TW384310B

TW384310B - Bioconversion process for the synthesis of transhydroxy sulfone

Info

Publication number: TW384310B
Application number: TW084109539A
Authority: TW
Inventors: Michel M Chartrain; Lorraine G Katz; Steven A King
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1994-09-13
Filing date: 1995-09-12
Publication date: 2000-03-11
Also published as: US5474919A; SK31597A3; BR9508921A; CZ289030B6; CN1057796C; RU2134296C1; CZ77497A3; UA42024C2; AU3464195A; WO1996008577A1; FI971035A; SK283028B6; FI971035A0; CN1162980A

Description

A7 B7 五、發明説明（1 ) 發明背景青光眼是一種眼内壓升高的眼科疾病，對於眼睛的正常功能而言，其限内壓太高，且可能會導致視力不可逆的喪失》如果不治療的話，青光眛最後可能會導致失明。許多限科醫生認爲高眼麈也就是説視神經頭沒有損傷而眼内壓升高的情沉^或者有特徵的青光限視力範困缺陷，係爲青光取的早期症狀。化合物的結構式： ,1. * —ml n m i^i --I— I (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁)

Z

翅濟部中央揉牟局負工3F费合作杜印製單獨的非對映異構物、單獨的對掌物或其混合物，或是眛科學上可接受之盪類，其中該： A爲碳或氮； Z 爲 NHR或-OR; R爲一個碳至六個碳的烷基，可爲直鏈或支键； R1爲 a) —個碳至五個破的烷基，可爲直鏈或支鏈，特別爲正_ 丙基或異丁基； b) 三個瓖至五個破的晞基，特別爲晞丙基； c) 三個碳至五個破的块基，特別爲块丙基； d) 氫；或本紙張尺度適用中國國家標芈（CNS > A4規格（210X297公釐） A7 _^_B7__ 五、發明説明（2 ) e) —個碳至四個碳的烷氧基-C^烷基；和 X爲-S02-或-C0-; 係從美國專利4,797,413和5，157，129中得知。此化合物爲局部效用分解碳酸酶抑制劑（TCAPs)，可以用來治療眼内壓過高。化合物的合成涉及將磺基一酮還原成前述化合物之反式-羥基飆前處體。然而，製備該化合物之合成法會生成非對映或者外消旋產物，必須將其分離並溶解，伴随至少 50%的產物損失，才能得到旋光性最強之對掌物》而現在本發明係提供一個嶄新的微生物法，將磺基一酮中間體轉換成反式-羥基颯中間體的生物轉換法。發明摘述本發明係關於反式-羥基磡之嶄新微生物轉換合成法，反式-羥基颯之結構式如下：

QH

II 經濟部中央樣準局負工消费合作杜印装 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 其中Α和R1如前所述。反式-羥基颯爲最終產物之前驅腫，最終產物係爲分解碳酸酶抑制劑，前述之結構式I。該最終產物在治療眼内壓過高和青光眼，係局部有效的。該方法包括有微生物紅酵母屬（Rhodotomla)之深紅酵母 (Rhodotorula rubra)(ATCC 74283)或果規紅酵母（Rhodotorula piliminae)(ATCC 32762)存在時，以深紅酵母較佳，磺基-酮 -5 - 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210X297公釐）輕濟部中央標準局貝工消费合作杜印装 A7 ___ _B7__ 五、發明説明（3 ) 基質發酵《有氧狀況下，於含有氮營養素之水溶性碳水化合物培養基中，pH値約4.5至8.0，係以6.0較佳，完成生物轉換，生產結構式II之化合物。所得之反式-羥基飆類似物顯示出非鏡像異構物超過95% 。於此嶄新方法中的關鍵步驟（亦即控制羥基諷之非鏡異構物之超過量）彡係爲控制在生物轉換反應培養基之殘留磺基酮濃度。因此，本發明之目的係提供一個反式-羥基諷中間體之微生物合成法® 發明之詳細説明本發明係W於合成結構式如下之化合物：

OH II .反式·羥基風其中該A爲碳或氮且R1爲： a) (：卜5燒基，可爲直鏈或者支鏈，特別爲正-丙基或異丁基； b) C3_5烯基，特別爲烯丙基； ^ c) C3_5炔基，特別爲炔丙基； d)氩；或 .e) Ch坑氧基坑基’ 其中結構式I之化合物的前驅醴： -6- 本紙張尺度適用中國國家橾窣（CNS ) A4规格（210X297公釐） K---£------------1T------ο {請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 五、發明説明（ A7 B7

