CN1252248C - 一种枯草芽孢杆菌及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Fds-1，2001年10月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.0644。本发明菌株从高硫油井附近的土壤中分离并经过紫外线诱变筛选得到的。该菌株的生长细胞或休止细胞均可以通过氧化断裂C-S键脱除有机化合物中的有机硫，特别适合于脱除石油馏分油中的有机硫，脱硫率高。
Description
技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌及其在石油馏分油深度脱硫中应用。
背景技术
化石燃料中所含的硫化物燃烧时排放出大量的二氧化硫等毒性气体，由此转化成的大面积酸雨严重污染大气和水源，破坏生态平衡，危害人类生存。化石燃料中的有机硫化合物成分复杂，大部分是杂环化合物，其中的C-S化学共价键十分牢固，用常规的物理和化学方法难以有效地除去杂环中的有机硫，成本也较高。
近年来，国际上迅速发展的生物脱硫(Biodesulfurization，简称BDS)技术将成为降低石油产品硫含量的有效途径。BDS可广泛用于处理汽油、馏分油、催化裂解原料油和渣油。BDS可以与已有的化学法加氢脱硫技术(Hydrodesulfurization，简称HDS)装置有机结合，最大限度地减少氢气的生产费用，并改善HDS装置的操作。另外，由于BDS过程中的副产物有机硫产品的价值较高，预计BDS比HDS在经济上有更强的竞争力。BDS在常温常压下操作，能耗比HDS低70-80％，采用BDS技术的投资额约为HDS的50％，操作费用比HDS低10-25％。
由于二苯并噻吩(Dibenzothiophene，简称DBT)是化石燃料中含量高、难降解的有机硫化物的典型代表，所以一直被作为模式化合物来研究。人们对微生物降解DBT的途径提出各种解释，可以概括为两种路线。一种是由Kodama等提出的C-C键断裂氧化途径[Kodama K K，et al.，Agric.Biol.Chem.，1973，37：45]，也称破坏性路线，即DBT的C-C键断裂后形成水溶性含硫化合物从油中脱出。这样脱去的不仅是硫本身，而是整个含硫杂环，这就会降低液体收率，同时也会降低有价值烃的燃烧值；另一种是C-S键断裂氧化的非破坏性路线，即DBT依次被氧化为亚砜(Sulfoxide)、砜(Sulfone)、亚磺酸盐(Sulfinate)和硫酸盐(Sulphate)，因此称为“4S”代谢途径[Kilbane JJ，Trends Biotechnol，1989，7：97]。由于后来该途径在R.rhodochrous IGTS8菌株进一步证实，所以又称IGTS8途径[Denome S A，et al.，Appl.Environ.Microbiol.，1993，59(9)：2837]。其特点是DBT中的硫被氧化为硫酸盐转入到水相，而其骨架结构则氧化成羟基联苯留在油相，没有碳的损失。因此，C-S键断裂氧化途径更具有应用价值。1999年，L.Setti等对R.rhodochrous IGTS8降解DBT的“4S”途径途径作了进一步分析[L Setti，et al，Appl Microbiol Biotechnol，1999，52：111～117]指出：IGTS8菌株的“4S”途径有两条不同路线：第一条路线DBT被转化成DBT亚砜和DBT砜。砜在亚硫酸水解酶的作用下转变为2-(2’-羟基苯)苯亚磺酸[2-(2’-hydroxyphenyl)benzene sulfinate]，进一步形成2-羟基联苯(2-HBP)和亚硫酸。第二条路线中砜进一步氧化成2-(2’-羟基苯)苯磺酸[2-(2’-hydroxyphenyl)benzene sulfone]，后者在磺酸水解酶的作用下转变为2，2-二羟基联苯(DHBP)和硫酸。
美国天然气研究所(简称IGT)分离的红平红球菌Rhodococcusrhodochrous IGTS8(J.J.Kilbane & B.A.Bielaga.Chemtech，1990)，可有效地脱除二苯噻吩结构中的有机硫，且不损失该有机物的热值，是一株有商业价值的菌株。日本也分离到几株红平红球菌(Izumi Y，et al.Appl.Environ.Microbiol，1994)。南韩国立重点科技研究所1998年分离到一株与红平红球菌很类似的诺卡氏菌Norcardia sp.，可用于油品脱有机硫，很有应用前景(J.H.Chang et al.Biotechnol，1998)。红平红球菌专一性的脱硫途径已从酶学和分子遗传学上所证实(Piddington C S et al.Appl.Environ.Microbiol，1995；Gray K A，et al Nature Biotechnol，1996)。
