SK283028B6 - Spôsob prípravy trans-hydroxysulfónu - Google Patents

Spôsob prípravy trans-hydroxysulfónu Download PDF

Info

Publication number
SK283028B6
SK283028B6 SK315-97A SK31597A SK283028B6 SK 283028 B6 SK283028 B6 SK 283028B6 SK 31597 A SK31597 A SK 31597A SK 283028 B6 SK283028 B6 SK 283028B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
carbon atoms
atcc
added
hydroxysulfone
trans
Prior art date
Application number
SK315-97A
Other languages
English (en)
Other versions
SK31597A3 (en
Inventor
Michel M. Chartrain
Lorraine G. Katz
Steven A. King
Original Assignee
Merck & Co., Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck & Co., Inc. filed Critical Merck & Co., Inc.
Publication of SK31597A3 publication Critical patent/SK31597A3/sk
Publication of SK283028B6 publication Critical patent/SK283028B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/185—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Spôsob prípravy trans-hydroxysulfónu všeobecného vzorca (II), v ktorom všeobecného symboly majú význam, uvedený v hlavnom nároku, pri ktorom sa postupuje tak, že sa pestuje mikroorganizmus Rhodotorula rubra ATCC 74283 alebo Rhodotorula piliminae ATCC 32762 v živom prostredí, ktoré obsahuje využiteľné zdroje dusíka a uhlíka a ako substrát sulfoketón všeobecného vzorca (III), v ktorom R1 má význam, uvedený v hlavnom nároku, za aeróbnych podmienok do nahromadenia trans-hydroxysulfónu všeobecného vzorca (II), ktorý sa potom izoluje.ŕ

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka spôsobu prípravy úw/s'-hydroxysulfónu biologickou premenou. Výsledná látka je vhodná na liečenie zvýšeného vnútroočného tlaku.
Doterajší stav techniky
Glaukóm je očné ochorenie, spojené so zvýšeným vnútroočným tlakom, ktorého hodnoty sú príliš vysoké na normálnu funkciu oka, takže môže dôjsť k nevratnej strate zraku. Bez liečenia dochádza často k oslepnutiu. Zvýšený vnútroočný tlak, to znamená tlak, zvýšený na také hodnoty, pri ktorých ešte nedochádza k poškodeniu očného nervu alebo k charakteristickým defektom zorného poľa ako pri glaukóme, je pravdepodobne počiatočnou fázou glaukómu.
Z látok, účinných pri znižovaní zvýšeného očného tlaku sa zvlášť používajú sulfónové deriváty všeobecného vzorca
a ich diastereoméry, jednotlivé enantioméry alebo ich zmesi, alebo ich oftalmologicky prijateľné soli, v ktorých A znamená atóm uhlíka alebo dusíka,
Z znamená skupinu -NHR alebo -OR,
R znamená alkyl s 1 až 6 atómami uhlíka s priamym alebo rozvetveným reťazcom,
R1 znamená
a) alkyl s 1 až 5 atómami uhlíka s priamym alebo rozvetveným reťazcom, zvlášť n-propyl alebo izobutyl,
b) alkenyl s 3 až 5 atómami uhlíka, zvlášť alyl,
c) alkinyl s 3 až 5 atómami uhlíka, zvlášť propargyl,
d) atóm vodíka alebo
e) alkoxyalkyl s 1 až 4 atómami uhlíka v každej časti a
X znamená skupinu -SO2- alebo -C(O)-, tieto látky sú známe z US patentových spisov č. 4 794 413 a 5 157 129. Je známe, že pri miestnom podaní sú tieto látky účinnými inhibítormi anhydrázy kyseliny uhličitej (TCAI) a je možné ich použiť pri miestnom podaní. Syntéza týchto látok zahrnuje redukciu sulfoketónu na prekurzor íranj-hydroxysulfónu. Syntetické postupy však vedú k získaniu diastereomémych alebo racemických produktov, ktoré je nutné od seba oddeliť, čo znamená stratu najmenej 50 % produktu pri získaní účinnejšieho enantioméru.
Vynález si kladie za úlohu navrhnúť nový, výhodnejší postup na premenu sulfoketónu na /ra«.s-hydroxysulfón mikrobiologickým spôsobom.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvorí nový spôsob prípravy írans-hydroxysulfónu všeobecného vzorca (II)
QH tácii sulfoketónu ako substrátu v prítomnosti mikroorganizmu Rhodotorula rubra, ATCC 74283 alebo Rhodotorula piliminae, ATCC 32762, výhodný je najmä mikroorganizmus Rhodotorula rubra. Biologická premena sa uskutočňuje v submerznej kultúre za aeróbnych podmienok vo vhodnom prostredí s obsahom uhľohydrátov a živín s obsahom dusíka pri pH 4,6 až 8,0, výhodne 6,0 do nahromadenia zlúčeniny všeobecného vzorca (II).
Výsledný analóg írazw-hydroxysulfónu sa získa v diastereomémom prebytku vyššom než 95 %. Kľúčovým stupňom tohto nového postupu, to znamená riadenia diastereomémeho prebytku hydroxysulfónu je riadenie koncentrácie zvyšného sulfoketónu v reakčnom prostredí.