Z

S〇2NHj 單獨之非對映異構物，單獨的對掌物或其混合物，或眼科學上可接受之’鹽類，其中該： A爲碳或氮； z 爲 NHR或-OR; 反爲<^_6坡基，可爲直鏈或支鏈； R1爲 a) C1-5烷基可爲直鏈或支鏈，特別爲正-丙基或異丁基; 特別爲烯丙基；特別爲块丙基； d) 氳；或 e) c1-4乾氧基-Cp4烷基；和 X 爲-so2-或-c(o)-; 本發明之新穎方法包括受質化合物ΙΠ存在下，微生物紅時母屬之果蠅紅酵母或深紅酵母發酵，以深紅酵母較佳，化合物III如下所示： b) C3_5烯基 c) C3_5块基 L----------10¾.-- (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁) 訂經濟部中央棣牟局K工消费合作杜印裝

本紙張尺度適用中㈣家標率（CNS ) Α4规格（2丨GX297公釐 A7 __^__B7______ 五、發明説明（5 ) 其中該R2爲 a) <^_5烷基，可爲直鏈或支鏈，特別係爲正-丙基或異丁基； b) C3_5締基，特別爲埽丙基； c) C3_5炔基，特別爲块丙基； d) 氫；或’ e) 坑氧基坑基係於營養培養基中，有氧的情況下發酵，直至大量之化合物II生成爲止，且以傳統的方法分離該化合物。結構式I的化合物可以用來治療青光眼。本發明之較佳具體實施例中，其中結構式π代表之化合物係爲結構I所代表之化合物I之前軀饉： L I------o^--- (請先閲讀背面之注f項再填寫本篾) 訂

QH

經濟部中夹橾準局員工消费合作社印蓑其中該Α爲碳或氮且R1爲： a) Cp5烷基，可爲直鏈或支鏈，特別是爲正丙基或異丁基； b) C3_5缔基，特別爲烯丙基； c) C3_5決基，特別爲炔丙基； d) A;或 e) Ch坑氧基-Ch坑基’ -8 - ^紙張尺度適用中國圃家標準（cns ) a4規格（2丨0x297公*) A7 B7 五、發明説明（β

so2nh2 單獨之非對映異構物，單獨的對掌物或其混合物，或眼科學上可接受之霣類，其中該： A爲破或氮；* Z 爲 NHR或-OR; R爲（：卜6坑基，可爲直鏈或支鏈； R1爲 a) 0卜5烷基，可爲直鏈或支鏈，特別爲正-丙基或異丁基； b) C3_5烯基，特別爲烯丙基； c) C3_5炔基，特別爲炔丙基； d) 氫；或 e) (：卜4烷氧基-Ch烷基；和 X爲-so2-或-0(0)-; 包括在營養培養基中於好氧狀沉下，培養深紅酵母，ATCC 74283，#營養培養基包含可同化的氮源、破源和受質化合物 III: (請先《讀背面之注f項再填寫本頁) IBM-· m ^^1 .....1 f^i UK. l· - - -1 1 -- - I— · 訂經濟部中央榇隼局貝工消费合作社印*. 其中該R2爲

