CN1544581A - 利用固定化分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法 - Google Patents
利用固定化分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1544581A CN1544581A CNA2003101055376A CN200310105537A CN1544581A CN 1544581 A CN1544581 A CN 1544581A CN A2003101055376 A CNA2003101055376 A CN A2003101055376A CN 200310105537 A CN200310105537 A CN 200310105537A CN 1544581 A CN1544581 A CN 1544581A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gasoline
- mycobacterium
- cell
- gained
- mass percent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种利用固定化分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法,该方法包括(1)菌种选择,(2)斜面培养,(3)一级种子培养,(4)扩大培养,(5)发酵罐培养,(6)收集菌体,(7)固定化细胞,(8)处理样品,(9)分离样品,(10)样品检测等步骤;具有方法简便,温度要求宽泛(30-50℃),耗能低,脱硫率高等特点,在大气污染治理方面具有很大的应用前景。
Description
(一)技术领域
本发明涉及利用嗜热菌固定化细胞脱除化石燃料中有机硫的方法,具体地说涉及利用一株固定化的嗜热分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法。
(二)背景技术
化石燃料的燃烧,产生大量的有毒气体SO2进入大气,造成严重的空气污染,同时也是产生酸雨的主要原因。据联合国环境署数据表明,中国在1995年SO2排放量为34544.14千吨,占世界排放总量的1/4。为了保护环境,要求使用低硫含量的化石燃料。目前世界上低硫含量的化石燃料储备正在急剧减少,需要对含硫高的化石燃料进行脱硫处理。随着汽车排放控制新技术的发展和应用,以及对燃油质量的深入研究,国际上对燃料油的硫含量要求越来越严格。随着汽车工业的发展和环保要求日益严格,国产燃油质量问题越来越引起社会的关注。我国政府把控制汽车尾气排放分三个阶段,第一阶段从1999年到2003年,新车要达到欧1排放标准,第二阶段从2004年开始,新车要达到欧2排放标准,第三阶段2010年将和国际同步。1993年欧洲标准的汽油硫含量要求不大于0.1%,我国新标准规定不大于0.08%。因此要使我国燃油质量与国际接轨,还要做大量的工作。
化学脱硫方法—加氢脱硫(Hydrodesulfurization,HDS)通过催化过程,将有机硫转化成H2S气体,反应是在1~20Mpa的压力和290~450℃的温度下进行的。目前可以使用的进行汽油脱硫的技术,最主要的是就是加氢脱硫技术。使用加氢脱硫技术,可以将大多数汽油中的硫含量降低到30ng/μL以下。但是使用加氢脱硫处理汽油进行深度脱硫,往往会导致催化裂化汽油(Fluid catalytic cracking,FCC)中的石脑油中的烯烃饱和,从而显著降低汽油的辛烷值,同时加氢脱硫技术需要消耗大量的氢气,其副产品为H2S气体,对于环境又是再次的污染。
由于对化石燃料中的硫含量有严格规定,再加上HDS方法耗费比较高,而且难以脱去化石燃料中的有机硫,而生物催化法脱硫(Biodesufurization,BDS)成本低,在常温下即可进行,并且具有高专一性,因此发展一种化石燃料的生物脱硫方法已是十分必要。这使得BDS方法成为一种可供选择的方法,和HDS方法一起或者直接代替该方法进行石油的脱硫。
化石燃料中的有机硫主要是二苯并噻吩(Dibenzothiophene,DBT)、苯并噻吩(Benzothiophene,BTH)、噻吩(Thiophene,T)等,于是生物脱有机硫的研究也就以DBT,BTH和T为模式化合物进行。现在已经发现许多微生物,沿着烃降解途径(Hydrocarbon degradative pathway)降解DBT,在脱去有机硫的同时,往往也破坏碳-碳键,从而导致燃料热值减少而不可取。同时,也发现一些微生物如红球菌属(Rhodococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒杆菌属(Corynebacterium)和节杆菌属(Arthrobacter)等,能够沿着硫专一途径(Sulfur-specific pathway)降解DBT,它们不打开环,从而保留了燃料的热值,成为近年来研究的热点。最近几年,发现能够专一性降解BTH的菌株,主要包括戈登氏菌株(Gordonia sp.)213E,类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)A11-2,红球菌(Rhodococcus sp.)T09,中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)KT55以及红球菌KT462。这些菌株的BTH降解途径已分析较清楚(图1)。其中类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)A11-2,中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)KT55和红球菌(Rhodococcus sp.)KT462的BTH降解途径是:
苯并噻吩→苯并噻吩亚砜→苯并噻吩砜→2-(2’-羟苯基)乙醛→氧-羟基苯乙烯。
而戈登氏菌(Gordonia sp.)213E和红球菌(Rhodococcus sp.)T09菌株的BTH降解途径和上面的类似,只不过降解BTH的终产物不是氧-羟基苯乙烯,而是2-(2’-羟苯基)乙醛。
