CN1119413C - 节杆菌及其在矿物燃料脱硫中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种能选择性地打开含碳物中存在的硫化有机分子的C-S键的节杆菌菌株CBS 208.96及其在从矿物燃料中选择性脱除有机硫的方法中的应用。

Description

节杆菌及其在矿物燃料 脱硫中的应用
                     技术领域
本发明涉及一种能够选择性地打开含碳物中存在的硫化有机分子的C-S键的节杆菌(Arthrobacter sp.)菌株及其在从矿物燃料中脱除有机硫的方法中的应用。
                     背景技术
矿物燃料是指原油及其馏分、石油馏出物、石油蒸馏的残余物等等。
目前众所周知的是，使用硫含量高的矿物燃料是酸雨现象的主要原因，而酸雨时常造成极其严重的环境问题。为此，在北美、欧洲和日本已存在或将发布的法规趋向于尽可能限制硫含量高的矿物燃料的使用。例如，在美国，环境保护局(EPA)要求自1994年起柴油机燃料中硫的百分比要从0.27％降至低于0.05％。
另外，EEC法规也要求依照美国已施行的规定降低硫含量。北欧国家(瑞典和芬兰)实行更为严格的限制。
很明显，能达到这些新规定的矿物燃料将被迅速耗尽，而探寻在矿物燃料最终使用前从其中脱除硫的高效、经济的技术将很有必要。
实际上，原油以及石油馏分和各种石油产品往往含有大量的硫。例如，原油中存在0.025-5％的硫而重馏分中硫含量也达10％。原油中存在少量的元素硫、硫酸盐和硫化氢形式的硫，而硫主要以各种取代的硫醚、硫醇、噻吩、苯并和硫芴形式存在于有机基体中。具体地说，在象Texas石油这样的一些粗制品中，大约70％的硫是以硫芴(DBT)及其烷基衍生物的形式存在的。
虽然可以用物化处理法很容易地脱除无机硫化合物，但脱除有机硫却是一个大问题。
目前采用的常规的石油工业脱硫法是使用加氢脱硫技术(HDS)，该技术的要点是通过在高压、高温和存在金属催化剂的条件下将氢与燃料反应来把C-S键还原为硫化氢(H2S)。虽然对所谓不稳定化合物的脱硫而言HDS法似乎不会产生技术上的问题，但是，由于带有含杂原子的芳香结构的有机分子(难裂化分子)的加氢脱硫困难而使进一步分离受阻，反之亦然。这些难裂化分子通常需要加氢脱硫(Deep HDS)的操作条件，这些操作条件非常剧烈，造成大量烃类的降解。此外，石油中的高浓度重金属限制了加氢脱硫的应用，这是因为象人们已知的那样，重金属使该方法中所用的催化剂中毒。由于炼制过程中硫化化合物的浓度和重金属的浓度都增加，从残余燃料油中脱除有机硫的问题更难解决。为此，这些已知方法不是解决这个问题的可接受的方案。
这阐明了为什么过去五十多年来对预燃烧期间用微生物脱除燃料中存在的有机硫化化合物的可能性进行大量研究的原因。
文献中描述了脱除有机硫的许多方法，这些方法基于使用厌氧硫酸盐还原微生物(导致H2S的产生)和好氧氧化微生物(导致象硫酸盐和硫酸这样的水溶性无机形式的形成)。大多数好氧微生物采用Kodama所述代谢途径将作为模型分子的硫芴(DBT)降解(Agr.Biol.Chem，34，1320，(1970))。
按照这种代谢作用，DBT从一个苯环开始分解，得到苯并噻吩衍生物，因此分子中仍含有硫。尽管用水提取(由于其水溶性)来脱除该化合物在技术上是可能的，但考虑到因脱除DBT和类似DBT的化合物的含碳结构而造成的能量损失，涉及用这些微生物处理石油、再脱除含硫的水溶性产品的脱硫方法将会成本太高。
如果使该代谢进行到起始硫化分子的完全降解，将得到类似结果。
本领域中已描述了一些微生物，这些微生物通过代谢途径(也称4S途径，亚砜-砜-磺酸盐-硫酸盐)从硫芴中脱除硫。已证实这种途径对脱硫具有特异性，因为该途径从DBT中脱除硫，使含碳结构不受破坏而积累2-羟基联苯(图1)。
例如，Kilbane等人已描述了一种玫瑰色红球菌(Rhodococcusrhodochrous)菌株的分离，该菌株采用代谢“4S”途径从硫芴中脱除硫，产生2-羟基联苯(U.S.5.358.870，U.S.5.132.219，PCT/US92/01868，EPO 445 896 A2)。
但用这种微生物进行操作时，有必要使用表面活性剂以保持石油产品与微生物悬浮液的密切接触。这些试剂的采用以及工艺总成本的大幅度提高造成后继相分离步骤的的巨大困难。
采用这种微生物的方法通常是这样进行的：1.在碳源和其它营养物存在下进行微生物发酵；2.从培养基中分离生物量；3.采用该生物量作为脱硫反应的催化剂，该反应是在完全混合反应器中、有大量水存在下(以油的体积计，至少为1∶1)进行的；4.用适宜设备进行构成反应部分的各相的分离；5.在洗出和补入一定量之后，将由催化剂组成的浆相循环回脱硫反应器以维持催化性能恒定；6.过滤水相以使催化剂回收达最大；7.在出口处向水流中加入钙盐(生石灰或熟石灰)或铵盐(氢氧离子)，使硫氧化所得到的硫酸盐得以脱除；(使用铵离子可预知溶液的浓度，以使硫酸铵由于其高溶解性而得以分离)；以及8.采用高效分离器(静电分离器)从脱硫油相中脱除水。
