KR0175641B1 - 균체농축에 의한 자일리톨의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 발효 초기에 15∼30 중량%의 높은 용존산소로 단시간내에 캔디다 파랍실로시스 변이주 KFCC-10875호의 균체의 농도를 15∼35 g/L로 성장시킨후 성장 농축된 균체를 사용하여 배양조 내의 용존산소의 농도를 0.8∼1.5 중량%로 낮추어 자일로스를 기질로 발효시킴을 특징으로 하는 고수율 자일리톨의 제조방법에 관한 것이다.

Description

균체농축에 의한 자일리톨의 제조방법

본 발명은 캔디다 파랍실로시스 변이주(Candida parapsilosis KFCC-10875호)에 의한 자일리톨(xylitol) 생성시 균체농축을 이용하여 자일리톨 생산성을 향상시켜 주는 방법에 관한 것이다.

자일리톨은 1981년 화학자 에밀 피셔(Emil Fisher)에 의하여 발견되어, 1960년부터 감미료로서 사용되고 있는 5탄당 알코올이다. 자일리톨은 당도가 설탕과 같고 용해시 열 감소가 일어나는 특성으로 인하여 입안에서 느끼는 청량감이 크고 섭취후 대사시 인슐린(insulin) 비의존성이기 때문에 당뇨병 환자가 이용할 수 있으며 충치발생과 관련된 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)균의 생육을 저해하여 충치발생을 억제한다고 보고되고 있어 당뇨병 환자의 대용당, 제과 제품의 무설탕 원료, 치약 등에 사용되고 있다.

자일리톨은 상업적으로 수수속 등에 포함되어 있는 자일란(xylan)을 가수분해되어 나온 자일로스(xylose)를 금속촉매하에서 수소화 첨가반응에 의하여 생산된다. 수소를 첨가하는 화학적 방법은 분리정제의 비용이 고가이고 다량의 유기용매를 사용하여 고온 고압에서 진행시키는 반응이므로 다량의 폐기물이 발생하고 위험성이 존재하는 문제점을 가지고 있다. 이러한 단점을 해결하기 위하여 미생물에 의한 자일리톨의 생산방법에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 미생물에 의한 자일리톨의 생산방법은 주로 캔디다(Candida)속을 중심으로한 효모로 부터 이루어지고 있다. 그러나 지금까지 미생물에 의한 자일리톨 생산의 경우 수율은 비교적 높았으나 생산성은 0.3∼1.5 g/1-h로 낮은 단점이 있다.

따라서, 본 발명자는 이러한 단점을 극복하기 위하여 캔디다 파랍실로시스 변이주 KFCC-10875호를 이용하여 발효후 균체를 농축하거나 또는 발효과정 중에 균체를 농축한 균체를 사용하면 자일리톨의 생산성이 현저하게 증가됨을 발견하고 본 발명을 완성하였다. 동 변이주 캔디다 파랍실로시스 KFCC-10875호의 분리방법은 동 발명자들이 특허출원 제95-37516호에 개시한바 있으며, 상기 변이주 생장을 위한 최적 배지 및 배양조건에 관해서는 특허출원 제96-13638호에 개시한 바있다.

따라서 본 발명의 목적은 15∼35 g/L로 농축된 캔디다 파랍실로시스 변이주 KFCC-10875호 균체를 사용하여 자일로스 기질로 발효시켜 자일리톨을 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 또다른 목적은 발효 초기에 15∼30 중량%의 높은 용존산소로 단시간내에 캔디다 파랍실로시스 변이주 KFCC-10875호의 균체의 농도를 15∼35 g/L로 성장시킨후 성장 농축된 균체를 사용하여 배양조 내의 용존산소의 농도를 0.8∼1.5 중량%로 낮추어 자일로스를 기질로 발효시킴으로써 고수율로 자일리톨을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

이때 기질로 사용되는 자일로스의 첨가량은 초기의 자일로스의 량이 고농도가 되지 않기 위하여 자일로스를 유가식으로 나누어 첨가한다.

본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

냉동보관(-70℃)중인 균주 캔디다 파랍실로시스 KFCC-10875를 YM배지(포도당 20 g/L, 펩톤 5 g/L, 효모추출물 3 g/L, 맥아 추출물 3 g/L로 구성) 50 ml가 들어있는 250 ml의 플라스크에 접종하여 진탕배양기에서 240 rpm, 30℃로 균체농도가 3∼4 g/L(약 14∼16시간)로 성장할 때까지 수행하였다. 균체농도가 자일리톨의 생산에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 종배양액을 발효배지(자일로스 50∼270 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 황산암모늄 5 g/L, 이인산칼륨 5 g/L, 황산암모늄 0.2 g/L로 구성)가 2 L 들어있는 5 L 발효조(한국발효기(주))에 접종하여 배양온도는 30℃, 교반속도는 190 rpm으로 하여 균체농도가 약 7 g/L가 될 때까지 배양한 후 원심분리를 하였다. 농축된 균체의 농도를 달리하여 50 ml의 발효배지가 들어있는 250 ml의 플라스크에 접종하였다. 배양시 교반속도는 190 rpm, 온도는 30℃와 초기 pH는 5.0으로 하였고 배양과정 중에 pH는 조절하지 않았다.