应用生长细胞或者休止细胞处理柴油,轻瓦斯油有一些报道,但是使用生物催化剂悬液进行燃油处理有一些局限性,如油相与催化剂所在的水相的比例低,生物催化剂重复利用困难。因此,使用固定化生物催化剂是一种很好的替代方法。使用固定化细胞有很多优点:从反应体系中容易分离获得生物催化剂,反应体系有相对较高的油相与水相比例,造成的污染可能性比较低。利用固定化生物催化剂处理轻瓦斯油已经有报道,但是利用生物催化剂脱除汽油中硫的专利和文献,至今未见报道。
由于大多石油化合物的处理是在高温高压下进行,那么把原料冷却下来再进行生物过程处理就不太经济,而且不利于后续处理。因此,围绕筛选一些较有价值的、可在较高温度下专一性地脱除DBT和其他噻吩类化合物中有机硫的菌株,并进一步应用固定化细胞于汽油脱硫的工作,也是目前本领域急需研究和解决的课题。
(三)发明内容
本发明的目的是针对上述不足,提供一种利用固定化的兼性嗜热分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法。
本发明的利用固定化分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法,其步骤顺序如下:
(1)菌种选择:选用分枝杆菌属古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)DSM 44492,〖该菌株保藏于德国典型微生物收藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH,Braunschweig,Germany)〗,草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)ATCC 11728〖该菌株保藏于美国典型微生物收藏中心(12301 Park Lawn Drive,Rockville,Md.20852)〗之一;
(2)斜面培养:将上述菌株接种于含有质量百分比为1.5~2.0%的琼脂糖并加有0.1~1.0mmol/L DBT的MAM固体斜面培养基上,30~50℃培养菌体20~26小时;
(3)一级种子培养:将步骤(2)培养的菌体,无菌条件下用接种环接1~4环于20~100mL含有0.1~1.0mmol/L DBT的MAM液体培养基中,30~50℃条件下,在摇床上振荡培养20~26小时,制得一级种子;
(4)扩大培养:以体积比为5%的接种量,接一级种子于300~1000mL含有0.1~1.0mmol/L DBT的MAM液体培养基中,30~50℃条件下,在摇床上振荡培养20~26小时,制得二级种子;
(5)发酵罐培养:以体积比为5%的接种量,接二级种子于1.8~8L含有0.1~1.0mmol/L DBT的MAM液体培养基中,30~50℃条件下,培养20~26小时;
(6)收集菌体:在5000g条件下离心5~8分钟,收集步骤(5)制得的菌体,并用生理盐水洗涤2~3次;之后用生理盐水悬浮并加入表面活性剂,使表面活性剂的质量百分比浓度为0.05~5%,得菌体细胞;
(7)溶解海藻酸钠:用生理盐水配制质量百分比浓度为0.5~3%的海藻酸钠溶液,配制时,剧烈搅拌或在60℃下水浴加热以保证充分溶解;
(8)向步骤(7)所得的海藻酸钠溶液中加入质量百分比为0.05~5%的表面活性剂;
(9)向步骤(8)所得的溶液中加入步骤(6)所得的菌体细胞,使菌体浓度达到10~30克干细胞/升;
(10)用生理盐水配制质量百分比浓度为0.5~5%的CaCl2溶液,并在所得的CaCl2溶液中加入质量百分比为0.05~5%的表面活性剂;
(11)将步骤(9)所得的菌体细胞悬浮液,以直径0.2~2mm的液滴滴入步骤(10)所得的溶液中;充分交联0.5~6小时,形成固定化细胞体系;
(12)处理样品:在100~1000毫升的反应体系中,以每升25~500克的量加入步骤(11)所得的固定化细胞,作为生物催化剂;加入水相和汽油,使水相和汽油的比例为3~10∶1,在30~45℃条件下,180转/分钟振荡16~28小时,进行样品处理;
(13)分离样品:以10,000g离心5~10分钟分离步骤(12)中处理后的样品,得到油相样品;
(14)样品检测:取1~5μL步骤(13)中的油相样品,进样,测定汽油中残留的硫含量,得出脱除率。
在上述利用固定化分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法中,步骤(1)中所述的菌种,选择古地分枝杆菌(Mycobac terium goodii)DSM 44492。
步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所述的菌体培养温度是37~45℃。
步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所述的菌体培养时间是20~24小时。
步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所述的DBT浓度为0.2~0.5mmol/L。
步骤(6)、(8)、(10)中所述的表面活性剂是指Tween20、Tween80、TritonX-114之一。
步骤(12)中所述的生物催化剂的加入量是每升100~400克固定化细胞。
步骤(12)中所述的汽油是直馏汽油、催化裂化汽油或调和汽油之一。
步骤(12)中所述的水相与汽油的比例为5~9∶1。
步骤(12)中处理样品的温度为37~45℃,样品振荡时间为20~24小时。
