CN1057796C - 合成反式-羟基砜的生物转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了合成反式-羟基砜中间体的新的微生物转化方法，上述中间体是局部碳酸酐酶抑制剂(TCAI)的前体。TCAI对治疗青光眼和眼高压症有效。该生物转化方法是在微生物深红酵母或piliminae红酵母存在下进行的，并且生成显示出非对映异构体过量值大于95%的反式-羟基砜。

Description

合成反式-羟基砜的生物转化方法
发明背景
青光眼是与眼内压升高以致功能异常有关的眼疾，可引起不可逆的视力丧失。若不治疗，青光眼甚至可导致失明。现在许多眼科医生相信，眼高压症，即无视觉神经损伤或以青光眼性视野缺陷为特征的眼内压高的病症是青光眼的最早表现。
通式I的化合物：
Figure C9519614500051
它们的各个非对映异构体，各个对映异构体或它们的混合物，或眼科可以接受的它们的盐，为美国专利4,797,413和5,157,129中的已知化合物。
其中：A为碳或氮；
Z为NHR或-OR；
R为C1-6直链或支链烷基；
R1为
a)C1-5直链或支链烷基，尤其为正丙基或异丁基；
b)C3-5烯基，尤其为烯丙基；
c)C3-5炔基，尤其为炔丙基；
d)氢；或
e)C1-4烷氧基-C1-4烷基；以及
X为-SO2-或-C(O)-；
这些化合物已知是用于眼高压症局部治疗的有效的碳酸酐酶抑制剂(TCAI’s)。这些化合物的合成包括将砜-酮还原成上面提到的化合物的前体反式羟基砜。不过制备它们的合成方法却生成非对映异构体或外消旋产物，因而必须分离或拆分，要得到最活泼的对映异构体同时就要至少损失50％产品。
本发明提供一种新的微生物方法，将砜-酮中间体生物转化为反式-羟基砜中间体。
发明概述
本发明涉及使用新的微生物转化方法合成具有下面的结构式的反式-羟基砜：
Figure C9519614500061
其中A和R1的定义同上。该反式-羟基砜是目标物、即上面通式I的碳酸酐酶抑制剂的前体。这些目标物对于眼高压症和青光眼的局部治疗有效。该方法包括将砜-酮底物在微生物深红酵母(ATCC74283)或piliminae红酵母(ATCC32762)存在下发酵，最好在染红酵母存在下发酵。生物转化在需氧条件下完成，以含有氮营养素的碳水化合物水溶液作为发酵介质，介质的pH为4.5至8.0，最好为6.0，生物转化的时间应充分以便生成结构式为通式II的化合物。
生成的反式-羟基砜类似物显示的非对映异构体过量值在95％以上。该新方法中的关键步骤(即控制羟基砜的非对映异构体过量)是控制生物转化反应介质中的残留砜-酮浓度。
这样，本发明的目标是提供合成反式-羟基砜中间体的微生物方法。
本发明的详细描述
本发明涉及合成下面结构式的化合物：
反式-羟基砜-II
其中A为碳或氮，R1为
a)C1-5的直链或支链烷基，尤其是正丙基或异丁基；
b)C3-5烯基，尤其是烯丙基；
c)C3-5炔基，尤其是炔丙基；
d)氢；或
e)C1-4烷氧基-C1-4烷基，
它们是下面通式I化合物，各非对映异构体，各对映异构体或它们的混合物，或眼科可以接受的它们的盐的前体，
Figure C9519614500071
其中：
A为碳或氮；
Z为NHR或-OR；
R为C1-6直链或支链烷基；
R1为
a)C1-5直链或支链烷基，尤其是正丙基或异丁基；
b)C3-5烯基，尤其是烯丙基；
c)C3-5炔基，尤其是炔丙基；
d)氢；或
e)C1-4烷氧基-C1-4烷基；以及
X为-SO2-或-C(O)-；
本发明的新方法包括在底物化合物III的存在下用微生物piliminae红酵母或深红酵母进行发酵，最好用深红酵母进行发酵：
