CN101134944B - 一种应用于燃料油中含硫杂环化合物脱硫的分枝杆菌及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种应用于燃料油中含硫杂环化合物脱硫的细菌菌株。该菌株经鉴定命名为分枝杆菌(Mycobacterium sp.)ZD-19，保藏号为：CGMCC NO.1817。本发明还公开了该菌株在对含硫杂环化合物的燃料油中进行专一性脱硫的用途，以此菌株为催化剂，采用生物脱硫技术，降解燃料油中的含硫杂环化合物，对二苯并噻吩及其衍生物4，6-二甲基二苯并噻吩的降解过程遵循独特的“扩展4S途径”，能将传统“4S途径”的产物2-羟基联苯及3，3’-二甲基-2-羟基联苯进一步甲氧基化，生成最终产物2-甲氧基联苯及3，3’-二甲基-2-甲氧基联苯，有效地减弱了产物抑制。该菌株用于燃料油中的生物脱硫，性能优越，具有工业应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及能应用于燃料油中含硫杂环化合物脱硫的细菌菌株及其用途。
背景技术
化石燃料是当今世界最主要的能源物质，但其一般都含有大量的含硫化合物，这些含硫化合物在燃烧过程中会生成大量的二氧化硫，而二氧化硫又是形成酸雨的最主要因素。随着燃料油使用量的不断增加，低硫含量的高品质油的减少，人们使用高含硫量的燃料油，加剧了环境的污染。为了应对这一严峻形势，世界各国都对燃料油的含硫量作出了严格的规定(莫蒂克.DJ，《生物工艺学》，2000，11：540-546)，2006年燃料规范要求汽油含硫量低于30×10-6g/g。我国也对燃油的含硫量制订了严格的控制标准，新标准GB17930-1999规定硫含量要小于0.08％。
原油中的硫大致可以分为无机硫和有机硫两种，无机硫主要包括溶解或悬浮在油中的元素硫、硫化氢、硫化物和硫铁矿等；而占含硫量的大部分的是石油中大约200种左右之多的有机硫，这些有机硫由各种硫醇、硫醚和噻吩及其衍生物组成(郑嘉惠，《当代石油石化》，2003，11(1)：4-6)。
当前石油及其产品中的脱硫普遍采用的方法为加氢脱硫(HDS)。HDS是在高温(>300℃)、高压(>10MPa)、加氢和金属催化剂的条件下进行的脱硫反应。该法可有效地脱除无机硫和简单的有机硫化合物，而对于杂环类含硫化合物，如二苯并噻吩(DBT)，特别是烷基取代DBT衍生物，HDS很难脱除这部分硫。
近年来，生物脱硫技术(BDS)得到了极大地发展。生物脱硫技术(BDS)是一种在常温常压下利用需氧、厌氧菌去除杂环化合物中结合的有机硫的一种新技术(丹尼尔.J，莫蒂克，《化工工艺》，1998，28(7)：38-45)。该方法有效脱除DBT等含硫杂环化合物，而且反应条件温和，投资和操作费用低。据估计，BDS的设备投资仅为HDS的50％，操作费用将减少10％-20％(斯蒂芬罗曼诺-加西亚，《碳氢化合物加工》，1995，74(5)：19-20)。
发明内容
本发明提供了一种能对燃料油中含硫杂环化合物脱硫的分枝杆菌，该菌株用于降解燃料油中二苯并噻吩及其衍生物4，6-二甲基二苯并噻吩、噻吩、苯并噻吩、二苯硫醚等含硫杂环化合物。
从油田、炼油厂、污水处理厂等地提取污泥和被污染的土壤样品，样品经浸取、富集和驯化后，将菌液涂布于选择性培养基平板上，分离单菌落扩大培养，用GC-MS检测降解DBT后的产物，初筛得到按“4S”氧化途径选择性降解DBT的菌株。以DBT为唯一硫源培养初筛菌种至指数生长后期停止培养，收集休止细胞，系统比较了各休止细胞的脱硫性能，复筛得到一株生长特性较好、活性较高的目标菌株。
该菌株该菌株属于分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)；菌落形状呈圆形，直径1～2mm；细胞呈球状，0.5-1.0μm；无芽孢，无夹膜；革兰氏阳性菌株，好氧。能以二苯并噻吩为唯一硫源。其保藏编号为：CGMCC NO.1817。
本发明采用生物脱硫技术，以分枝杆菌(Mycobacterium sp.)ZD-19菌株为生物催化剂，在常温常压条件下降解燃料中的含硫化合物，二苯并噻吩(DBT)是燃料油生物脱硫公认的模型化合物，该菌株降解二苯并噻吩(DBT)过程遵循独特的“扩展4S途径”(如图1所示)，能专一地切断DBT中的C-S键，生成2-羟基联苯(2-HBP)，然后继续将其甲氧基化，产生终产物2-甲氧基联苯(2-MBP)，能部分消除2-HBP对酶的抑制和对细胞的毒害，从而更有利于生物脱硫。同时将硫原子氧化成无机硫化合物转入水相，产物2-MBP仍留在油相中，不损失油的热值。降解DBT的衍生物4，6-二甲基二苯并噻吩也同样遵循独特的“扩展4S途径”(如图2所示)。除DBT外，该菌株还能以燃料油中的其他含硫杂环化合物：噻吩(TH)、苯并噻吩(BTH)、二苯硫醚(DPS)和4，6-二甲基二苯并噻吩(4，6-DMDBT)作为底物降解，表现出较广的底物范围；同时该菌株还能同时降解DBT和4，6-DMDBT的混合物，有利于超低硫油品的生产，具有较好的燃料油生物脱硫工业应用前景。
附图说明
图1为该菌株降解DBT的“扩展4S途径”；
图2为该菌株降解DBT的衍生物4，6-二甲基二苯并噻吩的“扩展4S途径”；
图3为该菌的休止细胞脱除DBT的底物和产物浓度随时间变化；
图4为该菌的休止细胞脱除DBT在不同时间的底物和代谢产物的GC图；
图5为该菌的休止细胞脱除4，6-DMDBT的底物和产物随时间变化的GC图；
图6为该菌的休止细胞脱除TH、BTH、DPS、4，6-DMDBT时其降解程度随时间变化；
图7为该菌的休止细胞同时脱除DBT和4，6-DMDBT时其浓度随时间变化。
具体实施方式
实施例1
1.菌种的选育：
从油田、炼油厂、污水处理厂等地取污泥和被污染的土壤样品，经浸取、富集和驯化之后，将培养液按10倍稀释法进行系列稀释，取10-4到10-8稀释倍数的菌液涂布于固体选择培养基平板，倒置于恒温培养箱，30℃培养5～6天，挑出分离的单菌落扩大培养，用GC-MS检测降解DBT后的产物，初筛得到按“4S”氧化途径选择性降解DBT的菌株。以DBT为唯一硫源培养初筛菌种至指数生长后期停止培养，收集休止细胞，系统比较了各休止细胞的脱硫性能，复筛得到一株生长特性较好、活性较高的目标菌株。该菌株的短期保藏，接入添加DBT的斜面培养基，于冰箱4℃保藏。长期保藏，制备冻干管，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2006年9月18日，保藏编号：CGMCC NO.1817。
2.该菌株的培养条件
1000mL液体培养基组成如下：
K2HPO4·3H2O5.0g，NaH2PO4·2H2O2.0g，MgCl2·6H2O0.2g，NH4Cl2.0g，甘油2g，微量元素1mL，硫源为0.2～0.5mM DBT。其中微量元素组成(每100mL蒸馏水)：CuCl2·2H2O0.011mg，CoCl2·6H2O0.04mg，ZnCl20.02mg，CaCl20.4mg，H3BO30.005mg，NaMoO4·2H2O0.02mg，FeCl3·7H2O0.4mg，AlCl3·6H2O0.01mg，MnCl2·4H2O0.08mg。