Podstatu vynálezu teda tvorí spôsob prípravy trans-hydroxysulfónu všeobecného vzorca (II)
OH
A znamená atóm uhlíka a
R1 znamená
a) alkyl s 1 až 5 atómami uhlíka s priamym alebo rozvetveným reťazcom, zvlášť «-propyl alebo izobutyl,
b) alkenyl s 3 až 5 atómami uhlíka, zvlášť alyl,
c) alkinyl s 3 až 5 atómami uhlíka, zvlášť propargyl,
d) atóm vodíka alebo
e) alkoxyalkyl s 1 až 4 atómami uhlíka v každej časti, tieto látky sú prekurzory zlúčenín všeobecného vzorca (I)
ich jednotlivých diastereomérov, jednotlivých enantiomérov alebo ich zmesí, alebo oftalmologicky prijateľných solí, v ktorých
A znamená atóm uhlíka,
Z znamená skupinu -NHR alebo -OR,
R znamená alkyl s 1 až 6 atómami uhlíka s priamym alebo rozvetveným reťazcom,
R1 znamená
a) alkyl s 1 až 5 atómami uhlíka s priamym alebo rozvetveným reťazcom, zvlášť «-propyl alebo izobutyl,
b) alkenyl s 3 až 5 atómami uhlíka, zvlášť alyl,
c) alkinyl s 3 až 5 atómami uhlíka, zvlášť propargyl,
d) atóm vodíka alebo
e) alkoxyalkyl s 1 až 4 atómami uhlíka v každej časti a X znamená skupinu -SO2- alebo -C(O)-.
Pri novom postupe podľa vynálezu sa uskutočňuje fermentácia mikroorganizmov Rhodolorula piliminae alebo Rhodotorula rubra, výhodne Rhodotorula rubra v prítomnosti substrátu, ktorým je zlúčenina všeobecného vzorca (III), sulfoketón
O
kde A znamená uhlík a R1 má uvedený význam.
Tento /ran.s-hydroxysulfón je prekurzorom výsledného produktu uvedeného vzorca (I). Postup spočíva vo fermenkde R1 znamená
a) alkyl s 1 až 5 atómami uhlíka s priamym alebo rozvetveným reťazcom, zvlášť «-propyl alebo izobutyl,
b) alkenyl s 3 až 5 atómami uhlíka, zvlášť alyl,
c) alkinyl s 3 až 5 atómami uhlíka, zvlášť propargyl,
d) atóm vodíka alebo
e) alkoxyalkyl s 1 až 4 atómami uhlíka v každej časti, v živnom prostredí za aeróbnych podmienok do nahromadenia zlúčeniny všeobecného vzorca (II), ktorá sa potom izoluje.
Vo výhodnom uskutočnení spôsobu podľa vynálezu sa získa zlúčenina všeobecného vzorca (II)
kde
A znamená atóm uhlíka a
R1 znamená
a) alkyl s 1 až 5 atómami uhlíka s priamym alebo rozvetveným reťazcom, zvlášť n-propyl alebo izobutyl,
b) alkenyl s 3 až 5 atómami uhlíka, zvlášť alyl,
c) alkinyl s 3 až 5 atómami uhlíka, zvlášť propargyl,
d) atóm vodíka alebo
e) alkoxyalkyl s 1 až 4 atómami uhlíka v každej časti, ktorá je prekurzorom zlúčenín všeobecného vzorca (I)
SOjNHg (I) ich jednotlivých diastereomérov, jednotlivých enantiomérov alebo ich zmesí, alebo oftalmologicky prijateľných solí, v ktorých
A znamená atóm uhlíka,
Z znamená skupinu -NHR alebo -OR,
R znamená alkyl s 1 až 6 atómami uhlíka s priamym alebo rozvetveným reťazcom,
R1 znamená
a) alkyl s 1 až 5 atómami uhlíka s priamym alebo rozvetveným reťazcom, zvlášť n-propyl alebo izobutyl,
b) alkenyl s 3 až 5 atómami uhlíka, zvlášť alyl,
c) alkinyl s 3 až 5 atómami uhlíka, zvlášť propargyl,
d) atóm vodíka alebo
e) alkoxyalkyl s 1 až 4 atómami uhlíka v každej časti a
X znamená skupinu -SO2- alebo -C(O)-, tak, že sa pestuje mikroorganizmus Rhodotorula rubra, ATCC 74 283 v živnom prostredí, ktoré obsahuje zdroje dusíka a uhlíka a substrát, zlúčeninu všeobecného vzorca (III)
O
kde R1 znamená
a) alkyl s 1 až 5 atómami uhlíka s priamym alebo rozvetveným reťazcom, zvlášť n-propyl alebo izobutyl,
b) alkenyl s 3 až 5 atómami uhlíka, zvlášť alyl,
c) alkinyl s 3 až 5 atómami uhlíka, zvlášť propargyl,
d) atóm vodíka alebo
e) alkoxyalkyl s 1 až 4 atómami uhlíka v každej časti, za aeróbnych podmienok do nahromadenia zlúčeniny všeobecného vzorca (II), ktorá sa potom izoluje, substrát sa rozpustí v približne 1 % až 15 % (% objemové) etanolu, metanolu alebo DMSO a použije sa v množstve 1 až 3 g/1, postup sa uskutočňuje pri teplote 20 až 50 °C a pri pH 4,5 až 8,0.
Zlúčeninu všeobecného vzorca (III), ktorá sa používa ako substrát, je možné syntetizovať nasledujúcim spôsobom, ktorý slúži len ako jeden z možných príkladov syntézy.
Metyl-3 (R)-hydroxyhexanoát
44,7 g, 310 mmol metyl-3-ketohexanoátu sa zriedi 75 ml metanolu a pridajú sa 2 ml 0,2 N HCI. Potom sa pridá ešte 200 mg Et2NH2+Ru2Cl5-(BINAP)2 a zmes sa zahrieva na 60 °C pri tlaku vodíka 0,7 MPa celkom 2 hodiny. Potom sa pridá 100 ml toluénu a zmes sa odparí na olej s hmotnosťou 75 g.