Figure C9519614500081
                    砜-酮-III
其中R2为
a)C1-5直链或支链烷基，尤其是正丙基或异丁基；
b)C3-5烯基，尤其是烯丙基；
c)C3-5炔基，尤其是炔丙基；
d)氢；或
e)C1-4烷氧基-C1-4烷基
发酵在营养素的介质中在需氧条件下进行，直至有显著量的化合物II生成，使用常规方法分离生成的化合物。结构式I的化合物用于治疗青光眼。
本发明的优选的实施方案包括在含有可吸收的氮源和碳源及底物化合物III的营养素介质中培养微生物深红酵母，ATCC74283，其中通式II的化合物是通式I化合物，它的各个非对映异构体、各个对映异构体或它们的混合物，或眼科可以接受的它们的盐的前体，在通式II中，
Figure C9519614500082
A为碳或氮，R1为
a)C1-5直链或支链烷基，尤其是正丙基或异丁基；
b)C3-5烯基，尤其是烯丙基；
c)C3-5炔基，尤其是炔丙基；
d)氢；或
e)C1-4烷氧基-C1-4烷基
Figure C9519614500091
在通式I中：
A为碳或氮；
Z为NHR或-OR；
R为C1-6直链或支链烷基；
R1为
a)C1-5直链或支链烷基，尤其是正丙基或异丁基；
b)C3-5烯基，尤其是烯丙基；
c)C3-5炔基，尤其是炔丙基；
d)氢；或
e)C1-4烷氧基-C1-4烷基；以及
X为-SO2-或-C(O)-；
在通式III中，R2为
a)C1-5直链或支链烷基，尤其是正丙基或异丁基；
b)C3-5烯基，尤其是烯丙基；
c)C3-5炔基，尤其是炔丙基；
d)氢；或
e)C1-4烷氧基-C1-4烷基，
培养在需氧条件下进行，直至生成显著量的化合物II，分离生成的化合物II，培养时将底物溶在以体积百分数大约1％至15％乙醇、甲醇或DMSO中，底物的含量为大约1g/L至3g/L，培养温度为大约20℃至50℃，pH为大约4.5至80。
底物化合物III可以按照以下的非限制性方法制备：
3(R)-羟基己酸甲酯
3-酮己酸甲酯(44.7g，310mmol)用甲醇(75mL)和0.2N HCl(2mL)稀释。加入Et2NH2 +Ru2Cl5(BINAP)2(200mg)，反应混合物在100磅/平方英寸的氢气压下于60℃加热2小时。加入甲苯(100mL)，将混合物浓缩，得75g油状物。
3(R)-甲苯磺酰氧基己酸甲酯
3(R)-羟基己酸甲酯(310mmol)粗品溶在吡啶(100mL)中，加入对甲苯磺酰氯(59g，310mmol)。反应混合物先于5℃搅拌24小时，再于15℃搅拌16小时。缓慢加水(5mL)破坏过量的试剂，加水时间超过1小时。混合物倾入20％甲苯/己烷(600mL)中，并用水洗涤(3×250mL)。有机层浓缩，得83g油状产物，纯度为95％。
3(S)-(2-噻吩硫代)己酸甲酯
在-20℃将正丁基锂(1.64M，97.6mL，160mmol)加到噻吩(15.1g，180mmol)与四氢呋喃(100mL)的混合物中。搅拌30分钟后分次加入硫(5.23g)。1小时后加脱氧的甲酰胺(100mL)，接着加3(R)-甲苯磺酰氧基己酸甲酯(40g，33.3mmol)。反应混合物室温搅拌24小时，然后用乙酸乙酯(100mL)和水(50mL)稀释。分离的水层用乙酸乙酯(100mL)反萃取。合并有机层，浓缩后得到黄色油状产物23.9g。按3-酮己酸甲酯计算，总收率为74％。
5，6-二氢-6(S)-(丙基)-4H-噻吩并〔2，3b〕噻喃-4-酮
