硫却不造成石油燃烧值降低的，经济可行的新工艺。
生物催化脱硫(BDS)方法，以其具有的选择性高，副反应少，反应条件温和，设备简单，运行费用低，投资少，对燃料热值影响小，不造成二次污染等优点，逐渐成为令人瞩目的清洁石油燃料生产技术，有希望成为传统脱氢过程的辅助途径来进行含硫燃料的精加工，使它们达到要求水平，所以引起了众多科学家和工程师的兴趣。
目前，已分离了多种能脱有机硫的微生物。其中好氧菌或厌氧菌都能代谢柴油中的主要难处理化合物DBT，如硫酸盐还原细菌，Desulfovibrio(去磺弧菌属)desulfuricans M6，厌氧地降解DBT，主要的产物是联苯，降解率是42％。据报道，其它的硫酸盐还原细菌也能厌氧地将DBT转化为联苯，但转化率极低。厌氧过程因为有不需要氧的加入，可以直接应用到油井中的优点具有较大的吸引力，但是还未发现能用于实际石油脱硫体系的高效厌氧微生物。
通过好氧途径代谢DBT的微生物有假单孢菌(pseudomonas sp.)、红球菌(Rhodococcus sp.)、棒杆菌(Corynebacterium sp.)及短杆菌(Brevibacterium sp.)等。通过对各种微生物代谢机制的研究，得知微生物的脱硫途径主要有三种：一种是专一氧化DBT的碳架(C-C键)，而C-S键依然保留，这一途径是在从土壤中分离出的假单胞菌(Pseudomonas)，拜叶林克氏菌(Beijerinckia)及不动杆菌(Acinetobacter)和根瘤菌(Rhizobium)的混合培养中发现的，代谢过程中DBT的一个苯环在断裂前先变成为羟基化合物，硫原子未被释放，顺式4-[2-(3-羟基)-噻吩基]-2-氧-3-丁烯酸(tran-HTOB)和3-羟基-2-甲酰基苯噻吩(HFBT)在培养基中积累，其它的细菌如P.eruginosa ERC-8，Beijerinckia sp.，Pseudomonas、Rhizobium melioti和Pseudomonas sp.C18等也有这样的代谢途径。中国科学院微生物研究所的钟慧芳研究小组也曾分离到将DBT分解为水溶性有机硫化物的菌株，可脱除煤中有机硫22.2％～32.0％，(钟慧芳等 微生物学报35(2)：130-135，1995)。这种类型的代谢，会由于含碳结构被脱除，而造成燃料能量的损失。
另一种途径以DBT为唯一碳源、硫源、能源，直接氧化DBT的C-S键生成苯甲酸盐，已经报道的菌种有短杆菌(Brevibacterium)和节杆菌(Arthobacter)，它们将DBT-亚砜，DBT-砜脱硫最终生成苯甲酸脂和硫酸盐，短杆菌(Brevibacterium)可以脱去粗油中DBT的硫而不攻击非硫碳氢化合物。这一代谢途径中，不只脱除了杂环化合物中的硫，也破坏了烃的碳骨架，同样引起了燃料热值的损失。
第三条途径中，微生物专一氧化断裂DBT的C-S键，而不打开C-C键，以特有的酶系统将硫从杂环中专一性地脱下来，不引起燃料热值的损失。Atlantic ResearchCorporation最早报道微生物可从DBT中脱去硫而不改变烃的结构。1989年Kilbane等分离出了红色红球菌(Rhodococcus erythropolis)IGTS8(以前称为R.rhodochrous)，该菌得到了最广泛的研究，特别是近年来，通过基因工程方法将该类微生物的脱硫基因(dsz)进行了克隆、表达、测序，并成功地改造和构建了重组菌，提高了脱硫效率，使其具有更加广阔的工业应用前景(Denome S.A.et al.J Bacteriol.176(21)：6707-6716，1994)，而且提出了DBT的脱硫途径：该途径经过DBT5-亚砜(DBTO)，DBT5-砜(DBTO2)和2-羟基联苯基-2-亚磺酸盐(HBPS)，最终将DBT代谢为2-羟基联苯(2-HBP)，因此这一途径也称“4S”途径。专一脱硫的“4S”途径是目前比较理想，引起大家广泛关注的研究领域。继R.erythropolis IGTS8之后，又报道了其它几种细菌有相似的代谢途径，如棒杆菌属细菌(Corynebacterium)SY1，R.erythropolis D-1，球形诺卡氏菌(Nocardia globelula)，土壤杆菌属(Agrobacter)MC501，分枝杆菌属(Mycobaterium)G3，黄单孢菌属(Xanthomonas)，所有这些细菌都是革兰氏阳性菌。