这些已知技术的方法具有如下的主要缺点：——采用大量水以利于生物催化剂的性能(该催化剂在占优势的含水环境中发挥其活性)；—在反应混合物中采用高浓度的表面活性剂(0.5％)以便于油相在水相中的分散并且有助于基质向生物催化剂中的迁移现象；——在生物反应器出口处采用相分离用的高效设备以分散用表面活性剂所产生的乳状液；——掩埋所产生的硫酸钙而造成的高处理成本或者必须用工业方法处理另外产生的硫酸铵的必要性；——将硫酸盐大体上循环回脱硫反应器(20℃下硫酸钙的溶解度为0.2/100g，而硫酸铵是易溶的)，可能引起产物抑制。
文献中描述了一种短杆菌属(Brevibacterium)菌株DO(VanAfferden等，Arch.Microbiol.，153：324-328，1990)，该菌株沿“4S”途径经前三个步骤，达到DBT的完全矿化，进行另外一个代谢步骤，该步骤按图2所示图形导致苯甲酸盐的产生。
最近，Grossman等已描述了一种生物脱硫方法，该方法基于采用能够从BDT和4，6-二乙基硫芴中脱除硫的节杆菌属菌株(CA 2097217；Appl.and Envirom.Microbiol.，61：436 2-4366，1995)。
即使这种方法也还存在缺点。事实上，这些菌株的脱硫活性被低浓度(1mM)硫酸根离子抑制。
                     发明内容
现已发现，通过采用节杆菌的一种新菌株可能克服上述已知技术的缺陷，该菌株能够选择性地打开含碳物中存在的硫化有机分子的C-S键而不降解分子自身的含碳结构，不需表面活性剂。这使水消耗得以降低，采用简单设备即可对离开生物反应器的各相进行分离。另外，本发明菌株的脱硫活性不受达到46mM硫酸根离子的浓度的影响。
该菌株的样品于1996年2月9日保藏于the Centraalbureau voorSchimmelcultures(CBS)，得到的保藏号为CBS 208.96。
为了分离能通过“4S”途径降解DBT的微生物菌株，使用采自一定场所的生物除污中试工厂的土壤，所述场所被硫含量高的原油所污染。
通过在含有碳源和作为唯一硫源的DBT的培养基中的连续富集和纯化步骤进行分离。所得结果表明存在能利用DBT的菌株。纯培养基中微生物的后继分离(该微生物分别在以DBT为唯一硫源的培养基上重新培养过)能够选择出能利用作为唯一硫源的DBT的单一菌株。该菌株用缩写DS7初步表示。
为了证实DBT不是同时作为碳源，在两种培养基DS3(其中所含DBT作为唯一碳源)和DS4(其中所含DBT作为碳源和硫源)中培养DS7菌株。在这两种培养基中不能生长导致这样的假设，即DBT对这部分菌株的唯一用处是通过“4S”途径降解。
为证实这种假设，在DS2培养基(DBT作为唯一硫源)上培养菌株，使用DBT上“静息细胞”中的生物量。用乙酸乙酯提取反应产物并用HPLC和GC/MS进行分析。分析证实，存在着按“4S”途径的DBT的中间体和最终降解产物(2-羟基联苯)(图3和图4)。
通过在含碳源和作为唯一硫源的DBT的培养基中培养DS7菌株，可以获得各种生长阶段中脱硫所涉及酶的生成动力学(图5)。所得结果表明如下几点：——经指数生长期的一半(28小时)后，细菌表现其最大酶活性；—酶体系的稳定性良好，因为即使长期保存生物量之后(7天，4℃)也能保持酶活性；——菌株DB7对主要类型的硫化分子显示活性，这些硫化分子存在于直馏气油、加氢脱硫气油和石油常压蒸馏得到的主要馏分(馏分：70-160℃、160-230℃和230-350℃)；——菌株DS7能够产生可形成良好微乳状液/微分散液的乳化剂，而不需外加这些试剂；——形成微乳状液/微分散液的相可以容易地分离。
为鉴定菌株DS7，参考了下列文献所描述的方法：Bergey’s Manualof Systematic Bacteriology(Volumes 1-4)，Ed.1989，Williams& Wilkins，Baltimore。形态学和染色学特征：——革兰氏反应        +(24小时后可变)——形态型            多形，带V细胞——大小              0.6×1μm(稳定期)——迁移度            无——内生孢子          无——荚膜              无——Ziehl-Neelsen     -(24小时后)——异染粒            -培养特征——营养琼脂上的菌落  Beige/pinkish，湿润的——立体              凸形——生色              无——色素(用酸)        无——色素(用碱)        无——表面              光滑、有光泽——边缘              完整——大小(直径)              1.5mm(24小时后)——乳化性                  迅速，水中——在Y.E.