3(S)-(2-噻吩硫代)己酸甲酯(125g，513mmol)与乙酸(150mL)和浓盐酸(150mL)混合后于100℃加热96小时。混合物用甲苯(2×300mL)萃取。合并有机层，洗涤，浓缩，得暗棕色油状物，该油状物溶于甲苯(1200mL)中。混合物冷却至0℃，加三氟乙酸酐(126g，600mmol)。45分钟后混合物用水(2×200mL)洗，浓缩，得151g油状物，不经纯化，直接用于下步反应。
5，6-二氢-6(S)-(丙基)-4H-噻吩并〔2，3b〕噻喃-4-酮-7，7-二氧化物。
5，6-二氢-6(S)-(3-丙基)-4H-噻吩并〔2，3b〕噻喃-4-酮(4.25g，20mmol)溶于乙酸乙酯(80mL)中。加入钨酸钠(660mg，2mmol)，30％过氧化氢(8.2mL，80mmol)和10滴硫酸。24小时后反应混合物用乙酸乙酯(100mL)稀释，用10％Na2SO3溶液洗涤，用饱和的NaHCO3溶液洗涤。有机层浓缩，用乙醇研磨，得到4.5g产物(95％)。
微生物
生物纯的piliminae红酵母样品从夏威夷pilimanae果蝇幼虫中分离得到，现在按照布达佩斯条约可以从ATCC的永久培养物中心得到，12301 Parklawn Drive，马里兰的Rockville，登记号为ATCC32762。生物纯的深红酵母样品目前可以从ATCC的永久培养物中心得到，12301Parklawn Drive，马里兰州Rockville，登记号为ATCC74283。授予专利权后，对于公众使用微生物的任何限制都将永远取消。深红酵母ATCC74283从污染的酸乳酪中分离得到。
本发明一般使用的分析方法当然是非限制性的，现描述如下：
分析方法
生物量测定：
用光密度和细胞干重测定生物量。用Hewlett Packard 8451A型二级管阵列分光光度计在660nm波长测定光密度。细胞干重用HA型Millipore滤膜测定，滤孔为0.45μm。
葡萄糖
葡萄糖用液相色谱监测，液相色谱上装有Macintosh经典计算机用于控制和收集数据，装有折射率检测器Al-2 Dynamax自动进样器，分析型HP泵，压力组件和Biorad Aminex HPX87H离子排阻柱(300×78mm)，于60℃加热。洗脱剂为0.005M硫酸，流速为0.7mL/分
肉汤萃取
全部肉汤用等体积乙酸乙酯萃取。混合物在振荡器上振荡5分钟后在Beckman TJ-6离心机上于2000rpm离心10分钟。得到的上层清液干燥，再用甲醇混悬，作薄层色谱分析或HPLC分析。
薄层色谱
使用Kiesel预涂的硅胶60薄层色谱板F254。流动相由94％二氯甲烷、5％甲醇和1％氢氧化铵组成。样品点在板上，吹干。板的一边浸到流动相中，直至溶剂爬到离板上沿1英寸处。
高效液相色谱
HPLC用Rainin系统在室温下完成，配备有Macintosh经典计算机以便控制和获得数据，Dynamax吸收检测器UV-M，Al-2 Dynamax自动进样器，两个分析型HP泵，装有Zorbax RX-C8柱(4.6×250nm)的压力系统。使用2种洗脱剂，甲醇和水(0.1％v/vH3PO4)，组合流速为1.5mL/分，UV检测波长为254nm.由30/70的甲醇/酸化水(v/v)在15分钟内变至70/30的甲醇/酸化水(v/v)的梯度洗脱。在70/30(v/v)保持5分钟，然后至30/70(v/v)平衡5分钟。这样，分别在9.5分时分离收集顺式-羟基砜，10分时分离收集反式-羟基砜，12.8分时分离收集砜-酮。
                       实施例1
培养方法