假单胞菌(Pseudomonas)CB1是Isbister等人从土壤和煤矿样品中分离出来的，能在以苯甲酸盐为唯一碳源和能源及高DBT存在的培养基中生长。用35S-DBT和14C-DBT作CB1专攻DBT杂环硫示踪实验，测出生成35S硫酸盐、2-2’-二羟基联苯及14CO2。但相当遗憾的是他们后来声称CB1菌株不稳定并且丢失了(e.g.Isbister J.D1993)，所以不能进一步证实该假单胞菌确切的代谢途径。
本发明的目的在于克服上述脱除化石燃料中有机硫技术存在的缺陷，而提供从自然界中分离出的具有专一性催化断裂硫的有机化合物中C-S键能力的德氏假单胞菌菌株及其在脱除含硫有机化合物中硫的应用。
本发明的技术方案如下：
本发明提供的德氏假单胞菌菌株，其特征在于：该菌株为PseudomonasdelafildiiR-8，于2001年4月29日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC NO.0570；
该Pseudomonas delafildii R-8菌株是从含油污水处理池中的耗氧活性污泥、油井周围被油污染的土壤以及含硫量较高的煤矿矿坑周围土样中分离得到的；
其具体筛选步骤如下：
从中国大港石油化工公司炼油厂污水处理池中采集好氧活性污泥样品，取样品5克悬浮于无硫基础培养基(培养基组成：1000ml水中含：2.44g的KH2PO4，14.03g的Na2HPO4·12H2O，2.00g的NH4Cl，0.36g的MgCl2·6H2O，1g的CaCl2·2H2O，1mg的FeCl3，4mg的MnCl2·4H2O，0.755mg的CuCl2，0.8ml的丙三醇或1-3g葡萄糖)中，在121℃下，高压灭菌20分钟，置摇床中混合30分钟后，静置，吸取上层悬浮液转接到营养培养基(营养培养基组成g/g：NaCl 1.0％；酵母浸膏粉0.5％，胰膏蛋白冻1％)中，高压灭菌20分钟，置摇床中以150转/分培养24小时；吸取5ml菌液加入100ml灭菌基础培养基中，再在其中加入二苯并噻吩(DBT)-乙醇溶液使培养液中DBT浓度为0.1mM。在摇床中以150转/分培养2-3天后，在喷有DBT的琼脂培养基上划线分离；分离得到的单菌落分别接种于含DBT浓度为0.2mM的基础培养基中，在摇床中以150转/分30℃作用2-3天；经生物作用后的样品用1N盐酸调节pH为1.0，在5000转/分下离心20分钟，上清液用等体积的乙酸乙酯振荡萃取；萃取有机相回流浓缩至1ml，进行GC-MS分析；挑选产物中有二苯并噻吩砜DBTO2及羟基联苯HBP的菌株进行优良菌株的逐步驯化，得到Pseudomonas delafildii R-8菌株；
该Pseudomonas delafildii R-8菌株适宜在中性及极弱酸性培养介质中常温培养，其细菌学形态特征：为革兰氏阴性直杆菌，长度为0.6-0.8×1.4-1.6mm.，不产生芽孢，不形成孢子链或螺旋型，能运动、不产生鞘和突起物，专性好氧，抗酸染色阴性，细胞壁不含二氨基庚二酸，无特征性糖，菌落淡黄色，单极生鞭毛，没有反硝化作用，能以聚-β-羟基丁酸盐为唯一碳源生长。
该Pseudomonas delafildii R-8菌株培养特征：
在LB琼脂、营养琼脂、桑塔斯琼脂、牛肉浸汁琼脂、无机盐琼脂五种培养基上30℃培养3-5天后，不产生类胡萝卜素和荧光，其它特征见表1；
表1
| 培养基 | 菌落呈色 | 菌落边缘形状 | 菌落表面形状 |
| LB琼脂 | 杏仁黄色 | 光滑 | 略显粗糙 |