在上述利用固定化分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法中,菌株培养使用改良A培养基(Modification of A Medium,MAM),配方为:10克葡萄糖,0.5克KH2PO4,4克K2HPO4,1克NH4Cl,2mL质量百分比为1%的CaCl2,2mL质量百分比为10%的MgCl2·6H2O,200μL质量百分比为1%的FeCl3,200μL质量百分比为5%的NaCl,5mL质量百分比为1%的酵母膏,200μL的维生素混合液,5mL的金属离子混合液,加蒸馏水到1升。115℃条件下灭菌20分钟。金属离子混合液的配方为,每升蒸馏水含有:ZnCl2 0.5g;FeCl2 0.5g;MnCl2·4H2O 0.5g;Na2MoO4·2H2O 0.1g;CuCl2·2H2O 0.05g;Na2WO4·2H2O 0.05g;HCl 120mmol/L。维生素混合物的配方为,每升蒸馏水含有:400mg泛酸钙(Calcium pantothenate);200mg肌醇(Inositol);400mg尼克酸/烟酸(Niacin);400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride);200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid);0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。以0.5mmol/L的DBT或者二甲基亚砜作为硫源。
由于大多石油化合物的处理是在高温高压下进行,那么把原料冷却下来再进行生物过程处理就不太经济。本发明涉及的分枝杆菌,能够在45℃左右,生长、脱硫,达到了较高的脱除率。
经过碱洗处理之后的汽油,其中大部分含硫化合物如硫醇、硫醚都已经通过加氢处理除去,硫含量为175.4ng/μL,剩余的主要是难以处理的噻吩型含硫有机化合物。本发明采用固定化古地分枝杆菌细胞作为生物催化剂,能够有效地脱除汽油中的含硫有机化合物。在40℃条件下,使用固定化细胞将硫含量为175.4ng/μL的汽油中的硫,降低到54.2ng/μL,脱除率达到了69.1%,能够在脱硫后直接应用,完全达到了严格的环保要求。如图2所示,使用GC-AED(气相色谱—原子发射检测器)测定固定化细胞处理之前的汽油中的含硫化合物的分布,其中含有硫醇,烷烃代硫醇,硫醚,噻吩,烷烃代噻吩,苯并噻吩等含硫化合物,其总硫含量使用WK-2D微机综合动态微库仑分析仪(江苏电分析仪器厂)进行分析测定为175.4ng/μL。图3所示的是经过固定化细胞处理之后,汽油中的含硫化合物的分布情况,此时总硫含量为54.2ng/μL。经过图2,图3比较,可以明显看出经过固定化细胞处理之后,汽油中的大部分含硫化合物,如硫醇类,噻吩类都基本脱除,起到了很好的脱硫效果。使用GC-FID(气相色谱—氢火焰检测器)检测了固定化细胞处理前后汽油中的烃类物质变化,结果表明,固定化细胞处理没有对汽油烃类造成任何影响(图4)。
进一步使用硫含量为204.1ng/μL的汽油为样品,进行固定化细胞处理。增大反应体积至500mL,24小时后,汽油有机硫含量为151.4ng/μL,脱除率为25.8%;48小时后汽油的硫含量为98.7ng/μL,脱除率为51.6%。此时更换新鲜的固定化细胞进行第二遍处理,处理后的硫含量为39.8ng/μL,脱除率为80.5%。同时还试验了固定化细胞的重复利用情况,结果表明,处理过一次的固定化细胞,进行再次汽油脱硫,活力为第一次的80%左右。
根据文献和专利检索,目前还没有关于汽油的生物脱硫的报道和相关的专利。
(四)附图说明
图1推断的BTH降解途径。A是苯并噻吩,B是苯并噻吩亚砜,C,D是苯并噻吩砜,E是苯并氧硫己二烯砜,F是氧-羟基苯乙烯。
图2进行固定化细胞处理之前,使用GC-AED检测汽油中的含硫化合物的分布情况。图中T代表噻吩,BT代表苯并噻吩。
图3进行固定化细胞处理之后,使用GC-AED检测汽油中的含硫化合物的分布情况。图中T代表噻吩。
图4使用GC-FID检测固定化细胞处理前后,汽油中的烃类物质的变化。其中图A是处理之前的汽油烃类的色谱图,图B是处理之后的汽油烃类的色谱图。
(五)具体实施方式
实施例1:利用固定化分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法,其中加入的水相与汽油的比例为5∶1,处理温度为37℃
(1)菌种选择:选用分枝杆菌中古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)DSM 44492;
(2)斜面培养:将上述菌株接种于含有质量百分比为1.8%的琼脂糖并加有0.5mmol/L DBT的MAM固体斜面培养基上,37℃培养菌体20小时;
(3)一级种子培养:将步骤(2)培养的菌体,无菌条件下用接种环接2环于50mL含有0.5mmol/L DBT的MAM液体培养基中(使用300mL三角摇瓶),37℃条件下,在摇床上振荡培养20小时,制得一级种子;
(4)扩大培养:以体积比为5%的接种量,接一级种子于300mL含有0.5mmol/L DBT的MAM液体培养基中(使用1L三角摇瓶),37℃条件下,在摇床上振荡培养20小时,制得二级种子;
(5)发酵罐培养:以体积比为5%的接种量,接二级种子于1.8L含有0.5mmol/LDBT的MAM液体培养基中(使用2L德国贝朗全自动发酵罐),37℃条件下,培养20小时;
(6)收集菌体:在5000g条件下离心5分钟,收集步骤(5)制得的菌体,并用生理盐水洗涤2次;之后所得细胞用生理盐水悬浮后加入表面活性剂Tween80,使表面活性剂的质量百分比浓度为0.3%,得到菌体细胞;
(7)溶解海藻酸钠:用生理盐水配制质量百分比浓度为1%的海藻酸钠溶液,配制时,剧烈搅拌或在60℃下水浴加热以保证充分溶解;
(8)向步骤(7)所得的海藻酸钠溶液中加入质量百分比为0.3%的表面活性剂Tween80;
(9)向步骤(8)所得的溶液中加入步骤(6)所得的菌体细胞,使菌体浓度达到13克干细胞/升;
(10)用生理盐水配制质量百分比浓度为5%的CaCl2溶液,并在所得的CaCl2溶液中加入质量百分比为0.3%的表面活性剂Tween80;
(11)将步骤(9)所得的菌体细胞悬浮液以直径1mm的液滴滴入步骤(10)所得的溶液中;充分交联4小时形成固定化细胞体系生物催化剂;
(12)处理样品:在120mL体系中加入30g步骤(11)所得的生物催化剂,以5∶1的水相与汽油的比例(Water-to-oil ratio,WOR),加入20mL含有181ng/μL的硫的汽油,在37℃条件下,180转/分钟振荡24小时;