在筛分或振荡烧瓶培养的过程中生成反式-羟基砜，深红酵母ATCC74283细胞最初由Sabouraud葡萄糖(Difco)斜面培养液或后来由冷冻甘油悬浮液(1mL)接种到含50mL Sabouraud葡萄糖肉汤的250mLErlenmever烧瓶中。Sabouraud葡萄糖肉汤是可以买到的商品，由10g/LDifco新胨(neopeptone)和20g/L Bacto葡萄糖构成。烧瓶在28℃培育24小时，同时在每分钟220转速度下搅动，以便得到作用接种物必须的充分的生物量。将接种物转移(5％/25mL)到含500mL Sabouraud葡萄糖肉汤的2升Erlenmeyer烧瓶中。然后将培养物在28℃培育42小时，同时在每分钟180转速下搅动。细胞离心分离，用pH6.0的MES缓冲液洗涤，加砜-酮之前再悬浮到pH6.0的MES缓冲液中。
在23升的发酵罐中进行生物反应器的培养，发酵罐用含深红酵母ATCC74283的Sabouraud葡萄糖肉汤的2升烧瓶接种并象前面描述的那样培养42小时。发酵罐参数如下：温度28℃，搅拌速度每分钟200转(最低设定速度)，通入空气的速度为10L/分，反压力为0.6磅/平方英寸(0.0422千克/厘米2)。通过搅拌，控制溶解的氧气压在40％的最小值。当吸氧速度降到5mmoles/升/小时以下时，在无菌条件下收获细胞。
反应参数
最佳生物转化参数是这样一些参数，其中使用3-〔N-吗啉代〕丙磺酸(MOPS)或2-〔N-吗啉代〕乙磺酸(MES)缓冲液(0.5M)，温度为大约20℃至40℃，pH范围为大约4.5至8.0，产生的生物转化速率为大约0.011g/g CDW/小时至大约0.150g/g CDW/小时。温度范围为大约20℃至大约50℃，最好是大约30℃至大约35℃。为溶解砜-酮底物使用的溶剂为乙醇、甲醇或DMSO，最好是DMSO，用量分别为1％至15％v/v，最好是1％至3％。底物的量为大约1至3g/L，最好是1.5g/L，这样反式-羟基砜的回收率可达66％，非对映异构体过量可达95％；令细胞老化大约16小时至60小时，最好为大约40小时至60小时，对应于氧的吸收速度降到低于5mmoles/L/小时。
反式-羟基砜II(5，6-二氢-4(S)-羟基-6(S)-丙基-4H-噻吩并-〔2，3-b〕噻喃，7，7-二氧化物)的生物转化和分离
含深红酵母细胞的肉汤(10或50mL)用Beckman TJ-6离心机在每分钟4000转的速度下离心10分钟后倾出上清液。沉积的小丸再悬浮到pH6.0的0.5M 2-〔N-吗啉代〕乙磺酸(MES)缓冲溶液中再离心。洗涤过的细胞再悬浮到50mL MES缓冲溶液中。需要时将细胞稀释，以便更好地分析生物转化反应速率。将相当于1g/L纯砜-酮的粗砜-酮底物(纯度为56％)的乙醇溶液(3％v/v)加到装有洗涤过的细胞的烧瓶中。该烧瓶在32.5℃的水浴中培育并继续振摇。用氯仿(按1∶1，v/v)或乙酸乙酯(按1∶1，v/v)萃取肉汤以便收获产品，萃取液干燥，并再悬浮到甲醇中。同时用薄层色谱和高效液相色谱(HPLC)分析萃取液。反式-羟基砜、顺式-羟基砜和砜酮的HPLC保留时间分别为9.5、10.0和12.8。反式-羟基砜的1HNMR(250MHz，CDCl3)如下：
δ7.58(d，J＝5.1Hz，1H)，7.08(d，J＝5.1Hz，1H)，4.94(t，J＝3.6Hz，1H)，3.66(m，1H)，2.6-2.1(m，3H)，1.7-1.5(m，，3H)，1.01(t，J＝7.01，3H)。