| 营养琼脂 | 乳黄色 | 裂片状 | 光滑 |
| 桑塔斯琼脂 | 微黄色 | 裂片状 | 光滑 |
| 牛肉浸汁琼脂 | 杏仁黄色 | 裂片状 | 光滑 |
| 无机盐琼脂 | 无色透明 | 裂片状 | 粗糙 |
依照Hasegawa T.等快速薄层层析法进行全细胞水解液分析的结果表明：该Pseudomonas delafildii R-8菌株细胞壁化学组份为：菌株Pseudomonasdelafildii R-8不含有meso-DAP(二氨基庚二酸Diaminopimelicacicl acid)，含甘氨酸，无特征性糖(糖型C)。；
该Pseudomonas delafildii R-8菌株生理生化特征，见表2：
表2
| 实验名称 | 结果 | 利用糖产酸 | 结果 |
| 明胶液化 | - | D-核糖 | + |
| 淀粉水解 | - | D-木糖 | + |
| 吲哚反应 | - | L-阿拉伯糖 | + |
| 硝酸盐还原 | - | 甘露糖 | + |
| 接触酶反应 | + | 半乳醇 | - |
| 纤维素上生长 | - | 肌醇 | - |
| 赖氨酸 | - | L-鼠李糖 | - |
| 聚-β-羟基丁酸盐 | + | 甘露醇 | - |
| L-丝氨酸 | + | 甘油 | |
| 丙二酸盐 | + | 山梨醇 | + |
| 乙醇 | - | 密二糖 | - |
| 苯甲酸盐 | - | ||
| 2，3-丁二醇 | - | ||
| 厌氧生长 | - |
参照《Bergy’s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol.VIII的内容，根据形态特征与细胞壁化学组份定属的原则，证明菌株Pseudomonas delafildii R-8为革兰氏阴性直杆菌，其长度为0.6-0.8×1.4-1.6mm，不产生芽孢，不形成孢子链或螺旋型；能运动，不产生鞘和突起物；专性好氧，抗酸染色阴性；细胞壁不含有DAP(二氨基庚二酸)；无特征性糖；属于假单孢菌属(Pseudomonas)，其菌落淡黄色、单极生鞭毛、没有反硝化作用、能以聚-β-羟基丁酸盐为唯一碳源生长，结合其他各项生理生化特征，均与德氏假单胞菌相似。故该R-8菌株定名为德氏假单胞菌(Pseudomonas delafildii)。与Pseudomonas sp.CB1(ATCC#39381)不同，菌株R-8不产生色素。
本发明的Pseudomonas delafildii R-8菌株既可以在营养培养基中培养，也可在含硫源(MgSO4，二甲基亚砜，DBT或其他有机硫化合物)的基础培养基中培养。应用前需在有机硫源存在的条件下驯化，菌株在25-35℃之间的一适当温度下，进行中性好氧培养。
该Pseudomonas delafildii R-8菌株脱硫能力强，脱硫底物范围广。
本发明的Pseudomonas delafildii R-8菌株，可以用新鲜培养的生长期菌种或有脱硫活性的冷冻非生长期静止细胞及其变异菌株作脱硫生物催化剂，也可用该菌株或其变异菌株的细胞中得到的有脱硫活性的一个或几个酶作脱硫生物催化剂，还可用吸附或包埋在载体上的固定化细胞作脱硫生物催化剂。
本发明提供的Pseudomonas delafildii R-8菌株可作为催化剂选择性断裂含硫有机化合物中C-S键，脱除硫原子，尤其适用于化石燃料(如煤炭，石油及其产品)中有机杂环硫的脱除；解决了已有石油加氢工艺处理成本高、不易于脱除杂环化合物中硫等缺点；该菌株通过专一性‘4S’途径脱除燃料中有机化合物中的杂环硫，而不破坏有机化合物的C-C骨架，不降低燃料的燃烧热值。目前的专利及文献报道中，Pseudomonas sp.多采用C-C键断裂途径降解燃料中含硫化合物，而本发明的Pseudomonas delafildii R-8菌株能通过C-S键断裂途径专一性脱硫，该菌广泛存在于原油中，具有许多作为工业应用菌株的优良特性，耐有机溶剂的能力强，生长细胞脱硫过程中未检测到无机硫的存在，产生的硫被认为结合或融合于生长细胞的细胞内，因此不会发生因硫酸根离子累积而抑制菌种脱硫活性的现象，菌株具有广阔的工业应用潜力。