Metyl-3(R)-toluénsulfonyloxyhexanoát
Roztok 310 mmol surového metyl-3(R)-hydroxyhexanoátu sa rozpustí v 100 ml pyridínu a pridá sa 59 g, 310 mmol p-toluénsulfonylchloridu. Zmes sa mieša 24 hodín pri teplote 5 °C a potom 16 hodín pri teplote 15 °C. Potom sa pomaly v priebehu jednej hodiny pridá 5 ml vody na rozloženie prebytočného reakčného činidla. Zmes sa vleje do 600 ml 20 % toluénu v hexáne a potom sa premyje 3 x 250 ml vody. Organická vrstva sa odparí, čím sa získa 83 g produktu vo forme oleja, čistota produktu je 95 %.
Metyl-3(S)-(2-tioféntio)hexanoát
97,6 ml, 1,64 M roztoku n-butyllítia, celkom 160 mmol tejto látky sa pridá k 15,1 g, 180 mmol tiofénu v 100 ml THF pri teplote -20 °C. Zmes sa 30 minút mieša a potom sa po častiach pridá 5,23 g síry. Po jednej hodine sa pridá ešte 100 ml formamidu, zbaveného kyslíka a potom ešte 40 g, 33,3 mmol metyl-3(R)-toluénsulfonyloxyhexanoátu. Zmes sa mieša 24 hodín pri teplote miestnosti a potom sa zriedi 100 ml etylacetátu a 50 ml vody. Vrstvy sa oddelia a vodná vrstva sa spätne extrahuje 100 ml etylacetátu. Organické fázy sa spoja a odparia na 23,9 g produktu vo forme žltého oleja. Celkový výťažok, vztiahnuté na použité množstvo metyl-3-ketohexanoátu bol 74 %.
5.6- Dihydro-6(S)-(propyl)-4H-tieno[2,3-b]tiopyran-4-on
125 g, 513 mmol metyl-3(S)-(2-tioféntio)hexanoátu sa zahrieva 96 hodín na 100 °C spolu so 150 ml kyseliny octovej a 150 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej. Potom sa zmes extrahuje 2 x 300 ml toluénu. Organické vrstvy sa spoja, premyjú a odparia ma tmavohnedý olej, ktorý sa rozpustí v 1200 ml toluénu. Roztok sa ochladí na 0 °C a pridá sa 126 g, 600 mmol anhydridu kyseliny trifluóroctovej. Po 45 minútach sa zmes premyje 2 x 200 ml vody a odparí sa, čím sa získa 151 g oleja, ktorý sa použije v nasledujúcom stupni bez ďalšieho čistenia.
5.6- Dihydro-6(S)-(propyl)-4H-tieno[2,3-b]tiopyran-4-on-7,7-dioxid
4,25 g, 20 mmol 5,6-dihydro-6(S)-(3-propyl)-4H-tieno-[2,3-b]tiopyran-4-onu sa rozpustí v 80 ml etylacetátu. Potom sa pridá 660 mg, 2 mmol wolframanu sodného, 8,2 ml, 80 mmol 30 % peroxidu vodíka a 10 kvapiek kyseliny sírovej. Po 24 hodinách sa reakčná zmes zriedi 100 ml etylacetátu a premyje sa 10 % roztokom siričitanu sodného a nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného. Organická vrstva sa odparí a rozotrie s etanolom, čím sa vo výťažku 95 % získa 4,5 g produktu.
Mikroorganizmus
Biologicky čistá vzorka Rhodotorula piliminae sa izoluje z hawajskej larvy Drosophila piliminae. Organizmus je bežne dostupný a bol uložený podľa podmienok Budapeštianskej dohody do stálej verejnej zbierky kultúr Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockvillc, Maryland pod príjmovým číslom ATCC 32762. Biologicky čistá vzorka Rhodotorula rubra je dostupná pod príjmovým číslom ATCC 74283 v tej istej zbierke. Akékoľvek obmedzenie prístupu k mikroorganizmu budú odvolané po udelení patentu. Rhodotorula rubra ATCC 74283 bola izolovaná z kontaminovanej kyslej smotany.
V priebehu rôznych postupov boli použité nasledujúce analytické metódy.
Meranie biomasy
Biomasa bola meraná pomocou optickej hustoty a sušiny buniek. Optická hustota bola meraná s použitím diódového spektrometra (Hewlett Packard 8451A), nastaveného na 660 nm. Sušina buniek bola stanovená po oddelení buniek filtrom Millipore, typ HA s veľkosťou pórov 0,45 mikrometrov.
Glukóza
Glukóza bola stanovená kvapalinovou chromatografiou s klasickým počítačom Macintosh na riadenie postupu a ukladanie získaných údajov, s detektorom indexu lomu, s automatickým vstrekovacím zariadením A1-2 Dynamax, analytickým čerpadlom HP, tlakovým modulom a stĺpcom Biorad Aminex HPX-87H na odstránenie iónov s rozmerom 300 x 78 mm, stĺpec bol zahrievaný na teplotu 60 °C. Ako elučné činidlo bol použitý 0,005 M roztok kyseliny sírovej, 0,7 ml/min.