使用生物反应器培养细胞时，当吸氧速度低于5mmoles/L/小时便可收获细胞，离心分离和用pH6.0的0.5M MES缓冲液洗涤。将收获的细胞再悬浮到pH6.0的0.5M MES缓冲液中，然后再放回到发酵罐中。为完成生物转化，发酵罐的参数调至：温度32.5℃，搅拌速度为每分钟400转，通空气的量为6L/分，反压力为0.6磅/平方英寸(0.0422千克/厘米2)。砜-酮(1.5g/L)溶于DMSO并加到发酵罐中(3％，v/v)。定时取样以便用HPLC监测生物转化活性。收获时应达到1.14g/L/hr或0.126g/gCDW/hr的生物转化速率，反式-羟基砜的终产率为1.04g/L-1，非对映异构体过量值为96.4％。肉汤用乙酸乙酯(按0.5∶1，v/v)萃取，溶剂相用旋转蒸发器浓缩。
                           实施例2反式-羟基砜(5，6-二氢-4(S)-羟基-6(S)-甲基-4H-噻吩并〔2，3b〕噻喃，7，7-二氧化物的生物转化
将4℃保存在Sabouraud葡萄糖琼脂斜面上的接种ATCC74283细胞在含50ml Sabouraud葡萄糖肉汤的250ml Erlenmever烧瓶中培育。于28℃振摇下培育20小时后，将溶于乙醇中的砜-酮(33.3mg/ml)加到烧瓶中(每个烧瓶1ml)。将培养物调回原来的条件再培育24小时。使用1体积的氯仿萃取残留的砜-酮和生成的羟基砜。TLC和HPLC分析指示砜-酮完全转化为反式-羟基砜。用NMR分析证实反式-羟基砜的结构：
δ7.6(d，1H，C2-H)，7.1(d，1H，C3-H)，4.9(m，1H，C4-H)，3.8(m，1H，C6-H)，3.5-3.0(brs，1H，OH)，2.6(m，1H，C5-H)，2.4(m，1H，C5-H)，1.5(d，3H，C6-CH3)。
                          实施例3
通过实施例，制备通式I的化合物〔5，6-二氢-6-(S)-丙基-4(S)-1-乙氨基-4H-噻吩并〔2.3-b〕噻喃-2-磺酰氨-7，7-二氧化物〕表述如下：
步骤1：方法
在装有电磁搅拌器、热电偶探针和氮气导管的100mL园底烧瓶中将反式-羟基砜(7.32g，29.7mmol)悬浮于乙腈(38mL)中。溶液冷至0℃，分次加入硫酸(5ml，88.7mmol)。然后反应混合物室温搅拌。化合物冷至0-5℃。在500mL的烧瓶中装有水(34mL)和乙腈(43mL)，然后将混合物冷至0-5℃，并充分搅拌。再将反应混合物小心地加入，使淬火温度保持在5℃以下。加入饱和碳酸钾溶液(30mL)直至水层pH在7-8之间或直至不再有二氧化碳逸出。有机层浓缩成粗油状物(14.1g)，测定的含量为42.5％(重量)。产率为5.99g(73％)。
步骤2：方法
在装有电磁搅拌和热电偶探针的100mL园底烧瓶中装入氯磺酸(13.14mL)并冷至0-5℃。用30分钟将乙酰氨基砜(6.57g)滴加到烧瓶中，以便保持内温度在15℃以下。黑色的反应混合物先在33℃加热16小时，然后在50℃加热5小时。当HPLC表明存留的乙酰氨基砜(相当于磺酸和磺酰氯)少于0.5％时，混合物冷至室温。滴加亚硫酰氯(13.14mL)。加完后，黑色的混合物加热至45℃。16小时后磺酸的峰面积小于0.5％。混合物冷至0-5℃。在1升的烧瓶中装水(325mL)。并冷至0℃。将氯化的反应混合物滴加到充分搅拌的淬火溶液中，滴加时间不得少于30分钟，以便保持内温低于5℃。混合物搅拌45分钟后过滤。湿滤饼用冷水(10mL)洗涤并在氮气流下干燥。往装有电磁搅拌和热电偶探针的250mL烧瓶中装浓氨水(24mL)和四氢呋喃(43mL)。混合物冷至大约-10℃。在内温低于0℃下往里分次加粗磺酰氯的湿固体，加样时间超过1小时。2小时后存留的磺酰氯少于18％。用盐酸水溶液(大约50mL)中和过量的氨。水层用四氢呋喃洗涤2次。合并四氢呋喃层并浓缩。残留物再悬浮到四氢呋喃中，并小心地加水。形成的结晶为棕色，水溶液保持黄色。混合物过滤，结晶真空干燥。乙酰氨基磺酰氨的产量为5.58g(66％)。