-9 本紙張尺度適用t國國家橾隼（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標率局貝工消费合作杜印装 A 7 _B7____ 五、發明説明（7 ) a) Cy烷基，可爲直鏈或支缝，特別爲正-丙基或異丁基; b) c3_5烯基，特別爲烯丙基； c ) C3_5炔基，特別爲块丙基； d) 氩；或 e) CL_4烷氧基-Ch烷基直至有大量之化合物II生成爲止，並將所生成之化合物分雞出來，其中受質溶於體積百分比约1%至15%的乙醇、甲醇或二甲亞諷中，同時填充之受質用量每升約1至3克，溫度約從20至50eC，且pH値約4.5至8.0» 可以下非限制之方式合成受質化合物IIL· 甲基3(R)-巍某己酯利用甲醇（75毫升）和0.2N鹽酸（2毫升）稀释甲基3-己酮酯 (44.7克，310毫莫耳）。加入Et2NH2+Ru2Cl5-(BINAP)2(200毫克），同時在100磅/平方英寸（psi)壓力之氫氣下，將混合物於60eC下加熱2小時》加入甲苯（200毫升)且將混合物濃缩成油脂重75公克。甲基3(R)-甲苯磺氣己酯甲基3(R)-羥基己酯的原溶液（310毫莫耳）溶於吡啶（1〇〇毫升）中，並加入甲苯續醯氣（59公克，310毫莫耳）。在5°C下，將混合物攪拌24小時，然後於15eC下攪拌16小時。緩缓加入水（5毫升），要超過1小時，使得過量的試劑驟冷。將混合物倒入20%甲苯/己烷（600毫升）中，並以水清洗（3 X 250毫升）。將有機層濃縮，以得到83公克的油狀產品，其純度達 95%。 -10- CNS〉Λ4規格(210乂297公*1 (請先閲讀背面之注項再填寫本頁) 訂 A7 B7 五、發明説明（8 ) 甲基3(SV(2-瓖吩硫）己酯於-20°C下，將正·丁基鋰（1·64Μ，97·6毫升，160毫莫耳）加到溶有《•塞吩（15.1公克，180毫莫耳）的四氫咬味（1〇〇毫升）中。攪拌30分鐘後，將硫一份一份地加入（硫5.23克）》1小時後加入去氧甲醯胺（1〇〇毫升），接著加入甲基-3(R)-甲苯磺氧己酯（40公克，33.3毫莫耳）。在室溫下，將混合物攪拌 24小時，然後利用乙酸乙酯（100毫升）和水（50毫升）將該混合物稀釋》相層分離，且利用乙酸乙發（100毫升）反萃水溶液層。將综合的有機層濃縮，得到重23.9公克之黃色油脂產品。從甲基3-己玥酯之總產率爲74%。 5.6- 二氳-6(SV(丙基）-4H-巉吩f2,3bl硫吡喃·4·酮於100°C下，將曱基3(S)-(2-嘍吩硫）己酯（125公克，513毫莫耳）舆黯酸（150毫升）及濃鹽酸（150毫升）加熱96小時》利用甲苯（2X 300毫升）萃取混合物。清洗综合的有機層，並且濃縮以得到深棕色的油脂，該油脂溶於甲苯（1200毫升）中，保護該油脂。將混合物冷卻至〇°C，並加入無水三氟醋酸 (126公克，600毫莫耳）。45分鐘後，利用清水（2X 200毫升）清洗混合物），並濃缩得到151公克的油脂，該油脂不需進一步純化即可在下步驟中使用〇經濟部中央橾準局工消费合作社印#. --—1·^— »11-- 1—1 n i 0 I.----- H (請先Μ讀背面之注f項存填寫本頁) 5.6- 二氩-6(8)-(丙基）-4{1-違吩丨2,31>1硫吡喃-4-酮-7,7-二氧化 5,6-二氩-6(S)-(3-丙基）-4H-違吩 P，3b]硫吡喃-4-酮（4.25公克，20毫莫耳）溶於乙酸乙酯（80毫升）中。加入鎢酸鈉（660 毫公克，2毫莫耳），30%過氡化氩（8.2毫升，80毫莫耳）和10 -11- 本紙*尺度逋用中國國家棣準（CNS 规格（2丨0 X 297公釐）