발효조 배양은 종배양액을 5 L 발효조에 접종하여 배양초기에는 200 g의 자일로스가 함유된 2 L의 배양액으로 배양하였고 발효과정 중에 200 g의 자일로스가 함유된 500 ml의 용액을 2번 첨가하여 최종 배양액의 부피가 3 L(최종 첨가한 자일로스의 농도는 200 g/L)가 되게 하는 유가식 배양을 하였다. pH는 발효 전 과정동안 일정하게 5.0으로 조절하였고, 온도는 30℃로 하고, 통기량을 1.0 vvm으로 하였고 용존산소는 교반속도를 400∼700 rpm으로 조절하여 배양초기에는 20% 이상 유지시키다가 균체농도가 약 20 g/L되는 시점부터 교반속도를 350∼380 rpm로 낮추어 용존산소 농도를 0.7∼1.5% 정도로 유지하여 자일로스가 완전히 소모될 때까지 배양하였다.

자일로스와 자일리톨의 농도는 Sugar-Pak I 컬럼이 장칙된 HPLC(Shimadzu C-R7A, Japan)를 이용하여 측정하였으며, 이때 용매는 물을 사용하였고, 온도는 90℃이었고, 유속은 0.5 ml/min 이었으며, 검출기는 RI를 사용하였다. 균체농도는 탁도계를 이용하여 파장 600 nm에서 현탁도를 측정하여 미리 측정한 표준곡선을 이용하여 건조중량으로 환산하였다. 발효과정 중의 용존산소의 농도는 용존산소전극(Ingold, Swiss)을 이용하여 측정하였다.

본 발명을 실시예에 따라 상술하면 다음과 같다.

[실시예 1]

농축된 캔디다 파랍실로시스 변이주 KFCC-10875호의 균체를 50 g/L의 자일로스가 함유된 배지에 접종하여 플라스크에서 초기 균체농도를 다르게하여 균체농도가 최종 자일리톨 농도, 자일리톨 생산성(단위시간당 생산하는 자일리톨의 량) 및 자일로스에 대한 자일리톨의 수율에 미치는 영향을 표 1에 나타내었다.

[실시예 2]

약 20 g/L로 농축된 균체를 사용하여 초기 자일로스의 농도를 50 g/L에서 270 g/L로 변하시켜 플라스크에서 초기 자일로스가 최종 자일리톨 농도, 자일리톨 생산성 및 자일로스에 대한 자일리톨의 수율에 미치는 영향을 살펴본 결과를 표 2에 표시하였다.

[실시예 3]

고농도의 균체를 사용하여 자일리톨의 생산성과 발효시간을 단축시킬 수 있었다. 그러나, 발효초기에 고농도의 균체를 사용하려면 자일로스 배지에서 배양된 균체를 다시 농축하여야 하는 단점이 존재한다. 이러한 단점을 해결하기 위하여 발효과정 중에 균체를 농축하는 방법을 시도하였다. 고농도의 균체를 얻기 위하여 지수증식기인 배양초기에 용존산소의 농도를 충분히 유지시켜 짧은시간내에(20시간이내) 20 g/L까지 성장시켰다. 성장 농축된 균체를 이용하여 자일리톨을 생산하기 위하여 용존산소의 농도를 0.8∼1.5%로 낮추어 배양하였다. 이때, 기질의 농도는 자일리톨의 생산성을 향상시키기 위하여 초기에 자일로스의 량이 고농도가 되지 않기 위하여 자일로스를 나누어 첨가하였다. 5 L 발효조에서 배양초기에는 200 g의 자일로스가 함유된 2 L의 배양액으로 배양하였고, 배양시간 20시간과 41.5시간 부근에서 200 g의 자일로스가 함유된 500 ml의 용액을 각각 첨가하여 최종 배양액의 부피가 3 L가 되게하여 실험한 결과를 표 3에 나타내었다.

Claims (3)

15∼35 g/L로 농축된 캔디다 파랍실로시스 변이주 KFCC-10875호 균체를 사용하여 자일로스를 기질로 발효시킴을 특징으로 하는 고수율 자일리톨의 제조방법.

발효 초기에 15∼30 중량%의 높은 용존산소로 단시간내에 캔디다 파랍실로시스 변이주 KFCC-10875호의 균체의 농도를 15∼35 g/L로 성장시킨후 성장 농축된 균체를 사용하여 배양조 내의 용존산소의 농도를 0.8∼1.5 중량%로 낮추어 자일로스를 기질로 발효시킴을 특징으로 하는 고수율 자일리톨의 제조방법.

제2항에 있어서, 기질로 사용되는 자일로스의 첨가량은 초기의 자일로스의 량이 고농도가 되지 않기 위하여 자일로스를 유가식으로 나누어 첨가시킴을 특징으로 하는 고수율 자일리톨의 제조방법.