步骤3：方法
在250mL烧瓶中乙酰氨基磺酰氨(4.21g，11.5mmol)用四氢呋喃(2×100mL)蒸馏进行干燥。烧瓶装有电磁搅拌，热电偶探针和氮气导管。乙酰氨基磺酰氨与22.5mL四氢呋喃的悬浮液然后冷至0-5℃。往里滴加甲硼烷-四氢呋喃(51mL，51mmol)，内温保持在5℃以下，滴加时间45分钟。氢气完全逸出后(20分钟)，溶液升温至30-35℃。反应完全后(3小时)，混合物冷至室温。在装有电磁搅拌、热电偶探针和氮气导管的250mL园底烧瓶中装硫酸(60mL)并冷至0-5℃。反应混合物小心地计量并加到充分搅拌的酸溶液中，内温保持在20℃以下。加完之后混合物在室温搅拌直至氢气释放完。然后将烧瓶装好，在1大气压下蒸馏使混合物浓缩至蒸馏的内温高于97℃。蒸馏完毕后，混合物冷至20℃。混合物用碳酸氢钾水溶液中和并用乙酸乙酯(100ml)萃取。有机层浓缩得3.45g 5，6-二氢-6-(S)-丙基-4(S)-1-乙氨基-4H-噻吩并〔2，3-b〕噻喃-2-磺酰氨7，7-二氧化物。

Claims (9)

1.制备通式II化合物的方法：
其中A为碳，R1为
a)C1-5的直链或支链烷基；
b)C3-5烯基；
c)C3-5炔基；
d)氢；或
e)C1-4烷氧基-C1-4烷基，
该方法包括的步骤有，在含可吸收性氮源，碳源及底物化合物III的营养性介质中在需氧条件下培养微生物深红酵母ATCC74283；或piliminae红酵母ATCC32762直至显著量的化合物II生成，并分离生成的化合物，
其中R2为
a)C1-5直链或支链烷基；
b)C3-5烯基；
c)C3-5炔基；
d)氢；或
e)C1-4烷氧基-C1-4烷基。
2.权利要求1的方法，其中C1-5直链或支链烷基是正丙基或异丁基，C3-5烯基是烯丙基，C3-5炔基是炔丙基。
3.权利要求1的方法，其中微生物为深红酵母ATCC74283，底物溶于1％-15％(v/v)的乙醇、甲醇或DMSO，底物的量为1g/L至3g/L。
4.权利要求3的方法，其中底物溶于1％至3％(v/v)的DMSO，底物的量为1g/L至3g/L。
5.权利要求1的方法，其中温度为20至50℃，pH为4.5至8.0。
6.权利要求1的方法，其中温度为30℃至35℃，pH为5.5至6.5。
7.权利要求1的制备通式II化合物的方法：
其中A为碳，R1为
a)C1-5直链或支链烷基；
b)C3-5烯基；
c)C3-5炔基；
d)氢；或
e)C1-4烷氧基-C1-4烷基
该方法包括在含可吸收性氮源、碳源及底物化合物III的营养性介质中培养深红酵母ATCC74283，
Figure C9519614500032
在通式III中，R2为
a)C1-5直链或支链烷基；
b)C3-5烯基；
c)C3-5炔基；
d)氢；或
e)C1-4烷氧基-C1-4烷基，
培养在需氧条件下进行，直至生成显著量的化合物II，分离生成的化合物II，培养时使底物溶在体积百分比浓度1％至15％乙醇、甲醇或DMSO中，底物的含量为1g/L至3g/L，培养温度为20℃至50℃，pH为4.5至8.0。
8.权利要求7的方法，其中C1-5直链或支链烷基是正丙基或异丁基，C3-5烯基是烯丙基，C3-5炔基是炔丙基。
9.权利要求7的方法，其中底物溶解在1％至3％(v/v)的DMSO中，底物的量为1g/L至3g/L，温度为30℃至35℃，pH为5.5至6.5。
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