下面结合附图及实施例进一步描述本发明。
附图1为多通道轻重相反应器的结构图；
附图2为十六烷、乙醇及二甲基酰胺中二苯并噻吩生物降解速率图；
附图3反应器中十六烷模拟体系二苯并噻吩生物降解速率图；
附图4-1为加氢脱硫柴油中硫含量的GC-AED检测谱图；
附图4-2为加氢脱硫柴油经本发明生物脱硫后硫含量的GC-AED检测谱图；
其中：反应器上端盖1 进气孔2 进样孔3
电加热管4 反应器外筒5 轻相取样孔6
进气管7 重相取样孔8 垫圈9
螺杆10 螺母11 法兰12
测温孔13 温度计14 圆形环15
轻相分布管16 -+-细胞光密度(OD600) -×-DBT浓度
-●-分散剂为二甲基酰胺 -▲-分散剂为乙醇
-■-分散剂为十六烷
实施例1：本发明提供的Pseudomonas delafildii R8菌株的筛选步骤如下：
从中国大港石油化工公司炼油厂污水处理池中采集好氧活性污泥样品，取样品5克悬浮于无硫基础培养基(培养基组成：1000ml水中含：2.44g的KH2PO4，14.03g的Na2HPO4·12H2O，2.00g的NH4Cl，0.36g的MgCl2·6H2O，1g的CaCl2·2H2O，1mg的FeCl3，4mg的MnCl2·4H2O，0.755mg的CuCl2，0.8ml的丙三醇或1-3g葡萄糖)中，在121℃下，高压灭菌20分钟，置摇床中混合30分钟后，静置，吸取上层悬浮液转接到营养培养基(营养培养基组成g/g：NaCl 1.0％；酵母浸膏粉0.5％，胰膏蛋白冻1％)中，高压灭菌20分钟，置摇床中以150转/分培养24小时；吸取5ml菌液加入100ml灭菌基础培养基中，再在其中加入二苯并噻吩(DBT)-乙醇溶液使培养液中DBT浓度为0.1mM。在摇床中以150转/分培养2-3天后，在喷有DBT的琼脂培养基上划线分离；分离得到的单菌落分别接种于含DBT浓度为0.2mM的基础培养基中，在摇床中以150转/分30℃作用2-3天；经生物作用后的样品用1N盐酸调节pH为1.0，在5000转/分下离心20分钟，上清液用等体积的乙酸乙酯振荡萃取；萃取有机相回流浓缩至1ml，进行GC-MS分析；挑选产物中有二苯并噻吩砜DBTO2及羟基联苯HBP的菌株进行优良菌株的逐步驯化，得到Pseudomonas delafildii R-8菌株；并将该菌株于2001年4月29日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC NO.0570；
该Pseudomonas delafildii R-8菌株适宜在中性及极弱酸性培养介质中常温培养，其细菌学形态特征：为革兰氏阴性直杆菌，长度为0.6-0.8×1.4-1.6mm.，不产生芽孢，不形成孢子链或螺旋型，能运动、不产生鞘和突起物，专性好氧，抗酸染色阴性，细胞壁不含二氨基庚二酸，无特征性糖，菌落淡黄色，单极生鞭毛，没有反硝化作用，能以聚-β-羟基丁酸盐为唯一碳源生长。
实施例2：制备Pseudomonas delafildii R-8菌株的细胞液体培养物：
挑取营养琼脂斜面培养的德氏假单胞菌菌株Pseudomonas delafildii R-8菌株一铂环接种在装有灭菌的试管中，加入已灭菌的DBT-乙醇溶液，使DBT浓度为0.1mmol，于30℃，150转/分下在生物培养箱中培养16-24小时；吸取培养获得的菌液1ml接种在装有100ml基础无机盐培养基(pH＝7.0)的300ml锥形瓶中，再加入已灭菌的DBT-乙醇溶液，使DBT浓度为0.1-0.5mmol；将该锥形瓶放置在生物培养箱中于30℃，150转/分培养48小时，即制得Pseudomonas delafildii R-8菌株的细胞液体培养物。