(13)分离样品:以10,000g离心5分钟分离步骤(12)中处理的样品,得到油相样品;
(14)样品检测:待步骤(13)中的样品分离完之后,取3μL样品进样(WK-2D微机综合动态微库仑分析仪,江苏电分析仪器厂),测定汽油中残留的硫含量,得出脱除率为39%。
菌株使用改良A培养基(Modification of A Medium,MAM),配方为:10克葡萄糖,0.5克KH2PO4,4克K2HPO4,1克NH4Cl,2mL质量百分比为1%的CaCl2,2mL质量百分比为10%的MgCl2·6H2O,200μL质量百分比为1%的FeCl3,200μL质量百分比为5%的NaCl,5mL质量百分比为1%的酵母膏,200μL的维生素混合液,5mL的金属离子混合液,加蒸馏水到1升。115℃条件下灭菌20分钟。金属离子混合液的配方为,每升蒸馏水含有:ZnCl2 0.5g;FeCl2 0.5g;MnCl2·4H2O 0.5g;Na2MoO4·2H2O 0.1g;CuCl2·2H2O 0.05g;Na2WO4·2H2O 0.05g;HCl 120mmol/L。维生素混合物的配方为,每升蒸馏水含有:400mg泛酸钙(Calcium pantothenate);200mg肌醇(Inositol);400mg尼克酸/烟酸(Niacin);400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride);200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid);0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。以0.5mmol/L的DBT或者二甲基亚砜作为硫源。
实施例2:利用固定化分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法,其中加入的水相与汽油的比例为9∶1,处理温度为45℃
(1)菌种选择:选用分枝杆菌中古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)DSM 44492;
(2)斜面培养:将上述菌株接种于含有质量百分比为1.8%的琼脂糖并加有0.5mmol/L DBT的MAM固体斜面培养基上,45℃培养菌体24小时;
(3)一级种子培养:将步骤(2)培养的菌体,无菌条件下用接种环接2环于50mL含有0.2mmol/L DBT的MAM液体培养基中(使用300mL三角摇瓶),45℃条件下,在摇床上振荡培养24小时,制得一级种子;
(4)扩大培养:以体积比为5%的接种量,接一级种子于300mL含有0.2mmol/L DBT的MAM液体培养基中(使用1L三角摇瓶),45℃条件下,在摇床上振荡培养24小时,制得二级种子;
(5)发酵罐培养:以体积比为5%的接种量,接二级种子于1.8L含有0.2mmol/LDBT的MAM液体培养基中(使用2L德国贝朗全自动发酵罐),45℃条件下,培养24小时;
(6)收集菌体:在5000g条件下离心5分钟,收集步骤(5)制得的菌体,并用生理盐水洗涤2次;之后所得细胞用生理盐水悬浮后加入表面活性剂Tween80,使表面活性剂的质量百分比浓度为0.3%,得到菌体细胞;
(7)溶解海藻酸钠:用生理盐水配制质量百分比浓度为2%的海藻酸钠溶液,配置时,剧烈搅拌或在60℃下水浴加热以保证充分溶解;
(8)向步骤(7)所得的海藻酸钠溶液中加入质量百分比为0.3%的表面活性剂Tween80;
(9)向步骤(8)所得的溶液中加入步骤(6)所得的菌体细胞,使菌体浓度达到13克干细胞/升;
(10)用生理盐水配制质量百分比浓度为5%的CaCl2溶液,并在所得的CaCl2溶液中加入质量百分比为0.3%的表面活性剂Tween80;
(11)将步骤(9)所得的菌体细胞悬浮液以直径1mm的液滴滴入步骤(10)所得的溶液中;充分交联4小时形成固定化细胞体系生物催化剂;
(12)处理样品:在100mL体系中加入50g步骤(11)所得的生物催化剂,以9∶1的水相与汽油的比例(Water-to-oil ratio,WOR),加入10mL含有175ng/μL的硫的汽油,在45℃条件下,180转/分钟振荡24小时;
(13)分离样品:以10,000g离心5分钟分离步骤(12)中处理的样品,得到油相样品;
(14)样品检测:待步骤(13)中的样品分离完之后,取3μL样品进样(WK-2D微机综合动态微库仑分析仪,江苏电分析仪器厂),测定汽油中残留的硫含量,得出脱除率为69%。
菌株使用改良A培养基(Modification of A Medium,MAM),配方为:10克葡萄糖,0.5克KH2PO4,4克K2HPO4,1克NH4Cl,2mL质量百分比为1%的CaCl2,2mL质量百分比为10%的MgCl2·6H2O,200μL质量百分比为1%的FeCl3,200μL质量百分比为5%的NaCl,5mL质量百分比为1%的酵母膏,200μL的维生素混合液,5mL的金属离子混合液,加蒸馏水到1升。115℃条件下灭菌20分钟。金属离子混合液的配方为,每升蒸馏水含有:ZnCl2 0.5g;FeCl2 0.5g;MnCl2·4H2O 0.5g;Na2MoO4·2H2O 0.1g;CuCl2·2H2O 0.05g;Na2WO4·2H2O 0.05g;HCl 120mmol/L。维生素混合物的配方为,每升蒸馏水含有:400mg泛酸钙(Calcium pantothenate);200mg肌醇(Inositol);400mg尼克酸/烟酸(Niacin);400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride);200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid);0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。以0.5mmol/L的DBT或者二甲基亚砜作为硫源。