固体选择性培养基平板和斜面：液体选择培养基加1.5～2％水洗琼脂。
培养条件：适宜生长pH范围为6.5～9.5；适宜生长温度为20～40℃；以氯化铵为氮源，适宜浓度为0.5～2.0g L-1；以甘油为碳源，适宜浓度为1.0～4.0g L-1；以DBT为硫源，浓度为0.1～0.5mM。
3.菌株形态及分子生物学鉴定
该菌株属于分枝杆菌属(Mycobacterium sp).；菌落形状呈圆形，直径1～2mm；个体形状呈球状，0.5-1.0μm；无芽孢，无夹膜；革兰氏阳性菌株，好氧。
根据测得的该菌株的16S rDNA基因序列在NCBI网站，以BLAST程序进行比较分析，对其同源分类鉴定。发现它与分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)的多个菌株序列相似性都达到98％以上。选取14株分枝杆菌利用DNAStar软件将这些相应序列与该菌序列进行同源性比较，建立系统进化树。结合系统进化树和MegAlign的同源性分析，将该菌归属为分枝杆菌属，最后将该菌株命名为Mycobacterium sp.ZD-19。
实施例2：Mycobacterium sp.ZD-19降解含硫杂环化合物的新途径
1.休止细胞的制备：将4℃冰箱保存的菌种接种于斜面培养基，30℃下培养96小时。再将经活化的菌种接入灭菌后的DBT为唯一硫源的液体培养基，置于30℃摇床，180rpm培养至对数期后期停止培养，将菌悬液离心分离，用0.85％的生理盐水洗涤两次，下层菌相浓缩悬浮于pH7.0的0.1M的磷酸缓冲液中，制备得到休止细胞，用于含硫杂环化合物的脱硫。
2.水溶液脱硫反应：将休止细胞悬浮液和一定浓度的含硫杂环化合物，置于转速180rpm，温度30℃的摇床中反应，间隔一定时间取样，用等量乙酸乙酯萃取，4800×g离心分离10分钟，有机相用GC分析，有机相中产物成分用GC-MS分析。
3.休止细胞降解DBT结果比较和分析：在水相脱硫时，加入DBT浓度为0.5mM，置于摇床中反应，间隔3、6、9、12、16、20、24、30、36、42、48小时取样，离心，有机相用GC分析，测定产物生成量，GC-MS分析，确定物质结构。如图3所示该菌株脱硫的产物2-HBP在9小时到达最大值，DBT完全被转换为2-HBP，而随后2-HBP浓度逐渐下降，其进一步被细胞氧化成2-MBP，在36小时2-HBP完全被氧化成2-MBP。图4是该菌休止细胞脱除DBT在不同时间的底物和代谢产物的GC图，十分直观的表明底物和产物的变化。这种将“4S途径”的终产物2-HBP甲氧基化成2-MBP的“扩展4S途径”是非常罕见的，且由于2-HBP对细胞有很强的毒性，对DBT的降解有很强的抑制作用，而2-MBP相对于2-HBP极性较小，对细胞的毒性也较小，因此将2-HBP氧化成2-MBP可在很大程度减轻2-HBP对脱硫的抑制作用，因此这种新途径的发现对油品脱硫有着积极意义。
4.休止细胞降解4，6-DMDBT结果分析：应用休止细胞进行4，6-DMDBT脱硫反应，测定不同反应时间的底物消耗和代谢产物生成情况。如图5所示，反应初始，4，6-DMDBT按“4S途径”代谢生成3，3’-二甲基-2-羟基联苯，随产物浓度积累到一定程度，反应进行到24h后，产物3，3’-二甲基-2-羟基联苯上的羟基也被甲基化，生成新产物3，3’-二甲基-2-甲氧基联苯。这也进一步验证了该菌具有独特的“扩展4S途径”的特性。
实施例3：专一降解燃料油中的多种含硫杂环化合物
DBT是燃料油生物脱硫公认的模型化合物，但是除DBT外，油中的含硫杂环化合物还有很多，如4，6-DMDBT、TH、BTH和DPS。
1.生长细胞降解多种含硫杂环化合物反应：培养基中分别加入不同的含硫杂环化合物4，6-DMDBT、TH、BTH和DPS作为唯一硫源，浓度均为0.25mM。接入1g L-1休止细胞菌液，置于转速180rpm，温度30℃的摇床中反应，间隔时间取样，加入10％盐酸调pH≤2后，等量乙酸乙脂萃取，4800×g离心分离10分钟，萃取相用GC分析。
2.生长细胞降解多种含硫杂环化合物结果分析：如图6所示，在10小时之内，该菌能完全脱除TH，在50小时完全脱除BTH和4，6-DMDBT；相对脱除效果较差的DPS在50小时之内也能去除60％，90小时之内脱除80％。该菌株能完全去除4，6-DMDBT、TH、BTH，并脱除部分DPS中的硫，比其他菌株的脱硫范围更广，对燃料油脱硫来说具有无可比拟的优越性，因此将更具有工业应用前景。
实施例4：同时降解两种含硫杂环化合物
1.休止细胞同时降解两种含硫杂环化合物反应：水溶液反应体系中，休止细胞初始菌液浓度为25g1-1，同时加入DBT和4，6-DMDBT各0.25mM，总硫浓度为0.5mM，置于转速180rpm，温度30℃的摇床中反应，间隔时间取样，加入10％盐酸调pH≤2后，等量乙酸乙脂萃取，4800×g离心分离10分钟，萃取相用GC分析。
2.休止细胞同时降解两种含硫杂环化合物结果分析：如图7所示，随着脱硫反应的进行，反应体系中两种化合物的浓度同时降低，ZD-19对于混合硫化物反应8h后，0.25mM DBT和4，6-DMDBT的脱硫率分别为91.6％和53.2％，总硫脱除率为77％，说明当DBT和4，6-DMDBT两种含硫杂环化合物共同存在时，该菌株能同时将其降解，这一点对于实际油品脱硫是很重要的，有利于超低硫油品的生产。
Claims (5)
1.一种应用于燃料油中含硫杂环化合物脱硫的分支杆菌(Mycobacterium sp.)ZD-19菌种保藏号为：CGMCC NO.1817。
2.根据权利1所述的分支杆菌(Mycobacterium sp.)ZD-19，其特征在于：该菌属分支杆菌属，菌落形状呈圆形，直径1～2mm；细胞呈球状，0.5～1.0μm；无芽孢，无夹膜；革兰氏阳性菌株，好氧；能以含硫杂环化合物为唯一硫源。
3.根据权利要求1所述的分支杆菌(Mycobacterium sp.)ZD-19在对含硫杂环化合物的燃料油中进行专一性脱硫的应用，其特征在于：所述的含硫杂环化合物为二苯并噻吩、4，6-二甲基-二苯并噻吩、噻吩，苯并噻吩、二苯硫醚或其混合物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的含硫杂环化合物为二苯并噻吩和4，6-二甲基-二苯并噻吩的混合物。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：分支杆菌(Mycobacterium sp.)ZD-19降解二苯并噻吩、4，6-二甲基-二苯并噻吩遵循“扩展4S途径”，将羟基联苯甲氧基化，生成终产物为甲氧基联苯。
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| 蔡郁蓓;.新分离菌株对燃料油中有机硫的代谢途径及脱硫特性研究.浙江大学硕士学位论文.2006,全文,具体参见参见摘要第1-4段、第44页第(2)、(4)段. * |
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