Extrakcia živného prostredia
Živné prostredie bolo extrahované rovnakým objemom etylacetátu. Zmes bola uložená na 5 minút na trepacie zariadenie a potom odstredená 10 minút pri 2000 otáčkach/minútu pri použití odstredivky Beckman TJ-6. Výsledný supernatant bol vysušený a znova uvedený do suspenzie v metanole na uskutočnenie chromatografie na tenkej vrstve alebo HPLC.
Chromatografia na tenkej vrstve
Na uskutočnenie boli použité vopred pripravené platne F254 zo silikagélu 60. Mobilná fáza obsahovala 94 % metylénchloridu, 5 % metanolu a 1 % hydroxidu amónneho. Vzorky boli nanesené na platňu a vysušené. Jedna hrana platne bola ponorená do mobilnej fázy a rozpúšťadlo postupovalo smerom nahor po platni až do vzdialenosti približne 2,5 cm pod hornú hranu platne.
HPLC bola uskutočňovaná s použitím systému Rainin, ktorý bol vybavený klasickým počítačom Macintosh na riadenie a ukladanie získaných údajov, detektorom absorbancie Dynamax UV-M, automatickým vstrekovacím zariadením Al-2, dvoma analytickými čerpadlami HP a tla kovým modulom so stĺpcom Zorbax RX-C8 s rozmerom 4,6 x 250 nm pri teplote miestnosti. Boli použité dva elučné činidlá, a to metanol a voda s 0,1 % objemovým kyseliny fosforečnej pri prietoku 1,5 ml/minútu, detekcia UV pri 254 nm. Bol použitý objemový gradient metanolu a okyslenej vody 30 : 70 až 70 : 30 v priebehu 15 minút. Najskôr bol udržovaný pomer 70 : 30 počas 5 minút, potom bol postupne pomer obrátený na 30 : 70 a na tejto hodnote bol udržovaný taktiež 5 minút. Pri tomto postupe dochádza k oddeleniu cw-hydroxysulfónu, íra/íA’-hydroxysuIfónu a sulfoketónu, zodpovedajúci čas retencie pre tieto látky je 9,5, 10 a 12,8 minút.
Praktické uskutočnenie vynálezu bude vysvetlené nasledujúcimi príkladmi, ktoré však nemajú slúžiť na obmedzenie rozsahu vynálezu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Kultivačné metódy
7rans-hydroxysulfón je možné získať tak, že sa pestuje Rhodotorula rubra ATCC 74283 na sitách alebo Irepacích fľašiach po naočkovaní zo šikmého agaru (Sabouraudov agar s dextrózou, Difco) alebo neskoršie zo zmrazenej suspenzie buniek v glycerole, použije sa 1 ml suspenzie pre jednu Erlenmeyerovu banku s objemom 250 ml a s obsahom 50 ml Sabouraudovho bujónu s dextrózou. Toto živné prostredie sa bežne dodáva a obsahuje 10 g/1 neopeptónu Difco a 20 g/1 dextrózy Bacto. Fľaše sa inkubujú 24 hodín pri teplote 28 °C a pretrepávaním 220 otáčok/minútu na získanie dostatočného množstva biomasy na ďalšie naočkovanie. Očkovací materiál sa potom v množstve 5 %, to znamená 25 ml prenesie do Erlenmeyerovej banky s objemom 2 litre a s obsahom 500 ml Sabouraudovho bujónu s dextrózou. Potom sa kultúra inkubuje 42 hodín pri teplote 28 °C a miešaní 188 otáčok/minútu. Bunkový materiál sa potom odstredí, premyje sa pufrom MES pri pH 6,0 a potom sa znova uvedie do suspenzie v pufri MES s pH 6,0 pred pridaním sulfoketónu.
Kultivácia v zariadení Bioreactor sa uskutočňuje vo fermentore s obsahom 23 litrov, na naočkovanie sa použijú 2 litre Sabouraudovho bujónu s dextrózou s obsahom kmeňa Rhodotorula rubra ATCC 74283 po pestovaní 42 hodín, ako bolo opísané. Teplota pri kultivácii je 28 °C, miešanie pri aspoň 200 otáčkach/minútu, prevzdušnenie 10 Iitrov/minútu a tlak 0,001 MPa. Tlak rozpusteného kyslíka bol riadený miešaním na najmenej 40 %. Hneď ako rýchlosť príjmu kyslíka poklesla pod 5 mmol/l/h, boli bunky izolované za sterilných podmienok.
Parametre reakcie
Optimálnu biologickú premenu je možné dosiahnuť v prípade, že sa ako pufor v molárnej koncentrácii 0,5 M použije kyselina 3-[;V-morfolino]propánsulfónová, MOPS alebo kyselina 2-[.V-morfolino]etánsulfónová, MES, pri teplote 20 až 40 °C a pri pH 4,5 až 8,0, čím je možné dosiahnuť rýchlosť biologickej premeny približne 0,011 g/g CDW/h až 0,150 g/g CDW/h. Teplotné rozmedzie je 20 až 50 °C, výhodne 30 až 35 °C. Použiteľnými rozpúšťadlami na rozpustenie sulfoketónu ako substrátu sú etanol, metanol alebo DMSO, výhodne DMSO v koncentrácii 1 až 15, výhodne 1 až 3 % objemové. Množstvo substrátu je 1 až 3 g/1, výhodne 1,5 g/1 na dosiahnutie výťažku 66 % trans-hydroxysulfónu s diastereomémym prebytkom 95 %. Bunkový materiál sa pestuje 16 až 60 hodín, výhodne 40 až hodín v závislosti od poklesu hodnoty OUR pod 5 mmol/l/h.
Biologická premena a izolácia /ra/t.v-hydroxysulfónu vzorca (II) (5,6-dihydro-4(S)-hydroxy-6(S)-propyl-4H-tieno[2,3-b]tiopyran-7,7-dioxidu)
Podiely 10 alebo 50 ml živného prostredia s obsahom buniek Rhodotorula rubra sa odstredí 10 minút pri 4000 otáčkach/minútu s použitím odstredivky Beckman TJ-6 a supematant sa zleje. Usadenina buniek sa znova uvedie do suspenzie v 0,5 M kyseliny 2-[,V-morfolinojetánsulfónovcj, MES, ako pufra pri pH 6,0 a potom sa materiál znova odstredí. Premytý bunkový materiál sa znova uvedie do suspenzie v 50 ml pufra MES. V prípade potreby sa materiál zriedi na ľahšiu analýzu reakčnej rýchlosti pri biologickej premene. Potom sa do fliaš, ktoré obsahujú premyté bunky, pridá surový sulfoketón s čistotou 56 %, čo zodpovedá 1 g/1 čistého sulfoketónu v 3 % etanole (% objemové). Fľaše sa inkubujú vo vodnom kúpeli pri teplote 32,5 °C za stáleho trepania. Potom sa živné prostredie extrahuje chloroformom v objemovom pomere 1 : 1 alebo rovnakým množstvom etylacetátu, materiál sa vysuší a uvedie do suspenzie v metanole. Potom sa uskutočňuje analýza chromatografíou na tenkej vrstve a pomocou HPLC. Čas retencie pre transhydroxysulfón, cw-hydroxysulfón a sulfoketón pri uskutočňovaní HPLC sú 9,5, 10,0 a 12,8.
’H-NMR pre ŕraní-hydroxysulfón (250 MHz, CDC13): 7,58 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 7,08 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 4,94 (t, J = = 3,6 Hz, 1H), 3,66 (m, 12H), 2,6 - 2,1 (m, 3H), 1,7 - 1,5 (m, 3H), 1,01 (t, J = 7,01, 3H).
Pri pestovaní v zariadení Bioreactor sa bunkový materiál izoluje po poklese hodnoty OUR pod 5 mmol/l/h a potom sa odstredí a premyje 0,5 M MES pufra s pH 6,0. Potom sa bunky znova uvedú do suspenzie v tom istom pufri a vrátia do fermentačného zariadenia. Fermentor sa potom na biologickú premenu nastaví na teplotu 32,5 °C, miešanie 400 otáčok/minútu, prevzdušnenie 6 I/minútu a spätný tlak 0,005 MPa. 1,5 g/1 sulfoketónu sa rozpustí v DMSO a pridá do fermentora (3 % objemové). Vzorky sa periodicky odoberajú a sleduje sa biologická premena pomocou HPLC. Pri izolácii buniek bola dosiahnutá týmto spôsobom rýchlosť biologickej premeny 1,14 g/l/h alebo 0,126 g/g CDW/h a výťažok /raíis-hydroxysulfónu 1,04 g/1 pri diastereomérnom prebytku 96,4 %. Živné prostredie bolo extrahované etylacetátom v objemovom pomere 0,5 : 1 a rozpúšťadlo bolo odparené na rotačnom odparovači.
Príklad 2
Biologická premena írans-hydroxysulfónu (5,6-dihydro-4(S)-hydroxy-6(S)-metyl-4H-tieno[2,3-b]tiopyran-7,7-dioxidu)
Kultúra buniek kmeňa ATCC 74283 zo šikmého Sabouraudovho agaru s dextrózou, uchovávaného pri 4 °C bola použitá na naočkovanie Erlenmeycrovej banky s objemom 250 ml a s obsahom 50 ml Sabouraudovho bujónu s dextrózou. Po inkubácii 20 hodín pri teplote 28 °C za pretrepávania sa sulfoketón, rozpustený v etanole (33,3 mg/ml), pridá do fliaš v množstve 1 ml na fľašu. Kultúry sa pestujú ešte 24 hodín za rovnakých podmienok inkubácie. Zvyšný ketosulfón a pripravený hydroxysulfón sa extrahujú z bujónu rovnakým objemom chloroformu. Analýza pomocou TLC a HPLC dokázala úplnú premenu sulfoketónu na trans-hydroxysulfón. Analýza NMR potvrdila štruktúru trans-hydroxysulfónu:
7,6 (d, 1H, C2-H), 7,1 (d, 1-H, CjH), 4,9 (m, 1H, C4)H), 3,8 (m, 1H, C6-H), 3,5 - 3,0 (brs, 1H, OH), 2,6 (m, 1H, C5-H), 2,4 (m, 1H, CrH), 1,5 (d, 3H, C6-CH3).
Príklad 3
Príklad spôsobu výroby zlúčenín všeobecného vzorca (f) (5,6-dihydro-6(S)-propyl-4(S)-l-etylamino-4H-tieno[2,3-b]tiopyran-2-sulfónamid-7,7-dioxidu)
Stupeň 1
7,32 g, 29,7 mmol /rmw-hydroxysulfónu sa uvedie do suspenzie v 38 ml acetonitrilu vo fľaši s okrúhlym dnom s objemom 100 ml, vybavenej magnetickým miešadlom, termočlánkom a prívodom na dusík. Roztok sa ochladí na 0 °C a po častiach sa pridá 5 ml, 88,7 mmol kyseliny sírovej. Potom sa reakčná zmes mieša pri teplote miestnosti, potom sa ochladí na 0 až 5 °C. Do banky s objemom 500 ml sa vloží 34 ml vody a 43 ml acetonitrilu, zmes sa ochladí na teplotu 0 až 5 °C a dobre sa premieša. Potom sa do banky pridá ešte pripravená reakčná zmes vybavená po častiach tak, aby teplota zostávala pod 5 °C. Potom sa pridá ešte 30 ml nasýteného roztoku uhličitanu draselného, roztok sa pridáva tak dlho, až sa dosiahne pH vodnej vrstvy v rozmedzí 7 až 8 alebo až sa prestane vyvíjať oxid uhličitý. Potom sa organická vrstva odparí na 14,1 g surového olejovitého materiálu. Vo výťažku 73 % sa získa 5,99 g produktu. Čistota surového olejovitého materiálu bola 42,5 % hmotnostných.
Stupeň 2
Do banky s okrúhlym dnom s objemom 100 ml, vybavenej magnetickým miešadlom a termočlánkom sa vloží 13,14 ml kyseliny chlórsulfónovej a kyselina sa ochladí na teplotu 0 až 5 °C. Potom sa po častiach v priebehu 30 minút pridá 6,57 g acetamidosulfónu tak, aby vnútorná teplota zmesi zostala pod 15 °C. Tmavo zafarbená reakčná zmes sa potom zahrieva 16 hodín na teplotu 33 °C a potom ešte 5 hodín na teplotu 50 °C. Hneď ako sa pri analýze HPLC dokáže, že zostáva menej než 0,5 % acetamidosulfónu (vztiahnuté na kyselinu sulfónovú a sulfonylchlorid), zmes sa ochladí na teplotu miestnosti. Potom sa po kvapkách pridá 13,14 ml tionylchloridu. Po skončenom pridávaní sa teplota zmesi zvýši na 45 °C. Po 16 hodinách zostáva menej než 0,5 % plochy pod krivkou pre kyselinu sulfónovú. Zmes sa ochladí na 0 až 5 °C. Do banky s objemom 1 liter sa vloží 325 ml vody a banka sa ochladí na 0 °C. Chloračná zmes sa potom pridá po kvapkách v priebehu 30 minút k dobre miešanému roztoku tak, aby vnútorná teplota zmesi zostávala nižšia než 5 °C. Zmes sa mieša ešte 45 minút a potom sa prefiltruje. Vlhký filtračný koláč sa premyje 10 ml studenej vody a potom sa suší v prúde dusíka. Do banky s objemom 250 ml s magnetickým miešadlom a termočlánkom sa vloží 24 ml vodného amoniaku a 43 ml THF. Zmes sa ochladí na -10 °C a potom sa pridá surový vlhký tuhý sulfonylchlorid po častiach v priebehu jednej hodiny tak, aby vnútorná teplota zmesi bola udržovaná pod 0 °C. Po 2 hodinách zostáva menej než 1,8 % sulfonylchloridu. Prebytok amoniaku sa neutralizuje 50 ml vodnej kyseliny chlorovodíkovej. Vodná vrstva sa dvakrát premyje THF. Extrakty sa spoja a odparia. Získaný materiál sa znova uvedie do suspenzie v THF a opatrne sa pridáva voda. Vytvoria sa hnedé kryštáliky v žltom vodnom roztoku. Zmes sa prefiltruje a kryštáliky sa vysušia vo vákuu. Vo výťažku 66 % sa získa 5,58 g acetamidosulfónamidu.
Stupeň 3
4,21 g, 11,5 mmol acetamidosulfónamidu sa vysuší destiláciou s 2 x 100 ml THF v banke s objemom 250 ml, vybavenej magnetickým miešadlom, termočlánkom a prívodom na dusík. Suspenzia acetamidosulfónamidu v 22,5 ml tetrahydrofuránu sa potom ochladí na teplotu 0 až 5 °C. Potom sa k suspenzii po kvapkách v priebehu 45 minút pridá 51 ml, 51 mmol komplexu boranu a tetrahydrofuránu, pričom vnútorná teplota zmesi sa udržuje na hodnote nižšej než 5 °C. Hneď ako sa prestane vyvíjať vodík, čo trvá približne 20 minút, zahreje sa vzniknutý roztok na teplotu v rozmedzí 30 až 35 °C. Po ukončení reakcie, približne po 3 hodinách sa reakčná zmes ochladí na teplotu miestnosti. Do banky s okrúhlym dnom s objemom 250 ml, vybavenej magnetickým miešadlom, termočlánkom a prívodom na dusík sa vloží 60 ml kyseliny sírovej a obsah banky sa ochladí na teplotu 0 až 5 °C. Reakčná zmes sa potom opatme po častiach pridáva do energicky miešaného roztoku kyseliny tak, aby vnútorná teplota zmesi bola udržovaná pod 20 °C. Po skončenom pridávaní sa zmes mieša pri teplote miestnosti tak dlho, až sa prestane vyvíjať vodík. Potom sa obsah banky destiluje za atmosférického tlaku a zmes sa odparuje tak dlho, až je jej vnútorná teplota nižšia než 97 °C. Po ukončení destilácie sa zmes ochladí na 20 °C. Potom sa zmes neutralizuje vodným roztokom hydrogenuhličitanu draselného a extrahuje 100 ml etylacetátu. Organická vrstva sa odparí, čim sa získa 3,45 g 5,6-dihydro-6(S)-propyl-4(S)-l-etylamino-4H-tieno[2,3-b]tiopyran-2-sulfónamid-7,7-dioxidu.
Príklad 4
Bunky Rhodotorula piliminae ATCC 32762 uložené na Sabouraudovom agare s dextrózou v kultúrach pri 4 °C boli použité na naočkovanie 250 ml baniek obsahujúcich 50 ml očkovacieho média. Banky boli inkubované za aeróbnych podmienok pri 28 °C na orbitálnej trepačke pri 220 otáčkach/minútu. Banky (250 ml) obsahujúce 50 ml rastového média boli naočkované s 1 ml, 24 hodín starou očkovacou kultúrou a za aeróbnych podmienok inkubované pri 28 “C na orbitálnej trepačke pri 220 otáčkach/minútu (2 ink. trepania). Ketosulfón rozpustený v etanole bol pridaný do každej banky po 20 hodinách inkubácie na získanie koncentrácie etanolu 20 ml/1 a koncentrácie ketosulfónu 0,66 g/1. 24 hodín po pridaní ketosulfónu boli banky zozberané a tekutý roztok kultúry bol extrahovaný a analyzovaný tenkovrstvovou chromatografiou a vysokotlakovou chromatografiou na prítomnosť hydroxysulfónu. Výsledky ukazujú úplnú redukciu ketónu so vznikom 84 % trans-hydroxysulfónu.

Claims (5)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    d) atóm vodíka alebo
    e) alkoxyalkyl s 1 až 4 atómami uhlíka v každej časti, vyznačujúci sa tým, že sa pestuje mikroorganizmus Rhodotorula rubra ATCC 74283 alebo Rhodotorula piliminae ATCC 32762 v živnom prostredí, ktoré obsahuje využiteľné zdroje dusíka a uhlíka a substrát, sulfoketón všeobecného vzorca (III) kde R1 znamená
    a) alkyl s 1 až 5 atómami uhlíka s priamym alebo rozvetveným reťazcom, zvlášť «-propyl alebo izobutyl,
    b) alkenyl s 3 až 5 atómami uhlíka, zvlášť alyl,
    c) alkinyl s 3 až 5 atómami uhlíka, zvlášť propargyl,
    d) atóm vodíka alebo
    e) alkoxyalkyl s 1 až 4 atómami uhlíka v každej časti, v živnom prostredí za aeróbnych podmienok do nahromadenia zlúčeniny všeobecného vzorca (II), ktorá sa potom izoluje.
  2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že sa použije mikroorganizmus Rhodotorula rubra, ATCC 74283, substrát sa rozpustí v etanole, metanole alebo DMSO v koncentrácii 1 až 15 % objemových a pridáva sa v množstve 1 až 3 g/1.
  3. 3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa t ý m , že sa substrát rozpustí v DMSO v koncentrácii 1 až 3 % objemové a pridáva sa v množstve 1 až 3 g/1.
  4. 4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že sa fermentácia uskutočňuje pri teplote 20 až 50 °C a pri pH 4,5 až 8,0.
  5. 5. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t v m , že sa fermentácia uskutočňuje pri teplote 30 až 35 “C a pri pH 5,5 až 6,5.
    Koniec dokumentu
    1. Spôsob prípravy /rans-hydroxysulfónu všeobecného vzorca (II)
    A znamená atóm uhlíka a
    R1 znamená
    a) alkyl s 1 až 5 atómami uhlíka s priamym alebo rozvetveným reťazcom, zvlášť «-propyl alebo izobutyl,
    b) alkenyl s 3 až 5 atómami uhlíka, zvlášť alyl,
    c) alkinyl s 3 až 5 atómami uhlíka, zvlášť propargyl,
SK315-97A 1994-09-13 1995-09-08 Spôsob prípravy trans-hydroxysulfónu SK283028B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/305,110 US5474919A (en) 1994-09-13 1994-09-13 Bioconversion process for the synthesis of transhydroxy sulfone by Rhodotorula rubra or Rhodotorula piliminae
PCT/US1995/011243 WO1996008577A1 (en) 1994-09-13 1995-09-08 Bioconversion process for the synthesis of trans-hydroxy sulfone

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK31597A3 SK31597A3 (en) 1997-10-08
SK283028B6 true SK283028B6 (sk) 2003-02-04

Family

ID=23179375

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK315-97A SK283028B6 (sk) 1994-09-13 1995-09-08 Spôsob prípravy trans-hydroxysulfónu

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5474919A (sk)
CN (1) CN1057796C (sk)
AU (1) AU3464195A (sk)
BR (1) BR9508921A (sk)
CZ (1) CZ289030B6 (sk)
FI (1) FI971035A0 (sk)
RU (1) RU2134296C1 (sk)
SK (1) SK283028B6 (sk)
TW (1) TW384310B (sk)
UA (1) UA42024C2 (sk)
WO (1) WO1996008577A1 (sk)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2093980T3 (es) * 1992-08-28 1997-01-01 Zeneca Ltd Proceso de reduccion asimetrica, enzimatica, para producir derivados de 4h-tieno(2,3-6)tiopirano.
WO1996020189A1 (fr) * 1994-12-28 1996-07-04 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Procede de production d'un derive d'acide carboxylique
ES2155539T3 (es) * 1994-12-28 2001-05-16 Kanegafuchi Chemical Ind Procedimiento para producir un derivado de acido carboxilico.
US5900368A (en) * 1996-09-17 1999-05-04 Merck & Co., Inc. Process for bioreduction of bisaryl ketone to bisaryl alcohol
ES2177415B1 (es) * 2000-09-04 2004-10-16 Ragactives, S.L. Procedimiento para la obtencion de 4-alquilamino-5, 6-dihidro-4h-tieno-(2,3b)-tiopiran-2-sulfonamida-7-dioxidos, e intermedios.