实施例3:利用固定化分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法,总反应体系为500ml,反应时间为24小时,其中加入的水相与汽油的比例为6∶1,处理温度为43℃
(1)菌种选择:选用分枝杆菌中古地草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)ATC℃11728;
(2)斜面培养:将上述菌株接种于含有质量百分比为1.8%的琼脂糖并加有0.5mmol/L DBT的MAM固体斜面培养基上,45℃培养菌体24小时;
(3)一级种子培养:将步骤(2)培养的菌体,无菌条件下用接种环接2环于50mL含有0.3mmol/L DBT的MAM液体培养基中(使用300mL三角摇瓶),45℃条件下,在摇床上振荡培养24小时,制得一级种子;
(4)扩大培养:以体积比为5%的接种量,接一级种子于300mL含有0.3mmol/L DBT的MAM液体培养基中(使用1L三角摇瓶),45℃条件下,在摇床上振荡培养24小时,制得二级种子;
(5)发酵罐培养:以体积比为5%的接种量,接二级种子于1.8L含有0.3mmol/LDBT的MAM液体培养基中(使用2L德国贝朗全自动发酵罐),45℃条件下,培养24小时;
(6)收集菌体:在5000g条件下离心5分钟,收集步骤(5)制得的菌体,并用生理盐水洗涤2次;之后所得细胞用生理盐水悬浮后加入表面活性剂Tween20,使表面活性剂的质量百分比浓度为0.3%,得到菌体细胞;
(7)溶解海藻酸钠:用生理盐水配制质量百分比浓度为2%的海藻酸钠溶液,配置时,剧烈搅拌或在60℃下水浴加热以保证充分溶解;
(8)向步骤(7)所得的海藻酸钠溶液中加入质量百分比为0.3%的表面活性剂Tween20;
(9)向步骤(8)所得的溶液中加入步骤(6)所得的菌体细胞,使菌体浓度达到13克干细胞/升;
(10)用生理盐水配制质量百分比浓度为5%的CaCl2溶液,并在所得的CaCl2溶液中加入质量百分比为0.3%的表面活性剂Tween20;
(11)将步骤(9)所得的菌体细胞悬浮液以直径1mm的液滴滴入步骤(10)所得的溶液中;充分交联4小时形成固定化细胞体系生物催化剂;
(12)处理样品:在500mL体系中加入250g步骤(11)所得的生物催化剂,以6∶1的水相与汽油的比例(Water-to-oil ratio,WOR),加入72mL含有204ng/μL的硫的汽油,在43℃条件下,180转/分钟振荡24小时;
(13)分离样品:以10,000g离心5分钟分离步骤(12)中处理的样品,得到油相样品;
(14)样品检测:待步骤(13)中的样品分离完之后,取3μL样品进样(WK-2D微机综合动态微库仑分析仪,江苏电分析仪器厂),测定汽油中残留的硫含量,得出脱除率为25.8%。
菌株使用改良A培养基(Modification of A Medium,MAM),配方为:10克葡萄糖,0.5克KH2PO4,4克K2HPO4,1克NH4Cl,2mL质量百分比为1%的CaCl2,2mL质量百分比为10%的MgCl2·6H2O,200μL质量百分比为1%的FeCl3,200μL质量百分比为5%的NaCl,5mL质量百分比为1%的酵母膏,200μL的维生素混合液,5mL的金属离子混合液,加蒸馏水到1升。115℃条件下灭菌20分钟。金属离子混合液的配方为,每升蒸馏水含有:ZnCl2 0.5g;FeCl2 0.5g;MnCl2·4H2O 0.5g;Na2MoO4·2H2O 0.1g;CuCl2·2H2O 0.05g;Na2WO4·2H2O 0.05g;HCl 120mmol/L。维生素混合物的配方为,每升蒸馏水含有:400mg泛酸钙(Calcium pantothenate);200mg肌醇(Inositol);400mg尼克酸/烟酸(Niacin);400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride);200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid);0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。以0.5mmol/L的DBT或者二甲基亚砜作为硫源。
实施例4:利用固定化分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法,总反应体系为500ml,反应时间为48小时,其中加入的水相与汽油的比例为6∶1,处理温度为43℃
(1)菌种选择:选用分枝杆菌中古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)DSM 44492;
(2)斜面培养:将上述菌株接种于含有质量百分比为1.8%的琼脂糖并加有0.5mmol/L DBT的MAM固体斜面培养基上,45℃培养菌体24小时;
(3)一级种子培养:将步骤(2)培养的菌体,无菌条件下用接种环接2环于50mL含有0.5mmol/L DBT的MAM液体培养基中(使用300mL三角摇瓶),45℃条件下,在摇床上振荡培养24小时,制得一级种子;
(4)扩大培养:以体积比为5%的接种量,接一级种子于300mL含有0.5mmol/L DBT的MAM液体培养基中(使用1L三角摇瓶),45℃条件下,在摇床上振荡培养24小时,制得二级种子;
(5)发酵罐培养:以体积比为5%的接种量,接二级种子于1.8L含有0.5mmol/LDBT的MAM液体培养基中(使用2L德国贝朗全自动发酵罐),45℃条件下,培养24小时;
(6)收集菌体:在5000g条件下离心5分钟,收集步骤(5)制得的菌体,并用生理盐水洗涤2次;之后所得细胞用生理盐水悬浮后加入表面活性剂Triton X-114,使表面活性剂的质量百分比浓度为0.3%,得到菌体细胞;
(7)溶解海藻酸钠:用生理盐水配制质量百分比浓度为2%的海藻酸钠溶液,配制时,剧烈搅拌或在60℃下水浴加热以保证充分溶解;
(8)向步骤(7)所得的海藻酸钠溶液中加入质量百分比为0.3%的表面活性剂TritonX-114;