尽管人们分离到各种脱硫微生物，但它们的脱硫能力有限，还要经过诱变筛选或进行分子水平改良，或提供新类型的脱硫微生物。
发明内容
本发明提供一种新型脱硫微生物，能够专一氧化断裂C-S键，提高脱硫能力，用于石油馏分中有机硫的脱除过程。
本发明新型脱硫微生物菌株及变异体为：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Fds-1，CGMCC No.0644。(下面简称B.Subtilis Fds-1)
该B.SubtilisFds-1菌株的形态特征为：革兰氏阳性，杆状；有亚端生芽孢，芽孢圆形，孢束膨大，细胞直径小于1μm。
该B.Subtilis Fds-1菌株的生理生化特征见表1。
表1 B.Subtilis Fds-1菌株的生理生化特征
| 实验项目 | 结果 | 实验项目 | 结果 | 实验项目 | 结果 |
| 革兰氏染色 | 阳性 | 甲基红实验 | + | 7％NaCl生长 | + |
| 接触酶 | + | 利用葡萄糖产气 | - | 淀粉水解 | + |
| 厌氧生长 | - | 利用柠檬酸盐 | + | 明胶液化 | + |
| VP实验 | + | 硝酸盐还原 | + | 分解酪素 | + |
| VP＜pH6 | + | 50℃生长 | + | 利用葡萄糖产酸 | + |
| VP＞pH7 | - | pH5.7生长 | + | 利用木糖产酸 | + |
本发明的脱硫菌株与其它生物脱硫的专利菌种不同，与红球菌Rhodococcus rhodochrous ATCC 53968、诺卡氏菌Nocardia sp、节杆菌Arthrobacter sp等相比，亲缘关系较远，不是同一属的微生物；与专利US4,632,906中提出的Bacillus Sulfacportare ATCC 39909菌株相比，虽然是同属，但不是同种。而且本发明的B.Subtilis Fds-1菌株是经过紫外线处理的突变菌株，它与普通的枯草芽孢杆菌的区别是可以耐受较高的温度。
本发明的菌株可以用于石油或石油馏分的脱硫过程，如汽油、煤油、柴油、减压馏分油、渣油、各种原油等的脱硫过程。脱硫过程可以采用生长细胞和休止细胞两种方法脱硫，具体过程与其它菌株脱硫方法相同。
本发明提供的菌株是一种新型枯草芽孢杆菌，具有专一氧化断裂有机硫化物中的C-S键。因此，B.Subtilis Fds-1菌株可作为生物催化剂，专一性断裂含硫有机化合物中的C-S键，脱除硫原子，特别适合于石油馏分油的深度脱硫。该菌株通过4S途径脱除石油或石油馏分油中的有机硫，而不破坏其C-C骨架，因而不向其它微生物脱硫那样降低烃的燃烧值。并且脱硫功能强，具有工业应用价值。
本发明提供的B.SubtilisFds-1菌株，已于2001年10月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CBMCC No.0644。
具体实施方式
下面具体说明本发明微生物菌株的诱变筛选过程，以及应用效果。
本发明的B.subtilis Fds-1菌株是从高硫油井附近的土壤中分离并经过紫外线诱变筛选得到的。筛选方法如下：在中国胜利石油管理局孤岛油田的高硫油井附近，选几十个代表地点。先除去表层土，再从10-20cm深处取土样30-50g，装入无菌纸袋。将1g土样加入100ml基础盐培养基中(成分，重量百分比：KH2PO4，0.4％；Na2HPO4，0.4％；NH4Cl，0.2％；MgCl2·6H2O，0.02％；CaCl2·2H2O，0.0001％；FeCl3·6H2O，0.0001％；无硫碳源，0.1～0.3％)。30℃培养2～3天，静置后取上层液体1ml，加入富集培养基中(其成分为上述基础盐培养基中加0.01％～0.05％DBT)。
在富集培养基中30℃培养2～3天后在含有DBT的琼脂平板上划线分离单菌落。得到的单菌落做进一步的代谢途径分析，鉴别是否以4S途径降解DBT。其鉴别方法如下：将在富集培养基培养2～3天的菌液离心除菌体，取上清液并将其pH调至8.0，加少量Gibb’s试剂，呈现蓝色是二羟基联苯的专一反应，说明培养液中有DBT的降解产物存在。
对筛选到的脱硫菌株进行了紫外线诱变处理，方法如下：
将筛选到的枯草芽孢杆菌接入基础盐加DBT的富集培养基中，28-30℃振荡培养2天。取上述培养液离心，收集细胞，再用生理盐水洗涤后制成菌悬液。分装10mL菌悬液在培养皿中，置30w紫外灯下，距20cm照射1～6min，每隔30秒取样。不同紫外线(U.V)处理时间的菌液梯度稀释后涂布在培养皿上，与没经照射的对照细胞涂布培养皿一起培养2天。通过这些培养皿上生长的菌落数可以计算不同照射时间的致死率。选致死率在70％左右的存活细胞进行单菌落扩大培养后，接入摇瓶作脱硫能力对比。从对比实验中选出脱硫能力强的突变株即为本发明的脱硫菌株B.Subtilis Fds-1。
本发明菌株用于石油馏分脱硫可以采用如下过程。用生长细胞脱硫过程为：菌种培养→加入待处理油品→常温处理→分离油相。用休止细胞脱硫过程为：菌种培养→收集细胞→悬浮于磷酸盐缓冲液中→加入待处理油品→常温处理→分离油相。具体过程如下。
本发明采用生长细胞和休止细胞两种工艺对模型化合物(如DBT)或柴油脱硫。生长细胞脱硫利用加入适量有机硫(如DBT)的基础盐培养基作为培养细胞的培养基；接种量为5％，培养温度30℃，200rpm振荡培养48小时。然后加入10％待处理柴油，30℃，200rpm振荡培养24小时，分离柴油。休止细胞脱硫利用加入适量有机硫(如DBT)的基础盐培养基作为培养细胞的培养基；接种量为5％，培养温度30℃，200rpm振荡培养48小时。离心收集菌体，用pH7.2的磷酸盐缓冲液重悬细胞，按油水比1∶5加入柴油，200rpm振荡培养8小时，分离柴油，测定硫含量。上述条件可以根据具体情况进行调整。
下面通过实施具体说明。
实施例1：枯草芽孢杆菌B.Subtilis的筛选方法。
(1).取基础盐培养基10ml，加2mM DBT，接入土样5g。振荡1分钟，沉淀30分钟。用吸管取出上清液接入肉汤培养基，28-30℃培养24-48小时。
(2).将上述培养菌种分别接种到以DBT为唯一硫源的选择培养基中，30℃培养48小时。再进一步富集培养2～3天，取培养液离心，上清液作Gibb’s分析，呈现兰色说明培养物中含有可以专一性将DBT转化为2-HBP的菌株，或用气相色谱/质谱分析检测2-羟基联苯，判断专一性脱硫菌种存在。
(3).对上步检测呈现阳性的脱硫微生物划线分离，并对单菌落进行纯培养。
(4).对纯培养的菌株再做进一步的脱硫验证试验，然后对有脱硫能力的菌株进行分类学鉴定。本发明通过上述步骤分离、筛选出的脱硫微生物定名为枯草芽孢杆菌B.Subtilis。
实施例2：对筛选到的B.Subtilis菌株进行紫外线诱变筛选。
以实施例1分离到的B.Subtilis菌株为出发菌株，经紫外线(U.V)诱变，筛选脱硫能力强的突变株B.Subtilis Fds-1，方法如下：
(1).测定紫外线照射致死率
将分离到的具有脱硫能力的枯草芽孢杆菌接入基础盐加DBT的富集培养基中，28-30℃振荡培养2天。取上述培养液离心，收集细胞。再用生理盐水洗涤后制成菌悬液。取10ml菌悬液于带磁转子的培养皿中，置20w的紫外灯下，垂直距离30cm照射6分钟。每隔30秒取样。不同照射时间的菌液分别用生理盐水稀释，与没经照射的对照细胞同时涂布于基础盐培养基培养皿，30℃培养2-3天。通过这些培养皿上生长的菌落数，可以计算不同U.V照射时间的致死率。U.V照射3分钟的致死率在70％左右，此剂量下的存活细胞更容易积累有利变异。
(2).紫外线诱变
按前述方法，分装10mL菌悬液在培养皿中，紫外线照射3分钟。将存活细胞进行单菌落扩大培养后，接入摇瓶作脱硫能力对比。
(3).突变株B.Subtilis Fds-1的筛选
如果所选的菌株将以4S途径降解DBT，产生二羟基联苯(2-HBP)，可以用Gibbs反应检测出来。2-HBP在碱性条件下与Gibbs试剂(2，6-二氯醌亚胺)反应生成蓝色靛酚衍生物。其浓度与颜色成正比。Gibbs反应方法如下：用10％的Na2CO3溶液将菌液pH调至8.0，然后离心除菌体，取上清5mL，加入Gibbs试剂50μL，30℃反应30分钟后，溶液呈亮蓝色，即为阳性反应。测量其610nm处吸光度。测定发酵液中2-HBP的含量。
脱硫活力的测定：以单位时间一定量的菌体降解DBT产生2-HBP的量来比较脱硫活力：将培养液离心后用pH 7.0缓冲液洗涤，加DBT溶液，于30℃恒温振荡反应1h。测定2-HBP的生成量。从200个具有脱硫能力的突变株中，选定一个脱硫能力较强的菌株，菌株编号为B.subtilis Fds-1。
实施例3：B.Subtilis Fds-1菌株的生长细胞脱硫。
(1)将B.Subtilis Fds-1菌株按10％接种量接入到含有0.5～1.0mM DBT的50ml基础盐培养基中(组分为：每升蒸馏水中含有10.0g葡萄糖，4.0g NH4Cl，6.3g KH2PO4，8.0g K2HPO4，0.2g MgCl2·6H2O，1.0ml金属盐溶液和1.0ml维生素混合液。其中，金属盐溶液为2.0g CaCl2，1.0g NaCl，0.5g FeCl2·4H2O，0.5g ZnCl2，0.5g MnCl2·4H2O，0.1g Na2MoO4·2H2O，0.05g CuCl2，0.05g Na2WO4·2H2O和10ml 10M HCl溶于1升蒸馏水的溶液；维生素混合液是400mg泛酸钙，200mg肌醇，400mg烟酸，400mg盐酸吡哆辛，200mg对氨基苯甲酸和0.5mg维生素B12溶于1升蒸馏水的溶液)。在30℃，200rpm摇床培养48小时，测培养物中菌体浓度与产物2-HBP的含量。
(2)菌浓测定利用细胞干重与细胞悬液在660nm的光密度(OD660)之间的线性关系，通过测定培养物的OD值得出。
(3)B.Subtilis Fds-1菌株如上所述经过48h生长，菌体浓度可达到1.4～1.5g/L。平均比脱硫活性0.0907～0.1076mM/g干细胞/h；DBT脱除率可达98.8％。
实施例4：B.Subtilis Fds-1菌株的休止细胞和生长细胞进行柴油脱硫实验。
本发明菌株用于石油馏分脱硫可以采用如下具体过程。生长细胞脱硫利用加入适量有机硫(实验中采用DBT)的基础盐培养基(同实施例3)作为培养细胞的培养基；接种量为5％，培养温度30℃，200rpm振荡培养48小时。然后加入10％待处理柴油，30℃，200rpm振荡培养24小时，分离柴油。休止细胞脱硫利用加入适量有机硫(实验中采用DBT)的基础盐培养基(同实施例3)作为培养细胞的培养基；接种量为5％，培养温度30℃，200rpm振荡培养48小时。离心收集菌体，用pH7.2的磷酸盐(实验中采用磷酸氢钠)缓冲液重悬细胞，按油水比1∶5加入柴油，200rpm振荡培养8小时，分离柴油，测定硫含量。
按上述方法，用B.Subtilis Fds-1分别对不同规格柴油进行生物脱硫。
表2数据表明，用B.Subtilis Fds-1菌株对4#柴油(含硫量200μg/g)进行生长细胞脱硫，48h内可使硫含量降至40.1μg/g，脱除率达到79.9％。比未诱变的生长细胞脱硫率提高25.3％。
表2 B.subtilis菌株诱变前后的脱硫性能比较
| 脱硫方式 | 4#柴油(含硫量200μg/g) | |
| 脱硫后硫含量(μg/g) | 脱除率(％) | |
| 诱变后生长细胞 | 40.1 | 79.9 |
| 未诱变生长细胞 | 90.8 | 54.6 |
| 诱变后增加脱除率 | 25.3 | |
表3结果表明：B.Subtilis Fds-1菌株休止细胞的平均脱硫率比生长细胞高10％。最高脱硫率可以达到90％以上，说明该菌的休止细胞脱除有机硫能力更强。
表3 B.Subtillis Fds-1菌株的生长细胞和休止细胞脱硫对比
| 脱硫方式 | 2#柴油含硫320μg/g | 3#柴油含硫280μg/g | 4#柴油含硫200μg/g | |||
| 处理后硫含量μg/g | 脱除率％ | 处理后硫含量μg/g | 脱除率％ | 处理后硫含量μg/g | 脱除率％ | |
| 生长细胞 | 113.6 | 64.5 | 83.7 | 70.1 | 40.1 | 79.9 |
| 休止细胞 | 80.0 | 75.0 | 57.6 | 79.4 | 19.8 | 90.1 |
Claims (7)
1、一种枯草芽孢杆菌株(Bacillus subtilis)Fds-1，CGMCC No.0644。
2、权利要求1所述菌株在石油或石油馏分脱硫中的应用。
3、按照权利要求2所述的应用，其特征在于所述的石油或石油馏分为汽油、煤油、柴油、减压馏分油、渣油或原油。
3、按照权利要求2所述的应用，其特征在于脱硫采用生长细胞脱硫。
4、按照权利要求2所述的应用，其特征在于脱硫采用休止细胞脱硫。
5、按照权利要求3所述的应用，其特征在于采用生长细胞脱硫过程为：菌种培养→加入待处理油品→常温处理→分离油相。
6、按照权利要求4所述的应用，其特征在于采用休止细胞脱硫过程为：菌种培养→收集细胞→悬浮于磷酸盐缓冲液中→加入待处理油品→常温处理→分离油相。
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