US20050059583A1 (en) 2003-09-15 2005-03-17 Allergan, Inc. Methods of providing therapeutic effects using cyclosporin components
WO2006074230A2 (en) * 2005-01-06 2006-07-13 Teva Gyógyszergyár Zártkörüen Müködö Részvénytársaság Method of making dorzolamide hydrochloride
JP2008526780A (ja) * 2005-01-18 2008-07-24 テバ ジョジセルジャール ザ−トケルエン ムケド レ−スベニュタ−ルシャシャ−グ ドルゾルアミド塩酸塩の非晶質および結晶質の形態およびそれらを製造する方法
JP2010526127A (ja) * 2007-05-07 2010-07-29 シプラ・リミテッド ドルゾラミドの製造方法
US8927740B2 (en) 2011-03-10 2015-01-06 Zach System S.P.A. Asymmetric reduction process

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4797413A (en) * 1986-05-14 1989-01-10 Merck & Co., Inc. Thieno thiopyran sulfonamide derivatives, pharmaceutical compositions and use
US5371014A (en) * 1988-02-12 1994-12-06 Daicel Chemical Industries, Ltd. Process for the production of optically active 2-hydroxy acid esters using microbes to reduce the 2-oxo precursor
US4968815A (en) * 1990-04-16 1990-11-06 Merck & Co., Inc. Synthesis of (S)-3-(thien-2-ylthio)butyric acid analogs
US4968814A (en) * 1990-04-18 1990-11-06 Merck & Co., Inc. (S)-Alkyl 3-(thien-2-ylthio)butyrate and analogs and synthesis thereof
US5157129A (en) * 1990-04-18 1992-10-20 Merck & Co., Inc. Enantiospecific synthesis of s-(+)-5,6-dihydro-4-(r-amino)-4h-thieno(2,3-b)thiopyran-2-sulfonamide-7,7-dioxide
US5091409A (en) * 1990-05-17 1992-02-25 Merck & Co., Inc. 4-alkylamino-6-(C3-5 -hydrocarbyl)thieno[2,3-B]thiopyran-2-sulfonamide-7,7-dioxides
DE69123041T2 (de) * 1990-08-10 1997-04-03 Daicel Chem Herstellungsverfahren für optisch aktiven 3-phenyl-1,3-propandiol
US5352579A (en) * 1991-06-28 1994-10-04 Gen Probe, Inc. Nucleic acid probes to histoplasma capsulatum
ES2093980T3 (es) * 1992-08-28 1997-01-01 Zeneca Ltd Proceso de reduccion asimetrica, enzimatica, para producir derivados de 4h-tieno(2,3-6)tiopirano.
JP3279671B2 (ja) * 1992-09-28 2002-04-30 鐘淵化学工業株式会社 チエノチオピラン誘導体の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
TW384310B (en) 2000-03-11
FI971035A (fi) 1997-03-12
FI971035A0 (fi) 1997-03-12
AU3464195A (en) 1996-03-29
UA42024C2 (uk) 2001-10-15
WO1996008577A1 (en) 1996-03-21
US5474919A (en) 1995-12-12
BR9508921A (pt) 1997-09-30
CZ289030B6 (cs) 2001-10-17
CZ77497A3 (en) 1997-07-16
SK31597A3 (en) 1997-10-08
RU2134296C1 (ru) 1999-08-10
CN1162980A (zh) 1997-10-22
CN1057796C (zh) 2000-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR930010705B1 (ko) Fr-900520 물질의 제조방법
NO136756B (sk)
SK283028B6 (sk) Spôsob prípravy trans-hydroxysulfónu
CA1301684C (en) Aureobasidium sp. microorganisms, method for obtaining the same,and method for preparing erythritol with the same
FI90663C (fi) Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten makrolidiyhdisteiden valmistamiseksi
WO1993022445A1 (en) A process for producing pioglitazone metabolite
JP3333206B2 (ja) 不斉還元方法
AU665860B2 (en) Novel thiomarinol derivatives, and processes for their preparation
US4933289A (en) Biologically pure cultures of Pseudomonas sorbosoxidans useful for producing 2-keto-L-gulonic acid
US5352783A (en) Microbial transformation product having immunosuppressive activity
EP1062358B1 (fr) Nouveau procede de preparation de la fexofenadine
US5516690A (en) Ketoprofen resolution by ester hydrolysis using Trichosporon laibacchii
US5290772A (en) Immunosuppressant agent
CA2093525A1 (en) Microorganism and process for obtaining anthranilic acid
JPH05137585A (ja) エリスリトール連続培養法
DE69839248T2 (de) VERFAHREN FÜR DIE HERSTELLUNG VON INHIBITOREN DER HMG-CoA-REDUKTASE.
AU655698B2 (en) Process for producing optically active norborneol
EP2287324A2 (en) Fermentation processes with low concentrations of carbon- and nitrogen-containing nutrients
US4661352A (en) WS 7739 substances, their preparation and pharmaceutical composition containing the same
US5283183A (en) Cyclic FR-900520 microbial biotransformation agent
CA1172191A (en) Process for preparing mycarosyltylactone
FR2550549A1 (fr) Nouvelle souche produisant de la clavine, procede pour sa preparation, ainsi qu'un procede microbiologique de production d'alcaloides de la clavine
WO1999024439A1 (fr) Nouvelle substance ft-0554 et procede de fabrication
US3182004A (en) Production of fungimycin
EP0478235A3 (en) A directed biosynthesis for an immunomycin derivative