(9)向步骤(8)所得的溶液中加入步骤(6)所得的菌体细胞,使菌体浓度达到13克干细胞/升;
(10)用生理盐水配制质量百分比浓度为5%的CaCl2溶液,并在所得的CaCl2溶液中加入质量百分比为0.3%的表面活性剂Triton X-114;
(11)将步骤(9)所得的菌体细胞悬浮液以直径1mm的液滴滴入步骤(10)所得的溶液中;充分交联4小时形成固定化细胞体系生物催化剂;
(12)处理样品:在500mL体系中加入180g步骤(11)所得的生物催化剂,以6∶1的水相与汽油的比例(Water-to-oil ratio,WOR),加入72mL含有204ng/μL的硫的汽油,在43℃条件下,180转/分钟振荡48小时;
(13)分离样品:以10,000g离心5分钟分离步骤(12)中处理的样品,得到油相样品;
(14)样品检测:待步骤(13)中的样品分离完之后,取3μL样品进样(WK-2D微机综合动态微库仑分析仪,江苏电分析仪器厂),测定汽油中残留的硫含量,得出脱除率为51.6%。
菌株使用改良A培养基(Modification of A Medium,MAM),配方为:10克葡萄糖,0.5克KH2PO4,4克K2HPO4,1克NH4Cl,2mL质量百分比为1%的CaCl2,2mL质量百分比为10%的MgCl2·6H2O,200μL质量百分比为1%的FeCl3,200μL质量百分比为5%的NaCl,5mL质量百分比为1%的酵母膏,200μL的维生素混合液,5mL的金属离子混合液,加蒸馏水到1升。115℃条件下灭菌20分钟。金属离子混合液的配方为,每升蒸馏水含有:ZnCl2 0.5g;FeCl2 0.5g;MnCl2·4H2O 0.5g;Na2MoO4·2H2O 0.1g;CuCl2·2H2O 0.05g;Na2WO4·2H2O 0.05g;HCl 120mmol/L。维生素混合物的配方为,每升蒸馏水含有:400mg泛酸钙(Calcium pantothenate);200mg肌醇(Inositol);400mg尼克酸/烟酸(Niacin);400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride);200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid);0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。以0.5mmol/L的DBT或者二甲基亚砜作为硫源。
实施例5:利用固定化分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法,同一批油样使用固定化细胞进行两次处理
(1)菌种选择:选用分枝杆菌中古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)DSM 44492;
(2)斜面培养:将上述菌株接种于含有质量百分比为1.8%的琼脂糖并加有0.5mmol/LDBT的MAM固体斜面培养基上,45℃培养菌体24小时;
(3)一级种子培养:将步骤(2)培养的菌体,无菌条件下用接种环接2环于50mL含有0.5mmol/L DBT的MAM液体培养基中(使用300mL三角摇瓶),45℃条件下,在摇床上振荡培养24小时,制得一级种子;
(4)扩大培养:以体积比为5%的接种量,接一级种子于300mL含有0.5mmol/L DBT的MAM液体培养基中(使用1L三角摇瓶),45℃条件下,在摇床上振荡培养24小时,制得二级种子;
(5)发酵罐培养:以体积比为5%的接种量,接二级种子于1.8L含有0.5mmol/LDBT的MAM液体培养基中(使用2L德国贝朗全自动发酵罐),45℃条件下,培养24小时;
(6)收集菌体:在5000g条件下离心5分钟,收集步骤(5)制得的菌体,并用生理盐水洗涤2次;之后所得细胞用生理盐水悬浮后加入表面活性剂Tween80,使表面活性剂的质量百分比浓度为0.3%,得到菌体细胞;
(7)溶解海藻酸钠:用生理盐水配制质量百分比浓度为2%的海藻酸钠溶液,配制时,剧烈搅拌或在60℃下水浴加热以保证充分溶解;
(8)向步骤(7)所得的海藻酸钠溶液中加入质量百分比为0.3%的表面活性剂Tween80;
(9)向步骤(8)所得的溶液中加入步骤(6)所得的菌体细胞,使菌体浓度达到13克干细胞/升;
(10)用生理盐水配制质量百分比浓度为5%的CaCl2溶液,并在所得的CaCl2溶液中加入质量百分比为0.3%的表面活性剂Tween80;
(11)将步骤(9)所得的菌体细胞悬浮液以直径1mm的液滴滴入步骤(10)所得的溶液中;充分交联4小时形成固定化细胞体系生物催化剂;
(12)处理样品:在140mL体系中加入50g步骤(11)所得的生物催化剂,以6∶1的水相与汽油的比例(Water-to-oil ratio,WOR),加入20mL含有204ng/μL的硫的汽油,在43℃条件下,180转/分钟振荡24小时;
(13)以10,000g离心5分钟分离步骤(12)中处理的样品,得到油相样品;
(14)在140mL体系中加入50g步骤(11)所得的生物催化剂,以6∶1的水相与汽油的比例(Water-to-oil ratio,WOR),加入步骤(13)所得的油相在43℃条件下,180转/分钟振荡24小时;
(15)分离样品:以10,000g离心5分钟分离步骤(12)中处理的样品,得到油相样品;
(16)样品检测:待步骤(15)中的样品分离完之后,取3μL样品进样(WK-2D微机综合动态微库仑分析仪,江苏电分析仪器厂),测定汽油中残留的硫含量,得出脱除率为80.5%。