实施例3：制备Pseudomonas delafildii R-8菌株的非生长期静止细胞液：
将实施例2的Pseudomonas delafildii R-8菌株的细胞液体培养物离心(8000转/分)10分钟，倒去上层悬浮液；用适量生理盐水洗涤离心沉淀3次，将所得离心沉淀物悬浮于生理盐水中，然后冷冻保藏在冰箱中，即制得Pseudomonasdelafildii R-8菌株的非生长期静止细胞液。
实施例4：制备Pseudomonas delafildii R-8菌株的粗酶萃取液：
将实施例3的Pseudomonas delafildii R-8菌株的非生长期静止细胞液冷冻干燥，冷冻干燥后的细胞先在匀浆器中研磨，然后在20Hz下超声破碎，加入适量生理盐水后以8000转/分离心30分钟，弃去离心沉淀的固体残渣，其上层粗酶离心萃取液即为制得的Pseudomonas delafildii R-8菌株的粗酶离心萃取液。
实施例5：制备Pseudomonas delaildii R-8菌株的固定化细胞：
物理吸附的方法制备固定化细胞：将清洗、干燥、灭菌后的硅藻土加入灭菌培养介质，接种新鲜培养的Pseudomonas delafildii R-8菌株，常温培养，菌种生长过程中附着在载体之上，而形成Pseudomonas delafildii R-8菌株的固定化细胞；
凝胶包埋的方法制备固定化细胞：
(1)聚丙烯酰胺凝胶包埋：取3ml新鲜培养的Pseudomonas delafildii R-8菌株细胞悬液，加入12ml生理盐水，再加入聚丙烯酰胺2.25g，N，N’-甲叉双丙烯酰胺0.12g，5％浓度的二甲氨基丙晴1.5ml和2.5％浓度的过硫酸1.5ml，完成聚合后，得到15％浓度的聚丙烯酰胺凝胶，切成小块，用蒸馏水和生理盐水各洗涤两次，抽干，即制得Pseudomonas delafildii R-8菌株的固定化细胞。
(2)海藻酸包埋：取3ml新鲜培养的Pseudomonas delafildii R-8菌株的细胞悬液，加入20ml制备好的2％浓度的海藻酸钠溶液，混合物搅匀；用粗针头挤入到2％的反离子溶液(钙盐或铝盐)中，放置冰箱10小时，用蒸馏水和生理盐水各洗涤两次，形成包有Pseudomonas delafildii R-8菌株固定化细胞的均匀、球形、有高度微孔结构的凝胶。
实施例6：本发明在脱除二苯并噻吩(DBT)中有机硫的应用：
(1)将已灭菌的DBT配成100mmol/L的DBT-二甲基酰胺(也可以是乙醇)储液；
(2)在100ml锥形瓶中依次加入灭菌培养基30ml、DBT-二甲基酰胺储液0.06ml，使锥形瓶中DBT的浓度为0.2mmol/L；
(3)将实施例2制得的Pseudomonas delafildii R-8菌株的细胞液体培养物，或实施例3制得的Pseudomonas delafildii R-8菌株的非生长期静止细胞液，或实施例4制得的Pseudomonas delafildii R-8菌株的粗酶萃取液(粗酶萃取液中含有NADH)3ml加入上述步骤(2)锥形瓶中，将锥形瓶放置在生物培养箱中，于30℃，150转/分培养，每隔12小时取样测定，生长细胞悬浮液对DBT降解的测定结果见图2，其结果表明，在不同的DBT分散剂存在的情况下，菌株R-8都可以较好地脱除DBT中的硫，十六烷作为分散剂时，脱硫速率最快，为0.0037mM/h·g细胞干重，二甲基酰胺与乙醇作为分散剂时，脱硫效果相近。这是因为十六烷的存在会在DBT表面形成一层膜，有利于与微生物作用。
实施例7：本发明在脱除模拟燃油体系中DBT硫的应用：其步骤如下：
(1)将要处理的液体油品(十二烷或十六烷加二苯并噻吩，DBT浓度为0.22mM)过滤灭菌，通灭菌空气(或氧气)使油品氧张力增加；