培养基中的颜色变化碱性生理特征β-半乳糖苷酶               +细胞色素氧化酶              -过氧化氢酶                  +脲酶                        +明胶酶                      -精氨酸脱氢酶                -赖氨酸脱羧酶                -色氨酸脱氨酶                -硝酸盐→亚硝酸盐还原        -硝酸盐→N2还原             -耐受330mM NaCl              +碳源的利用甘油                        +(氧化)D-葡糖                      -D-果糖                      -D-甘露糖                    +(弱氧化)半乳糖                      +(弱氧化)L-山梨糖                    -鼠李糖                      -半乳糖醇                    -肌醇                        +(弱氧化)甘露糖醇                    +(弱氧化)山梨醇                      +(弱氧化)赤藓醇                      -D-阿拉伯糖                  -L-阿拉伯糖                  -核糖                +(弱氧化)D-木糖              -L-木糖              -核糖醇              -熊果苷              -七叶苷              +(水解)水杨苷              -纤维二糖            -麦芽糖              -乳糖                +(弱氧化)蜜二糖              -蔗糖                -海藻糖(Trealose)    -菊粉                -松三糖              -D-棉子糖            -可溶性淀粉          -糖原                -木糖醇              -龙胆二糖            -D-松二糖            -D-Lysose            -D-塔格糖            -D-岩藻糖            -D-阿糖醇            +(弱氧化)L-阿糖醇            -Amigdalin           -β-甲基-木糖苷      -苹果酸              -乙酸                -苯甲酸                -柠檬酸                -葡糖酸                +(弱氧化)α-甲基-D-葡糖苷      -α-甲基-D-甘露糖苷    -N-乙酰基-葡糖胺       -
根据形态和培养检验的结果可以断定，本发明的菌株DS7不属于分枝杆菌属(Mycobacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、Nocardioides、赭者菌属(Oerskovia)和蛛网菌属(Arachnia)菌种。实际上，与这些菌种不同，DS7没有严格的营养需求，它在短时间内生长，在琼脂化营养基质上不产生丝状物(菌丝、气生菌丝体)，对按照Ziehl-Neelsen进行的酸处理不具抗性。
菌株DS7具有确定的氧化代谢能力，没有属于棒状杆菌属(Corynebacterium)的兼性呼吸菌株的多样性或没有以厌氧型蛛网菌属形式生长的能力。
另外，鉴于其生理特征以及对所用碳源的独特表现，可以排除它属于红球菌属(Rhodococcus)。实际上，属于这个属的菌株能利用广谱的碳源并且不含β-半乳糖苷酶。特别是玫瑰色红球菌从果糖、葡萄糖、甘露糖、蔗糖、甘露糖醇、海藻糖产生酸，并且不在乳糖上生长。通过对膜脂的对比分析也支持该菌株不属于红球菌属这一论断。其染色和有限的酶学特征使其区别于扩展短杆菌(Brevibacteriumlinens)菌株，扩展短杆菌菌株有液化明胶的能力、如用碱或酸进行处理可产生一种不能洗掉的“细胞荚膜”和一种橙色色素。
菌株D7的下列情况使该菌株似乎是属于节杆菌(Arthrobacter)属，即不需要生长因子(它不需补充维生素或其它物质)、“正规”的形态发生周期(新鲜培养物中为带V细胞的椭杆菌，随成熟变为椭球菌)，与氧的反应(它是需氧菌)、它利用碳源的方式(仅是氧化的)、某些酶活性的精确表达(明胶酶、β-半乳糖苷酶)、染色特征(革兰氏反应可变、Ziehl-Neelsen阴性、无荚膜或内生孢子)。
分离菌株在乙酸盐和苯甲酸盐上不能生长表明，尽管它与Grossman等所述节杆菌菌株属同一类型，但为不同的种。
利用本发明的节杆菌菌株进行的脱硫方法在于，使该菌株或由该菌株分离到的酶复合物与待脱硫底物乳状液或悬浮液在水介质中接触(反之亦然)。悬浮液或乳状液是不用表面活性剂，在有机械系统的装置中或在不带活动部件的混合器(例如，基于喷射系统的混合器)中得到的。混合在室温、常压下进行，待脱硫底物与水相之间的体积比为1∶1-7∶1，优选3∶1。这样就可能得到一种微乳状液或微悬浮液，它对氧化反应器中的停留时间是稳定的，而停留时间通常随石油馏分的种类和相对硫含量而变化。
本发明的脱硫方法可用于原油、经真空下常压蒸馏的热处理的馏分(燃料油)、以及来自HDS厂有待强制脱硫的气油。
本发明的脱硫方法可以间歇进行或连续进行，优选连续进行，其特征在于下列主要操作步骤：(1)细菌DS7的培养
由细菌DS7或其酶衍生物构成的生物催化剂是通过在任何类型发酵器中培养细胞(优选连续培养)而制备的。含水培养基含有可同化的碳源、氮源以及各种阳离子和阴离子。
例如，制皂工业副产品形式的含甘油水可用作低成本碳源。可用于本发明方法的氮源可选自，例如，象硝酸铵、氯化铵或碳酸铵这样的铵盐，或者脲。
下列阳离子和阴离子同等地适合于本发明的目的：钾离子、钠离子、镁离子、铁离子、钙离子、磷酸根和氯离子。
培养基另外含有硫源，该硫源能诱导和保持具有脱硫活性的酶复合物的合成，所述硫源选自DBT、石油或其硫化有机分子含量高的衍生物。制备培养基所必需的水相可得自后续步骤(4)。
细胞是在温度20-35℃(优选30℃)、搅拌、通气(0.5-1体积空气/反应器体积/分钟)下进行的。pH大致维持在中性。(2)生物催化剂的制备
用生物工程中典型的方法和设备收集培养过的细胞并从培养基中分离。按照这一处理方法，细胞被浓缩于液流中，该液流将提供给后续的生物脱硫反应。
此外，也可对细胞进行催化活性更高的酶提取物的分离。同样可以按通常的生物技术手段进行这些操作(细胞破碎、核酸分离等)。(3)生物脱硫反应
可以在连续或间歇反应器中进行该反应。活塞流或搅拌式连续反应器(连续搅拌釜式反应器)都是优选的。后者可设计成单级或多级形式。
CSTR多级设计是最适合的。在活塞流反应器中，待脱硫的底物悬浮液加入预先形成的水介质中。
在CSTR反应器中，乳状液可在相同反应器中制备。这样制备是为了使生物催化剂与待脱硫的油相以及气相(空气、压缩空气)接触，硫的生物氧化过程所必需的氧就是从上述气相中获得的。
考虑到菌株DS7严格的亲油(oleophilous)性质，反应可以在没有表面活性剂的情况下进行，使用的水量减少。方便地采用待脱硫物质与水之间的体积比，即1∶1～7∶1，优选3∶1。
油相和水相可逆流加入，这样形成可用相关生物反应进行液-液萃取的系统。这些系统中(其中，每一级由一个混合器和一个分离器组成)，可用得自硫酸盐脱除(参见(5))的水生产新鲜催化剂。因此，可用最高效率实现脱硫活性。
脱硫反应在温度20～40℃、优选25～35℃，pH5～9、优选6.5～7.5下进行。(4)在反应器出口处进行相分离
使用能使重力场有适度增加的相分离器(以有限转数进行的离心，旋液分离器等)足以进行分离。
分离得到下列三股液流：a)脱硫油相，脱水后可送交使用。脱水操作不成问题，因为水主要与生物催化剂相结合，其脱除并不困难。b)含有少量生物催化剂的水相，生物催化剂可用常规技术(离心、过滤等)脱除。可对剩余水流进行如(5)中所述的硫酸盐脱除步骤，再循环至步骤(1)。c)主要由生物催化剂、油和水组成的粘液相。根据硫酸盐含量的不同，可将这种液流直接循环到脱硫反应器或进行硫酸盐的脱除，脱除硫酸盐是通过使粘液流重新悬液于水中并对混合物进行离心而进行。将残留水流与b)中所述的水流连接起来。(5)硫酸盐的脱除
得自(4)的水源汇合在一起，并用硫酸盐还原厌氧细菌进行硫酸盐的脱除。这种处理可以在厌氧过滤式常规厌氧反应器(用吸附在固态载体上的生物量进行操作)或Up-flow AnaerobicSludge Blanket式常规厌氧反应器(UASB，用聚集的生物量进行操作)中进行。
这一步骤中，硫酸盐被还原成可溶性硫化物。石油工业中所用普通设备中可能有的痕量硫化氢可被脱除，而可溶性硫化物在采用需气的或微需气的微生物生物量的后续生物步骤中可再次氧化成元素硫。所述微生物的例子有下列各属：硫杆菌属(Triobacillus)，贝日阿托菌属(Beggiatoa)、发硫菌属(Thiotrix)、辫硫菌属(Thioploca)、副球菌属(Paracoccus)等。
用吸附或聚集的生物量进行操作的反应器也可用于将硫化物氧化成硫的反应。不过，所需氧供应有限，使下列情况成为优选的：在微需氧微生物的情形中，使用其中生物量吸附于旋转载体上的反应器(旋转式生物接触器，RBC)；而在需氧微生物的情形中，使用在高度方向上在顶部设有一个沉降器的结构。
鉴于上述微生物的中温性质，最好在接近室温的温度下使用这些微生物，最好控制在大约30-35℃。优选的操作pH接近中性，但可达到酸值，操作压力为常压。
通过沉降、洗涤、固体物过滤操作、硫的熔化及其分离，可以从水相中和从生物量中分离离开反应器的硫。130℃下发生硫的熔化，得到一定纯度的产品。该纯度的硫可市售供生产硫酸。
除硫的一系列操作产生一定硫酸盐含量的水，该硫酸盐含量的水与营养物结合后，可将其一部分循环到培养细菌DS 7的步骤(1)，另一部分再次用于重新悬浮生物量。采用这些操作，也可得到净化的冲洗液流，该液流可直接或在简单的常规需氧后处理之后排入表面水生系统中。后一操作可以在石油工业常见的水处理厂中进行。
                   附图简述
图1：按照4-S途径的硫芴降解途径。
图2：针对短杆菌提出的硫芴降解途径。
图3：反应开始时，用HPLC对“静息细胞”提取物进行的分析。谱峰是2-羟基联苯(RT＝10.85)，DBT(RT＝15.30)；
图3a：最佳条件下反应2小时后，用HPLC对“静息细胞”提取物进行的分析。反应开始时存在的DBT已转化成2-HBP。
图3b：对4℃下保存7天的细胞样品进行HPLC分析。由这种分析证实了“4-S”途径；DBT-SO(7.7)；DBT-砜(9.4)。
图4：用GC-MS分析“静息细胞”提取物。峰相当于保留时间，67乙酸乙酯；1292-羟基联苯；209DBT；372DBT氧化物。
图5：酶复合物的生成动力学。
                 具体实施方式
下列实施例的唯一目的是更好地阐述本发明，绝不应理解为对本发明范围的限制。实施例1 节杆菌的分离
为分离一种能通过“4S”途径降解DBT的微生物菌株，使用采自一定地点生物除污中试工厂的土壤，该地点污染有(约1.6％w/w)有机硫含量约为6％的Sowedi原油。
向200ml水中加入100g土壤，剧烈搅拌再进行沉降后，取出两份5ml上清液等分试样。
将两份试样用于接种两个250ml烧瓶，每个烧瓶含50ml两种不同的培养基(DS1和DS2)，其在双蒸馏水中的组成为：
             表1组分             DS1                DS2KH2PO4         10.0g/l            10.0g/lNH4Cl           2.0g/l             2.0g/lMgCl2·6H2O    0.2g/l             0.2g/lDBT              -                  0.5g/l琥珀酸           4.0g/l             4.0g/lFeCl3           10.0mg/l           10.0mg/lCaCl2           20.0mg/l           20.0mg/lpH(用NaOH)       6.4                6.4
将两个烧瓶置于30℃、200rpm的定轨NBS培养箱中。在同样的培养基上连续进行5次传代培养，间隔为72小时，接种量为5％(v/v)。
DS1培养基用作对照，以显示由于其它营养物中存在的硫杂质引起的基本生长。在DS2上的生长水平高得多，证实了DBT中的硫对培养基中存在的微生物的作用。
将在DS2上5次传代培养后得到的培养基用于接种(以不同的稀释率)含最大琼脂化培养基(Nutrient Agar，DIFCO)的培养皿，让其在30℃培养48小时。在生长的所有菌落中，选择出7个在形态和/或色素特征方面相互明显不同的菌落。
首先在上述Nutrient Agar上的单独培养皿中分离这7个菌株，然后接种到含DS2培养基的烧瓶中，以检验它们利用DBT作硫源的能力。结果证实，仅有一个菌株能在这些条件下生长。实施例2 降解途径的证实A)把能在作为硫源的DBT上生长的唯一菌株(DS7)用作培养基DS3和DS4的接种物，培养基DS3和DS4具有表2所示组成。
         表2组分           DS3         DS4KH2PO4      10.0g/l     10.0g/lNH4Cl         2.0g/l      2.0g/lMgCl2.6H2O  -           0.2g/lMgSO4.7H2O  0.2g/l      0.5g/lDBT            0.5g/l      0.5g/l琥珀酸         -           -FeCl3         10.0mg/l    10.0mg/lCaCl2         20.0mg/l    20.0mg/lpH(用NaOH)     7.2         7.2
在这些培养基中，DBT既作为唯一碳源(DS3，以硫酸盐形式提供硫)，也作为硫源和碳源(DS4)。
在这些培养基上不能生长被认为是DS7脱硫活性的表现。B)检验“4S”途径中间体和终产物(2HBP)的存在
把菌株DS7于30℃在DS2培养基上培养28小时；将收集的培养基离心并用10g/l磷酸缓冲液(pH7.2)洗涤2次。
将生物量(约为100mg干物质)悬浮于25ml同种磷酸缓冲液中并置于烧瓶中。搅拌下，向烧瓶中加入0.625ml的4mM硫芴乙醇溶液。所以，反应介质中硫芴的初始浓度为1mM。将得到的2ml混合物置于密封的安瓿中并用2巴的氧加压。在预定的培养时间后，把2ml乙酸乙酯加入安瓿中以进行DBT及其衍生物的萃取。所得提取物用HPLC(图3)和GC/MS(图4)进行分析。
图3和图3a中所示结果表明，反应2小时后DBT几乎全部转化成2-羟基联苯。应指出的是，图3中证实的2-羟基联苯可能是DBT直接转化成的2-HBP，也可能是发酵期中微生物所生物吸附的2-HBP。在图3b中可以证实DBT按“4S”途径的所有降解产物的存在。仅对催化活性降低的细胞才能观察到这些产物(正如在4℃保持7天后所发生的那样)，或用氧限制下的动力学试验得到。实施例3A) 酶生成的动力学
为证实各生长期中脱硫所涉及的酶的生成趋势，用菌株DS7接种含500ml DS2培养基的2l烧瓶，所述培养基为具有更低的诱导物浓度(从0.5g DBT/l到20mg DBT/l)而进行了改进。由预先在三角瓶中进行的同种培养基上的培养而得到25ml接种物。在上述相同条件下对烧瓶进行保温。
在16小时、22小时、28小时和39小时从培养液中取样。测定样品的下列参数：660nm处的光密度、干重和比脱硫活性。用双蒸馏水洗涤生物量后，以105℃下恒定的残留物来测定干重。测定20ml培养液试样的比活性。将试样在8000g下离心10分钟，再悬浮于20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.2)中，再次离心。使生物量再悬浮于相同的缓冲液中以使终体积为9.75ml。将所得细胞悬浮液转入其中已添加了0.25ml 40mM DBT乙醇溶液的50ml烧瓶中。把烧瓶于搅拌下在30℃保温，在预定的时间取出混合物试样并用HPLC进行分析。所得结果示于图5。从图5可以看出，当细菌处于超过其对数生长期的一半的情况时，酶活性的最大表现是如何计录的。B) 用石油馏分诱导酶活性
为此，在DS2培养基上培养菌株DS7，所述DS2培养基中作为诱导物和硫源的硫芴被下列物质替代：(a)含13600ppm硫的0.5ml/l石油馏分，230-350℃，(b)得自HDS、硫含量为2000ppm的1ml/l气油。按A)中所述方法在500ml烧瓶中进行培养。44小时后，对20ml培养液中所含的生物量进行分析以测定比活性。对样品(a)而言，该参数为4.3mg干DBT/g/h；对样品(b)而言，该参数为2.6mg干DBT/h。这些结果指出，所研究的石油产品能诱导酶复合物的合成。实施例4 气油的脱硫试验
使用一种经过标准HDS脱硫处理、残留硫含量约为2000ppm、带有47ppm流化添加剂DODIFLOWV 3905-2的气油。同时用含硫10200ppm的未脱硫气油进行试验。连续培养(稀释率0.09h-1，培养基类似于实施例2A)的培养基)后获得的生物量用离心法分离并用pH7.2的Tris-HCl缓冲液洗涤2次。然后将其再悬浮于相同缓冲液中，使干产物浓度达38mg/ml。
再将7.5ml细胞悬浮液和2.5ml气油置于53ml转筒中。把转筒放在2.0巴压力下的氧中，并于30℃、200rpm搅拌下保温(标准试验)。为证实该反应条件(含水的氧化环境)下可能有的副反应，进行一个参照试验，其中用Tris-HCl缓冲液代替细胞悬浮液。还在石油馏分和细胞存在下进行第三个试验(作为零时刻)。24小时后终止标准试验和参照试验。对反应混合物进行离心(8000g，20分钟)。通过气相色谱法分析回收到的油相，所述色谱法采用装有原子发射检测器(Atomic Emisson Detector，AED，Mod.HP5921-A)的Hewlett-Packard设备(Mod.5890)。用J.W.S.的DB-1型毛细管柱进行色谱分离。表3给出了扣除零时刻贡献后的结果。应指出的是，参照试验未表现出任何平行现象。
       表3气油       硫，ppm     脱硫％直馏       10,200      13.5得自HDS    2,000       19.7
从该表可以看出，细菌DS7对测试的两种气油都具有活性。
此外，正如从表4中所示数据观察到的，菌株DS7对测试的气油中所含的主要类型的硫化分子具有活性。
    表4分子    脱硫    ％(24小时)
    直馏    得自HDSC3-BT   10.2    18.9DBT     10.3    16.8Cl-DBT  10.3    22.9C2-DBT   7.1    5.1实施例5 有和没有乳化剂时的脱硫
用一模型系统进行试验，该系统由硫芴浓度为0.3和3％的十二烷构成。
用0.3％的DBT进行操作，进行三个不同的实验，以证实乳化剂对菌株DS7脱硫活性的影响。第一个实验没有添加乳化剂，第二个和第三个则分别含0.25和0.5％Triton N-101。
对所有试验采用下列步骤：把油相等分试样(2.5ml)置于容积为53ml的8个(每个试验2个)转筒中。然后向每个转筒加入含细胞的7.5ml Tris-HCl缓冲液(20mM，pH7.2)，含细胞的缓冲液中比例为12.5mg干物质/ml(每个转筒干物质总重大约为100mg)。封闭转筒，用氧使压力达2巴。8个转筒中的代表零时刻的4个转筒在加氧后立刻置于冰浴中并如下所述立即进行分析。另4个转筒在30℃恒温浴槽中于搅拌(200rpm)下保温16小时。
把8个转筒中所含反应混合物转入玻璃试管并在8000g下离心15分钟。将十二烷试样用乙酸乙酯适当稀释并用HPLC分析。扣除零时刻之后的结果示于表5中。
              表5乳化剂            DBT      脱硫(Triton N-101)    ％       ％-                 0.3      35.10.25              0.3      14.60.5               0.3      16.4-                 3        3.1
上述结果表明，细菌DS7不需商用乳化剂来实现其脱硫活性。相反，应指出的是，外加乳化剂具有很大的抑制作用。实施例6 模型系统中的脱硫试验
进行这些实验的目的是为了说明菌株DS7的亲油性(oleoficity)减少该方法的耗水量。
为此，在每个试验中采用0.3％DBT的十二烷溶液和一定量的生物量，进行了3个不同的实验。第1个试验使用2ml细胞悬浮液(19.8mg干物质/ml水)和4ml十二烷(油相：水相比2∶1)。用相同方式进行第二个试验，但提高十二烷+DBT(比例3∶1)的体积至6ml。将这两个试验与第三个试验(其中油相∶水相之比为1∶1)相比较。
将混合物在650ml安瓿中进行反应(2×试验)。把氧通入安瓿达1.5巴，密封并于30℃、搅拌下保温。把零时刻的三个安瓿和20小时时的另三个安瓿减压。进行相分离后，取出有机相试样，加入乙酸乙酯(4体积/体积)并用HPLC进行分析。
表6表示在第20小时时获得的扣除了零时刻之后的结果。
        表6十二烷/水相之比
                                 脱硫
                       mg  降解的 DBT/g 干物质1∶1                            38.12∶1                            36.13∶1                            34
正如从该表可以看出的那样，在水量较少时脱硫水平也是近似的。实施例7 硫酸盐浓度对菌株DS7脱硫活性的影响
采用三个相同量的干DS7生物量(13mg/ml)进行试验：——第一个(空白)，悬浮于pH7.2、20mM Tris-HCl缓冲液中；——第二个，悬浮于含15.5mM Na2SO4的相同缓冲液中(相当于500ppm硫)；——第三个，悬浮于含46.5mM Na2SO4的相同缓冲液中(1500ppm硫)。
添加DBT(1mM)后，于30℃、200rpm的搅拌槽中进行这三个实验。2小时和4小时后，测定残留的DBT浓度。表7表示了所得结果。
          表7硫酸盐             脱硫(％)mM           2小时    4小时0            75       10015.5         55       10046.5         50       100实施例8 石油馏分的脱硫试验
使用由总硫含量为1.36％的原油(Belaym原油)常压蒸馏得到的下列馏分：1)70-160℃馏分；2)160-230℃馏分；3)230-350℃馏分。每一馏分中的硫含量分别为400，2400和13600ppm。另外，向每一馏分中加入160ppm硫(以硫芴形式加入)。这是为了获得精确的参照化合物。
把5ml石油馏分与5ml 0.1M磷酸缓冲液(pH7)混合。使用两种不同浓度的细胞，即分别为16和32mg干物质/ml缓冲液。用氧使含有反应混合物的安瓿达到1，5巴并密封。使用由相同混合物构成的对比样品，其中在把细胞与油相接触之前，通过把温度升高至121℃达20分钟而使细胞失活。在预定的时刻(24和48小时)，对各个安瓿中的全部内含物进行离心(8000g，20分钟)并按实施例4所述用GC/AED进行分析。采用J.W.S的DB-1型毛细管柱进行色谱分离。所得总脱硫水平示于表8。
       表8馏分                细胞
      16mg/l              32mg/l
      脱硫      ％        脱硫    ％
      24小时    48小时    24小时  48小时70-160℃                      2.5     4.6160-230℃ 3.2       5.4       4.1     8.5230-350℃ 4.1       7.9       8.2     14.1空白      -         -         -       -还测定了最后一种馏分中下列主要种类化合物的脱硫水平：甲基-苯并噻吩(C1-BT)、乙基-苯并噻吩(C2-BT)丙基-苯并噻吩(C3-BT)和烷基(Alchyl)-硫芴(C1-C3-DBT)。所得结果示于表9。
        表9分子                  细胞
        16mg/l               32mg/l
        脱硫      ％         脱硫    ％
        24小时    48小时     24小时  48小时C1-BT       3.5       7.7        5.9     14.3C2-BT       4.2       8.1        8.4     16.2C3-BT       4.5       8.3        7.7     15.1Cl-C3-DBT   3.4       7.6        8.9     17.9实验例9 水-油乳状液的分离试验和催化剂的回收
把细胞在0.1M、pH7的磷酸缓冲液中的均匀悬浮液100ml(32mg干物质/ml)与等体积实施例4中所用相同脱硫气油相接触。把容器封密、置于2巴的氧气氛中，在30℃、200rpm搅拌下保温。通过向混合物中添加比例为0.25％(v/v)的Triton N-10而进行对比试验。24小时后，以2000g、4000g和8000g离心混合物。回收的不同相的体积示于表10。
                表10重力      有乳化剂            无乳化剂
        所得到的相  (ml)    所得到的相  (ml)
      油    水   乳状液   油    水    乳状液2,000     76    2    122      83    38    794,000     81    3    116      89    41    708,000     83    6    111      91    48    61
从这张表可以看出，在所有情况下，不加乳化剂时回收的油相和水相比加了乳化剂时要高。应指出的是，在加了乳化剂的情况中，所回收的水相其实可以忽略不计。
采用表面活性剂时，在脱除硫酸盐之后，待循环至反应器的水相的分离似乎极为困难。
采用菌株DS7(它不需使用乳化剂)所获得的优点十分明显。实际上，在低重力下离心就能分离：——透明的脱硫油相；——有待分离硫酸盐的透明水相；以及——乳化相，它含有可循环至氧化反应器的所有活性脱硫细胞。

Claims (9)

1.一种节杆菌生物学纯培养物CBS208.96，它能选择性地打开矿物燃料中存在的硫化有机分子的C-S键，而不破坏含碳结构。
2.一种通过选择性地打开硫化有机分子的C-S键而从矿物燃料中脱除有机硫的方法，该方法包括：
(a)在pH5～9、温度20～40℃、压力为常压至0.3MPa的氧化气氛中，使所述矿物燃料的乳状液或悬浮液与节杆菌CBS208.96接触；
(b)从(a)中获得的反应混合物中分离脱硫油相、水相和由生物催化剂节杆菌CBS 208.96及油和水组成的粘液相；
(c)把粘液相循环至脱硫步骤(a)；
(d)用能够通过把硫酸盐转化成硫而脱除硫酸盐的厌氧和需氧微生物处理水相；
(e)把完全脱除了硫的水循环至步骤(a)。
3.根据权利要求2的方法，其中在步骤(a)中，矿物燃料乳状液是这样获得的：在没有表面活性剂的条件下，采用矿物燃料/水的体积比为1∶1～7∶1，使矿物燃料与水混合。
4.根据权利要求3的方法，其中体积比为3∶1。
5.根据权利要求2的方法，其中在步骤(c)中，粘液相在循环至步骤(a)之前先用水洗涤，并且按步骤(d)和(e)所述对洗水进行处理。
6.根据权利要求2的方法，其中步骤(a)中的pH为6.5～7.5。
7.根据权利要求2的方法，其中步骤(a)中的温度为25～35℃。
8.根据权利要求2的方法，其中矿物燃料为原油、石油馏分、石油馏出物以及石油蒸馏的残留物。
9.根据权利要求2-7任一项的方法，该方法是连续进行的。
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