菌株使用改良A培养基(Modification of A Medium,MAM),配方为:10克葡萄糖,0.5克KH2PO4,4克K2HPO4,1克NH4Cl,2mL质量百分比为1%的CaCl2,2mL质量百分比为10%的MgCl2·6H2O,200μL质量百分比为1%的FeCl3,200μL质量百分比为5%的NaCl,5mL质量百分比为1%的酵母膏,200μL的维生素混合液,5mL的金属离子混合液,加蒸馏水到1升。115℃条件下灭菌20分钟。金属离子混合液的配方为,每升蒸馏水含有:ZnCl2 0.5g;FeCl2 0.5g;MnCl2·4H2O 0.5g;Na2MoO4·2H2O 0.1g;CuCl2·2H2O 0.05g;Na2WO4·2H2O 0.05g;HCl 120mmol/L。维生素混合物的配方为,每升蒸馏水含有:400mg泛酸钙(Calcium pantothenate);200mg肌醇(Inositol);400mg尼克酸/烟酸(Niacin);400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride);200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid);0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。以0.5mmol/L的DBT或者二甲基亚砜作为硫源。
Claims (10)
1.一种利用固定化分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法,其步骤顺序如下:
(1)菌种选择:选用分枝杆菌中古的分枝杆菌(Mycobacterium goodii)DSM 44492,草分枝杆菌(Mycobac terium phlei)ATCC 11728之一;
(2)斜面培养:将上述菌株接种于含有质量百分比为1.5~2.0%的琼脂糖并加有0.1~1.0mmol/L DBT的MAM固体斜面培养基上,30~50℃培养菌体20~26小时;
(3)一级种子培养:将步骤(2)培养的菌体,无菌条件下用接种环接1~4环于20~100mL含有0.1~1.0mmol/LDBT的MAM液体培养基中,30~50℃条件下,在摇床上振荡培养20~26小时,制得一级种子;
(4)扩大培养:以体积比为5%的接种量,接一级种子于300~1000mL含有0.1~1.0mmol/LDBT的MAM液体培养基中,30~50℃条件下,在摇床上振荡培养20~26小时,制得二级种子;
(5)发酵罐培养:以体积比为5%的接种量,接二级种子于1.8~8L含有0.1~1.0mmol/L DBT的MAM液体培养基中,30~50℃条件下,培养20~26小时;
(6)收集菌体:在5000g条件下离心5~8分钟,收集步骤(5)制得的菌体,并用生理盐水洗涤2~3次;之后用生理盐水悬浮并加入表面活性剂,使表面活性剂的质量百分比浓度为0.05~5%,得菌体细胞;
(7)溶解海藻酸钠:用生理盐水配制质量百分比浓度为0.5~3%的海藻酸钠溶液,配制时,剧烈搅拌或在60℃下水浴加热以保证充分溶解;
(8)向步骤(7)所得的海藻酸钠溶液中加入质量百分比为0.05~5%的表面活性剂;
(9)向步骤(8)所得的溶液中加入步骤(6)所得的菌体细胞,使菌体浓度达到10~30克干细胞/升;
(10)用生理盐水配制质量百分比浓度为0.5~5%的CaCl2溶液,并在所得的CaCl2溶液中加入质量百分比为0.05~5%的表面活性剂;
(11)将步骤(9)所得的菌体细胞悬浮液,以直径0.2~2mm的液滴滴入步骤(10)所得的溶液中;充分交联0.5~6小时,形成固定化细胞体系;
(12)处理样品:在100~1000毫升的反应体系中,以每升25~500克的量加入步骤(11)所得的固定化细胞,作为生物催化剂;加入水相和汽油,使水相和汽油的比例为3~10∶1,在30~45℃条件下,180转/分钟振荡16~28小时,进行样品处理;
(13)分离样品:以10,000g离心5~10分钟分离步骤(12)中处理后的样品,得到油相样品;
(14)样品检测:取1~5μL步骤(13)中的油相样品,使用WK-2D微机综合动态微库仑分析仪(江苏电分析仪器厂)进行检测,测定汽油中残留的硫含量,得出脱除率。
2.如权利要求1所述的利用固定化分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法,其特征在于,步骤(1)中所述的菌种,选择古的分枝杆菌(Mycobacteriumgoodii)DSM 44492。
3.如权利要求1所述的利用固定化分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法,其特征在于,步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所述的菌体培养温度是37~45℃。
4.如权利要求1所述的利用固定化分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法,其特征在于,步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所述的菌体培养时间是20~24小时。
5.如权利要求1所述的利用固定化分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法,其特征在于,步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所述的DBT浓度为0.2~0.5mmol/L。
6.如权利要求1所述的利用固定化分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法,其特征在于,步骤(6)、(8)、(10)中所述的表面活性剂是指Tween20、Tween80、Triton X-114之一。
7.如权利要求1所述的利用固定化分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法,其特征在于,步骤(12)中所述的生物催化剂的加入量是每升100~400克固定化细胞。
8.如权利要求1所述的利用固定化分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法,其特征在于,步骤(12)中所述的汽油是直馏汽油、催化裂化汽油和调和汽油之一。