(2)将30ml含氧液体油品从如图1所示的反应器进样孔3引入多通道轻重相反应器，同时加入270ml灭菌水相(无机盐培养基)和30ml脱硫生物催化剂；生物催化剂可以是该Pseudomonas delafildii R-8菌株的生长期细菌液，也可以是该Pseudomonas delafildii R-8菌株的非生长期细胞液或从细胞中萃取得到的粗酶萃取液；反应器内径为75mm，高120mm，体积529.9ml，有效容积300ml；多通道轻相分布器高30mm，上端圆形环16外径73mm，内径58mm，圆形环上凹槽14外径70mm，内径61mm，多通道轻相分布管17管径为30mm；
(3)将进样孔3密封，反应器置于摇床培养箱中，空气经过滤灭菌后由上部通气管2引入，摇床温度控制为30℃，调节摇床转速使多通道轻重相反应器的上层轻油相高于圆形环16，溢于凹槽14中，通过轻重相分布管17到达反应器底部，呈油珠冒出，由于比重小，又会由反应器底部浮至反应器上方，从而完成轻油相与重相中微生物发生反应的过程：
(4)液体油品经本发明的生物脱硫作用后，从反应器外管上部轻相取样孔6吸取脱硫后的液体油品，从下部重相取样孔8放出剩余的生物催化剂及培养液。
(5)反应后剩余的含有生物催化剂的液体产物经离心分离、洗涤，在适宜的条件下再生。反应器中十六烷模拟体系二苯并噻吩生物降解速率如图3所示，由图可知，在反应器中，菌株可以更快地脱除DBT中的硫，其脱硫速率为0.0055mM/h·g细胞干重，约为锥形瓶中脱硫速率的1.5倍。
实施例8：本发明在脱除加氢脱硫柴油中的硫的应用：
将实施例7中的模拟油系换为过滤灭菌的加氢脱硫后的柴油，其他操作步骤和方法同实施例7，经本发明的脱硫前后柴油中硫含量的GC-AED检测谱图见图4-1和图4-2，由图中结果可以看出，经本发明生物脱硫后加氢脱硫柴油中的硫含量从111ppm降到63ppm脱硫率为43％。
Claims (7)
1.一株德氏假单胞菌菌株，其特征在于：该菌株为Pseudomonas delafildiiR-8，于2001年4月29日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC NO.0570。
2.按权利要求1所述的德氏假单胞菌菌株，其特征在于：从含油污水处理池中的耗氧活性污泥、油井周围被油污染的土壤以及含硫量较高的煤矿矿坑周围土样中分离得到；该菌株适宜在中性及极弱酸性培养介质中常温培养；其细菌学形态特征：为革兰氏阴性直杆菌，长度为0.6-0.8×1.4-1.6mm，不产生芽孢，不形成孢子链或螺旋型，能运动、不产生鞘和突起物，专性好氧，抗酸染色阴性，细胞壁不含二氨基庚二酸，无特征性糖，菌落淡黄色，单极生鞭毛，没有反硝化作用，能以聚-β-羟基丁酸盐为唯一碳源生长。
3.权利要求1所述的德氏假单胞菌菌株在脱除化石燃料中有机硫的应用，其特征在于：该Pseudomonas delafildii R-8菌株通过氧化断裂C-S键途径脱除含硫有机化合物中的硫。
4.按权利要求3所述的德氏假单胞菌菌株的脱除化石燃料中有机硫的应用，其特征在于：该Pseudomonas delafildii R-8菌株的非生长期静止细胞液通过氧化断裂C-S键途径脱除含硫有机化合物中的硫。
5.按权利要求3所述的德氏假单胞菌菌株的脱除化石燃料中有机硫的应用，其特征在于：该Pseudomonas delafildii R-8菌株的固定化细胞通过氧化断裂C-S键途径脱除含硫有机化合物中的硫。
6.按权利要求3所述的德氏假单胞菌菌株的脱除化石燃料中有机硫的应用，其特征在于：该Pseudomonas delafildii R-8菌株的细胞液体培养物通过氧化断裂C-S键途径脱除含硫有机化合物中的硫。
7.按权利要求3所述的德氏假单胞菌菌株的脱除化石燃料中有机硫的应用，其特征在于：该Pseudomonas delafildii R-8菌株的粗酶萃取液通过氧化断裂C-S键途径脱除含硫有机化合物中的硫，Pseudomonas delafildii R-8菌株的粗酶萃取液中含有NADH。
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