第84109539號專利申請案中文説明書修正頁(85年11月） A7 _B7 五、發明説明（9 ) 滴硫酸。24小時後，利用乙酸乙酯（1〇〇毫升）稀釋反應，且以1 0 %之Na2S〇3(亞硫酸鈉）溶液和飽和之NaHC〇3(碳酸氫鈉）溶液清洗之。將有機層濃缩，並利用乙醇碾製，得到產品4.5公克的產品（95%)。微生物果蠅紅酵母的生物純菌種樣品係自夏威夷Drosophila pilimanae(果壤）的幼蟲中分離得到的，且依照巴德貝斯特條約（Budapest Treaty)，得自現址爲馬里蘭 Rockville parkawn Dvive 12301號的美國菌種保存中心（American Type Culture Collection)中，所收集的純菌株，其登錄號瑪（Accession Number)爲ATCC 32762。深紅酵母的純菌種樣品係來自現址位爲馬里蘭Rockville Parklawn Drive 123 01號的美國菌種保存中心，其登錄號碼爲ATCC 74283 »專利特許中，任何接觸微生物的限制都必須要切實遵守。深紅酵母ATCC 74283係自受污染之酸乳油中分離得到的。雖然沒有限制分枒方法，但是於本發明所採用之分析方法如下：分析方法生物量測量 , 利用光密度和細胞乾重（CDW)測量生物量。利用休雷培卡（Hewlett Packard)8451A二極雄组分光光度計於660毫微米下進行光密度測量。利用微孔（Millipore)過濾器型號HA，孔洞0.45微米，測量細胞乾重。葡萄糖 * -12· 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS > A4规格（210X297公釐） I!-----〇裝------訂^-------- (請先《讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中夾搮準局貞工消费合作社印製 A7 B7 五、發明説明（10 ) 利用配備有麥金塔（Macintosh)標準電腦的液相層析儀來控制葡萄糖，同時電腦可以收集數據’液相層析儀尚配備有折射指數偵測器，A1-2雷曼克斯（Dynamax)自動注射器’ 分析HP泵，廢力模和拜爾瑞阿密内克斯（Biorad Aminex) HPX-87H離子排除管柱毫米）、該管柱於6〇C下加熱β溶析液之速度爲每分鐘0.7毫升，包括0.005M(莫耳容積）之硫酸。培養液萃取利用加入等嫌積之乙酸乙箱來萃取培養液° ;昆合液在振盪器内放置5分鈸，然後利用貝克曼（Beckman)TJ·6離心機以每分妓2000轉之速度離心10分錢。將所得之上發液乾燥’ 並再懸浮於甲醇中，以便能進行薄層層析法或HPLC分析° 薄層層析法採用奇斯爾（Kiesel)银覆碎膝薄層層析板F254。移動相包括94 %二氣甲恍、5%甲酵和1 %氩氡化按。將樣品難在板上並乾燥之。板的一端浸在移動相中，而溶劑往上移動至離板之頂端約一英寸爲止β 高效液相層析法利用瑞米（Rainin)系統進行HPLC分析，該系統配備有麥金塔標準電腦進行控制及收集數據，代雷曼克斯吸光偵洲器 UV-M、A1-2代雷曼克斯自動注射器，兩個分析HP泵，一個有若拔克斯（Zorbax)RX-C8管柱（4.6X 250毫微米）之磬力模，該管柱維持於室溫。該方法採用二個溶析液，甲酵和水 (0.1%WvH3P〇4)於综合流速爲每分鐘1.5毫升，並且在254 -13 ~ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )A4%格（210X297公瘦） KH- f — m - ί I— ^1» n (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 灯經濟部中央標準局貞工消费合作社印氧經濟部t央標準局貝工消费合作杜印装 A7 _________B7_ 五、發明説明（11) 毫微米偵测紫外線°該方法包括約15分鐘將30/70之甲醇/酸性水（v/v)之溶液，梯度變成70/30(v/v)。以70/30(v/v)之濃度維持15分鐘，然後5分鐘内均衡變化成3〇/7〇(v/v)之溶液。此方法可分別在9.5分，1〇分鐘和12.8分鐘的時候，分離出順-羥基颯，反-羥基颯和硪基酮。反式-羥基破的生成，例如在篩網或者振盪燒瓶培養，深紅味母ATCC 74283開始係接種自斯伯瑞（jgabouraud)葡萄糖斜面培養或稍後接種自冷凍甘油細胞懸浮液（1毫升）1至含有 50毫升斯伯瑞葡萄裱培養液之250毫升耳連美爾（Erl enmeyer) 燒瓶中。市面上可以購得斯伯瑞葡萄糖培養液，並且每公升含有10公克迪弗可（DifC0)新蛋白脒和20公克貝投（Bacto) 葡萄糖。燒瓶於28°C下培養24小時，並以每分錢220轉（220 rpm)攪拌，才能夠有足狗的生物量做爲接種鳢^接種醴 (5%/25毫升）轉接種至含有5〇〇毫升斯伯瑞葡萄糖培養液之2 公升耳連美爾燒瓶中。接著，菌種在28eC，每分鍾180轉的速度下，培養42小時》在添加磺酮之前，細胞離心，再以 pH 6.0之MES緩衝溶液清洗，並再懸浮於pH 6.〇之MES緩衝溶液中。在23公升之發秫槽中進行生化反應器培養，如前所描述之培養42小時，於2升燒瓶中包含有深紅酵母ATCC 74283 之斯伯瑞葡萄糖培養液接種在該發酵槽中。發酵槽參數如下：溫度28X：，每分鐘200轉之速度攪拌（最低設定點），通氣 -14- 本紙張尺度適用中國國家棣率（CNS ) Λ4規格（210X297公瘦） HI 1- Γ - am ί: I (請先聞讀背面之注$項再4寫本頁) 订經濟部中央標準局貝工消费合作杜印製 A7 B7 — — ———— — " 一五、發明説明（12 ) 速度爲每分鐘10公升，且逆麈爲0.6磅/平方对（pSi)。利用樣拌來控制溶氧溶壓，至少爲40%。當氧氣辑取速度（〇UR)降至5毫莫耳/公升/小時以下時，利用無菌狀態收護細胞。反應參數最適生物轉化參數係爲採用3 -[N·氧氮陸固】丙磺酸（MOPS) 或2-[N-氧氮陸園]乙磺酸（MES)緩衝溶液（〇.5M)、在約20°C 至40eC，pH範圍在4.5至8.0，所得之生物轉化率爲约0.011 公克/公克€0\^/小時至〇.150公克/公克00\^/小時。溫度範困約從20*C至50eC，係以約從30Ό至35eC較佳。用以溶解磺基酮之溶劑及用量分別爲乙酵、甲蜉或DMSO，係以1% 至15%v/v之DMSO較佳，又以1%至3%較佳（DMSO:二甲亞風）。引入之基質用量每升約從1公克至3公克，每升1.5公克較佳，可完成反式-羥基砜（66%)的回收，其中超過95%爲非對映異構物；且細胞年齡約16至60小時，約40至60小時較佳，和OUR降至5毫莫耳/公升/小時以下符合。反式-羥基颯11(5,6-二氧-4(8)-羥基-6(3)-丙基-411-喳吩-[2,31)】疏吡喃7,7-二氡化物之生物碑換及分離〕_ 利用貝克曼TJ-6離心機，以4000轉/分鐘的速度，將含有 Rhototorulo rubra細胞之培養液之整分部份（1_〇或5〇毫升）離心10分鐘，並且上澄液傾析。沈澉物再懸浮於PH 6 0之 0·5Μ2-[Ν-氧氮陸國]乙磺酸（MES)緩衡溶液中，並且再次離心。經清洗之細胞再懸浮於50毫并MES緩衝溶液中。若是需要的話，細胞可以稀釋以便能得到較佳之生物轉化反應速率數據。將與1克/升乏純磺基酮等值之相續基明（純度 -15- 張尺度適阀中國國家標準（CNS ) Λ4规格（210X297公*7

Hr-----Ο装—— (请先聞请背面之注$項再填寫本頁) 订. A7 B7 五、發明説明（13 ) 56%)溶於乙醇中（3%醴積比），並加至含有經清洗的細胞之燒瓶中。燒瓶於32.5X的水浴褙中培養，該水浴槽持續地振盪。利用氣仿（1:1體積比）萃取或者以乙酸乙酯（1:1禮積比）乾燥的方式收獲培養液，並且再次懸浮於甲醇中。萃取液然後經薄層層析法或高故液相層析法（HPLC)分析》反式-羥基域，順式-樂基諷和磺基明之HPLC滯留時間分別爲9.5， 10.0和12.8。反式-羥基諷之1H NMR(核磁共振）結果如下 (250 MHz, CDC13)： 7.58(d, J=5.1 Hz, 1H), 7.08(d, J=5.1 Hz, 1H), 4.94(t, J=3.6Hz, 1H), 3.66(m, 1H), 2.6-2. l(m, 3H), 1.7-1.5(m, 3H), l.〇l(t, J=7.01, 3H) » M濟部中央標準局属工消费合作杜印輩 ^,-------------ir-----上 (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁> 當OUR降至5毫莫耳/公升/小時以下時，可以收獲生物反應器培養的細胞，並將其離心，同時以pH 6.0之0.5M MES 緩衝溶液清洗。細胞再次懸浮於pH 6.0之0.5 MES緩衝溶液中，並且再回去發酵褙中。爲生物轉化而將發酵槽之麥數設定如下：溫度32.5eC，以每分鐘400轉之速度攪拌，每分鐘通氣量爲6公升且反壓爲0.6磅/平方吋（psi) »將磺基酮（1.5克 /公升）溶在DMSO中，並加至發酵槽中（3%體積比）。定期取樣，並以HPLC來監測其生物轉化活性〃生物轉化率爲1.14 克/公升/小時或0.126克/克CDW/小時，同時反式-羥基璣之最终產率爲1.04克/公升-1時，於收獲的時候可達到96.4%非對映異構物的過量。利用乙酸乙酯（0.5:1，體積比）萃取培養液，且以迴轉式蒸發器來濃缩溶劑相。實例2 -16- 本纸張尺度適用中國國家橾芈（CNS > Λ4规格（210X297公瘦） / 經濟部中央標準局員工消费合作社印簟 A7 B7 五、發明説明（14 ) 反式-羥基硪（5,6_二氧-4(S)-羥基-6(S)-甲基-4H-嘍吩-[2,3b】藏吡喃7,7二氧化物之生物轉換法 ___ 採用在4°C下，保存在斯伯瑞葡萄糖洋菜斜面培養基中之菌種ATCC 74283的細胞，將其接種於包含50毫升斯伯瑞葡萄糖培養液之250毫升耳連美爾燒瓶中。於28°C振盪的情況下，培養20個小時後，溶於乙酵之磺基酮（33.3毫克/毫升）加至燒瓶中（每個燒瓶加入1毫升）》菌種再以相同之培養條件培養24小時》利用氣仿自培養液中萃取殘留的磺基酮和產生的羥基躐。TLC和HPLC的分析可知磺基酮轉換成反式_ 羥基碱之總轉換率。NMR的分析可確定反式-羥基飆的結構： δ 7.6(d, 1H, C2-H), 7.1(d, 1-H, Cg-H), 4.9(m, 1H, C^H), 3.8 (m, 1H, C6-H), 3.5-3.0(br s, 1H, OH), 2.6(m, 1H, Cg-H), 2.4 (m，1H, C5-H), 1.5(d, 3H, C6-CH3)。實例3 以製播結構I之化合物[5,6-二氩-6-(S)-丙基- 4(S)-1-乙胺基 •4Η-»塞吩-[2,3b]硫-吡喃-2-磺醣胺7,7-二氧化物】之方法爲實例，其方法如下:____ '±MlL 程序：反式-幾基域（7.32克，29.7毫莫耳）懸浮於氰甲烷（μ毫升）中，該氰甲燒置於100毫升的圓底燒瓶中，該圓底燒瓶配有磁攪拌棒，熱電偶探針和氮氣入口將溶液冷卻至，且將硫酸（5毫升，88.7毫莫耳）一份加入。然後在室溫下攪拌反應混合物。將混合物冷卻至〇_5C。將水（34毫升）和乘甲烷（43毫升）裝填至一個500毫升的燒瓶中，接著將混合物冷 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 〇·裝· •17 A7 B7 384310 五、發明説明（15 ) 卻至0-5eC，並且攪拌均勻。小心翼翼地將反應混合物加入其中，如此才能將中止溫度維持在低於5°C »然後加入飽和的破酸鉀（30毫升）直至水層之pH在7-8間或者不再有二氧化碳釋出爲止。將有截層濃縮成粗油脂材料（14.1公克）其重量百分比爲42.5%。產率爲5.99公克（73%)。步驟2:程庠: 一個配有磁攪拌棒和熱電偶探針的100毫升圆底燒瓶中，裝填氣磺酸（13.14毫升），且將該酸冷卻至0-5eC。將乙醯胺基續酸一份份地加入其中，要超過30分錢，如此内溫才會低於15°C »然後將時色之反應渑合物加熱至33eC 16小時，然後再加熱至50°C 5小時。當HPLC蘋示出少於0.5%之乙酿胺基磺酸（對磺酸和氯化磺酺）殘留時，將混合物冷卻至室溫。然後一滴滴地加入亞硫醯氣（13.14毫升）。當完全加入之後，將暗色蚝合物加熱至45eC。16小時後，會有低於5%面積之磺酸殘餘。混合物冷卻至〇-5eC »水（325毫升）倒入1公升之燒瓶中，並冷卻至〇eC »然後將氯化混合物一滴滴地加入攪拌均勻之驟冷溶液中，加入時間要超過30分鐘，如此内溫才能維持在51下 '混合物攪拌45分鐘，然後過濾。利用冷水（10毫升）清洗濕的濾餅，並且在流動的氮氣下乾燥。濃縮之氨水（24毫升）和THF(43毫升）倒入250毫升燒，中，該燒瓶配備有磁攪拌子和熱電偶探針。將混合物冷卻至約-10 °C。一份份地加入粗氣化磺醣濕固體，加入所花的時間要超過1小時，以便能維持内溫低於(TC »經過2小時^後，氣化磺醯會少於1_8%殘留。利用氫氣酸水溶液（約50毫升）來 -18 - 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS) Μ規格（2丨0X297公釐） ullr—II — — HI (請先閲讀背面之注f項再填寫本篾) 訂經濟部中夬標準局貞工消费合作杜印装 S843i0 經濟部中央搮準扃員工消费合作杜印簟 A7 B7_ 五、發明説明（1β ) 中和過量之氨。利用THF來清洗水層兩次。將THF層組合在一起，並且濃縮，材料再次懸浮在THF中，並小心地將水加入其中。會有棕色結晶形成，和黄色水溶液殘留》將混合物過濾，並且將晶雅眞空乾燥。乙醯胺基磺醯胺之產率爲 5.58公克（66%) » 步驟3: 程序：在250毫升燒瓶中，以和THF(2X 100毫升/份）蒸麴來乾燥乙醯胺基磺醯胺（4.21克，11.5毫莫耳）》燒瓶配備有磁攪拌子、熱€偶探針和氮氣入口。乙醯胺基磺醯胺懸浮在22.5 毫升THF中，然後冷卻至〇-5eC。一滴滴地將甲硼烷-THF(51 毫升，51毫莫耳）加入其中，加入時間要花费超過45分鐘，才能將内溫維持在5eC以下》氳氣释放完全（20分鐘）後，將溶液加溫至30-35°C »反應完全後（3小時），將混合物冷卻至室溫。將硫酸（60毫升）倒入一個配備有磁攪拌子、熱電偶探針和氮氣入口之250毫升圓底燒瓶中，同時冷卻至0-5X：。將反應混合物小心地倒入挽拌均勻之酸性溶液中，同時要將内溫維持在20eC以下》加入以後，在室溫下攪拌混合物，直到氯氣完全釋放爲止》然後將燒瓶置放以便能蒸餚〇大氣壓），且將混合物濃縮至内溫大於97X：爲止。蒸餹完全後，將混合物冷卻至20°C »然後利用碳酸氫鈉水溶液來中和混合物，並利用乙酸乙酯（100毫升）萃取之。將有機層濃縮而得到3.45公克之5,6-二氩-6-(S)-丙基-4(S)-1-乙胺基-4H-喳吩[2,3-b】硫吡喃-2-磺酿胺7,7-二氧化物β -19 - 本紙张尺度通用t國國家標準(CNS ) A4規格（2丨OX297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

384310 第84109539號專利申請案中文補充説明書(85年11月）實例4 將保存於4eC斯伯瑞(Sabouraud)右旋糖洋菜膠斜面培養之果塊紅酵母 (Rhodotorula piliminae)ATCC 32762接種至含50毫升原種培養基之250毫升燒瓶中。於281下，在220rpm之旋轉振盪器上有氧培養該燒瓶。將j 毫升經24小時培養之原種培養物接種至含50毫升生長培養基之燒瓶(250 燒叙)中，於28X下，在220rpm(2段式)旋轉振盪器上有氧培養之。經20 小時培養後，將溶於乙醇中之續基網加至各燒瓶中，使乙醇濃度爲20毫升/公升，磺基酮濃度爲0.66克/公升》於添加磺基酮24小時後，收集燒瓶中培養液’萃取之，以薄層層析分析，並以高效能層析分析羥基戚之存在。結果顯示’酮之還原共產生84%反式-經基戚》 ^¢301.RF.DOC/HYC/ 3 1

Claims

384310 第84109539號專利申請案 Ag 中文申請專利範圍修正本(88年11月|| 申請專利範園 1· 一種製備式II化合物之方法:

II 其中A為碳，且R1為直鏈或支鏈cN5烷基其係式I化合物之前驅體：

S02NHj 其個別非對映異構物，個別對掌異構物或其混合物，或其眼科學上可接受之里類，其_中： A及R1之定義如上述； Z 為 NHR或-OR; R為直鍵或支缝Ci.6燒基； X 為-so2; 該方法包括以下步驟，將微生物果蠅紅酵母ATCC 32762 在營養培養基中培養，該培養基包含可同化的氮源、碳源和受質化合物III: Ο 良纸張尺度埴用申困國家梂丰（CNS) A4规格（2丨〇><297公衰） -----------------^-----Q. (請先閱讀背面之注f項再填寫本I) 鎪濟部中央橾率局貝工消费合作社印«.

Aess 384310 申請專利範圍其中R2為直鏈或支鏈烷基；於好氣狀態下，直到大量化合物II生成為止，且分離所產生之化合物。 2. 根據申請專利範国第1項之方法，其中該受質係溶於1%至 15%體積比之乙酵，甲酵或DMSO中，且所添加之受質量為1至3克/升。 3. 根據申請專利範困第2項之方法其中該受質係溶於1%至 3%體積比DMSO中，且所添加之受質量為1至3克/升。 4. 根據申請專利範圍第1項之方法’其中該溫度為2〇至5〇。〇，且pH值為4.5至8.0。 5. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該溫·度為3〇至35。〇 , 且pH值為5.5至6.5。 —II 1— i n II ------f ri— ·1_1 SI m I-— —I— -I - ^^1 -- - {請先閱讀背面之注項再填寫本頁) o^ 經濟部t央橾率局貝工消费合作社印«. 準梂家國躪中用逋 s N I祕 29

第84109539號專利申請案中文説明書修正頁(85年11月） A7 _B7 五、發明説明（9 ) 滴硫酸。24小時後，利用乙酸乙酯（1〇〇毫升）稀釋反應，且以1 0 %之Na2S〇3(亞硫酸鈉）溶液和飽和之NaHC〇3(碳酸氫鈉）溶液清洗之。將有機層濃缩，並利用乙醇碾製，得到產品4.5公克的產品（95%)。微生物果蠅紅酵母的生物純菌種樣品係自夏威夷Drosophila pilimanae(果壤）的幼蟲中分離得到的，且依照巴德貝斯特條約（Budapest Treaty)，得自現址爲馬里蘭 Rockville parkawn Dvive 12301號的美國菌種保存中心（American Type Culture Collection)中，所收集的純菌株，其登錄號瑪（Accession Number)爲ATCC 32762。深紅酵母的純菌種樣品係來自現址位爲馬里蘭Rockville Parklawn Drive 123 01號的美國菌種保存中心，其登錄號碼爲ATCC 74283 »專利特許中，任何接觸微生物的限制都必須要切實遵守。深紅酵母ATCC 74283係自受污染之酸乳油中分離得到的。雖然沒有限制分枒方法，但是於本發明所採用之分析方法如下：分析方法生物量測量 , 利用光密度和細胞乾重（CDW)測量生物量。利用休雷培卡（Hewlett Packard)8451A二極雄组分光光度計於660毫微米下進行光密度測量。利用微孔（Millipore)過濾器型號HA，孔洞0.45微米，測量細胞乾重。葡萄糖 * -12· 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS > A4规格（210X297公釐） I!-----〇裝------訂^-------- (請先《讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中夾搮準局貞工消费合作社印製

384310 第84109539號專利申請案中文補充説明書(85年11月）實例4 將保存於4eC斯伯瑞(Sabouraud)右旋糖洋菜膠斜面培養之果塊紅酵母 (Rhodotorula piliminae)ATCC 32762接種至含50毫升原種培養基之250毫升燒瓶中。於281下，在220rpm之旋轉振盪器上有氧培養該燒瓶。將j 毫升經24小時培養之原種培養物接種至含50毫升生長培養基之燒瓶(250 燒叙)中，於28X下，在220rpm(2段式)旋轉振盪器上有氧培養之。經20 小時培養後，將溶於乙醇中之續基網加至各燒瓶中，使乙醇濃度爲20毫升/公升，磺基酮濃度爲0.66克/公升》於添加磺基酮24小時後，收集燒瓶中培養液’萃取之，以薄層層析分析，並以高效能層析分析羥基戚之存在。結果顯示’酮之還原共產生84%反式-經基戚》 ^¢301.RF.DOC/HYC/ 3 1 8S4310 苐84109539號專利中請案中文説明書修正頁(85年11月）

A5 B5 四、中文發明摘要（發明之^稱：反式-短基班之生物轉換合成‘。 ) 本發明係揭示反式-輕基规中間物之新穎微生物轉換合成法，該中間物爲局部的碳酸脱水酶抑制劑（TCAI)t前堪技。TCAI對於治療青光眼和高眼内壓相當有效。此生物轉換法係於微生物深紅酵母（Rhodotorula rubra)或果绳紅酵母 (Rhodotorula piliminae)下進行，且會生成反式_羥基颯，其顯現大於95%之非對映異構物過量。 Ik-I“丨 „------Ο"裝| (請先聞讀背面之注$項再填寫本I各楣W 英文發明摘要（發明之名稱 "BIOCONVERSION PROCESS FOR THE ) SYNTHESIS OF TRANSHYDROXY SULFONE" 經濟部中央揉準局ί消费合作社印製 There is disclosed a novel microbial bioconversion process for the synthesis of a trans-hydroxy sulfone intermediate，which is the precursor to topical carbonic anhydrasc inhibiton (TCAI's). TCAI's are effective in the treatment of glaucoma and ocular hypertension. The bioconversion process is carried out in the presence of the microorganism Rhodotorula rubra, or Rhodotorula piliminae and results in a trans-hydroxy sulfone which exhibits a diastcreomeric excess of greater than 95%. 訂 ο線 -2- 本紙張尺度遑用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐）

384310 第84109539號專利申請案 Ag 中文申請專利範圍修正本(88年11月|| 申請專利範園 1· 一種製備式II化合物之方法:

II 其中A為碳，且R1為直鏈或支鏈cN5烷基其係式I化合物之前驅體：

S02NHj 其個別非對映異構物，個別對掌異構物或其混合物，或其眼科學上可接受之里類，其_中： A及R1之定義如上述； Z 為 NHR或-OR; R為直鍵或支缝Ci.6燒基； X 為-so2; 該方法包括以下步驟，將微生物果蠅紅酵母ATCC 32762 在營養培養基中培養，該培養基包含可同化的氮源、碳源和受質化合物III: Ο 良纸張尺度埴用申困國家梂丰（CNS) A4规格（2丨〇><297公衰） -----------------^-----Q. (請先閱讀背面之注f項再填寫本I) 鎪濟部中央橾率局貝工消费合作社印«.