9.如权利要求1所述的利用固定化分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法,其特征在于,步骤(12)中所述的水相与汽油的比例为5~9∶1。
10.如权利要求1所述的利用固定化分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法,其特征在于,步骤(12)中处理样品的温度为37~45℃,样品振荡时间为20~24小时。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNA2003101055376A CN1544581A (zh) | 2003-11-24 | 2003-11-24 | 利用固定化分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNA2003101055376A CN1544581A (zh) | 2003-11-24 | 2003-11-24 | 利用固定化分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1544581A true CN1544581A (zh) | 2004-11-10 |
Family
ID=34333791
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNA2003101055376A Pending CN1544581A (zh) | 2003-11-24 | 2003-11-24 | 利用固定化分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1544581A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101240252B (zh) * | 2007-02-09 | 2010-08-18 | 中国石油化工股份有限公司 | 一株用于脱硫的放射形土壤杆菌及应用 |
CN101134944B (zh) * | 2007-04-20 | 2012-06-06 | 浙江大学 | 一种应用于燃料油中含硫杂环化合物脱硫的分枝杆菌及其用途 |
-
2003
- 2003-11-24 CN CNA2003101055376A patent/CN1544581A/zh active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101240252B (zh) * | 2007-02-09 | 2010-08-18 | 中国石油化工股份有限公司 | 一株用于脱硫的放射形土壤杆菌及应用 |
CN101134944B (zh) * | 2007-04-20 | 2012-06-06 | 浙江大学 | 一种应用于燃料油中含硫杂环化合物脱硫的分枝杆菌及其用途 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1082094A (zh) | 有机硫分子的生物催化脱硫 | |
US5387523A (en) | Multistage process for deep desulfurization of fossil fuels | |
US5510265A (en) | Multistage process for deep desulfurization of a fossil fuel | |
CN1854290A (zh) | 一株用于生物脱硫的红串红球菌及应用 | |
CN1766089A (zh) | 一株红平红球菌及其在原油脱硫中的应用 | |
CN1062765A (zh) | 用于降低石油粘度的微生物法 | |
CN1699547A (zh) | 一株土生戈登氏新菌株及其脱硫作用 | |
CN1544581A (zh) | 利用固定化分枝杆菌细胞脱除汽油中有机硫的方法 | |
CN1580241A (zh) | 一株降解石油的细菌及其应用 | |
CN1379084A (zh) | 利用分枝杆菌深度脱除化石燃料中有机硫的方法 | |
CN1132933C (zh) | 短芽孢杆菌菌株及其在脱除含硫有机化合物中硫的应用 | |
CN1057796C (zh) | 合成反式-羟基砜的生物转化方法 | |
CN1566327A (zh) | 提高石油采收率的降粘菌及应用 | |
CN100370020C (zh) | 一株基因重组的红平红球菌及其在脱除原油有害物-硫和氮中的应用 | |
CN1219878C (zh) | 戈登氏菌及其在脱除含硫化合物中硫元素的应用 | |
CN1197958C (zh) | 小球诺卡氏菌菌株及其在脱除化石燃料中有机硫的应用 | |
Guobin et al. | Deep desulfurization of hydrodesulfurized diesel oil by Pseudomonas delafieldii R‐8 | |
CN1119413C (zh) | 节杆菌及其在矿物燃料脱硫中的应用 | |
CN1609189A (zh) | 一种枯草芽孢杆菌及应用 | |
CN1132934C (zh) | 德氏假单胞菌菌株及其在脱除含硫有机化合物中硫的应用 | |
CN1644678A (zh) | 一株可高效降解噻吩硫的古地分枝杆菌 | |
CN1699553A (zh) | 可耐受硫酸盐的红串红球菌及其应用 | |
CN100344752C (zh) | 一种根癌土壤杆菌菌株的制备及其在对含硫有机化合物脱硫中的应用 | |
WO2011132511A1 (ja) | 新規微生物並びにそれを用いた水素製造方法、1,3-プロパンジオール製造方法及びバイオディーゼル廃液の処理方法 | |
Al-Jailawi et al. | Isolation and identification of dibenzothiophene biodesulfurizing bacteria |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |