KR100199818B1

KR100199818B1 - 신균주 캔디다 트롭피칼리스에 의한 자일리톨의 제조방법

Info

Publication number: KR100199818B1
Application number: KR1019970010244A
Authority: KR
Inventors: 김상용; 오덕근; 최진환; 정수련; 김수은
Original assignee: 정기련; 주식회사보락
Priority date: 1997-03-25
Filing date: 1997-03-25
Publication date: 1999-06-15
Also published as: KR19980074429A

Abstract

본 발명은 신균주 캔디다 트롭피칼리스(Candida tropicalis) (기탁번호 KFCC-10960호)를 이용하여 자일로스 5~12%, 포도당 0.2~1.5%, 효모추출물 0.2~2.0%, 이인산칼륨 0.2~2.0% 및 황산마그네슘 0.01~0.2%를 함유하는 발효 배지에서 신균주를 배양시킴을 특징으로 하는 고수율, 고생산성의 자일리톨의 제조방법에 관한 것이다. 또한 종배양된 균주를 포도당 25~35 g/L, 효모 추출물 8~12 g/L, 이인산칼륨 4~6 g/L 및 황산마그네슘 0.15~0.25 g/L가 함유된 배지에서 신균주의 균체 농축을 위한 배양을 발효 배양 전에 실시하는 것이 바람직하다.

Description

신균주 캔디다 트롭피칼리스의 의한 자일리톨의 제조방법

본 발명은 자일리톨(xylitol) 수율과 생산성이 높은 신균주 캔디다 트롭피칼리스 (Candida tropicalis)(KFCC-10960호)를 이용하여 포도당이 함유된 자일로스(xylose)배지로부터 자일리톨 제조하는 방법에 관한 것이다.

오탄당 알코올인 자일리톨은 과일, 채소 및 버섯등의 자연에서 소량 존재하고 또한 포유동물 탄수화물대사의 중간산물이다. 자일리톨은 당뇨병 환자가 자일리톨을 소화시키기 위하여 인슐린(insulin)을 필요로 하지 않아 당뇨병 치료를 위한 대용당으로 사용되고 있다. 또한 자일리톨은 감미도가 설탕과 비슷하고 용해될때 열 감소가 일어나는 특성으로 인하여 입안에서 느끼는 청량감이 커서 식품의 여러 분야에서 감미료로 응용되고 있고 특히, 제과제품의 무설탕 원료로 사용되고 있다. 자일리톨은 충치발생을 억제한다는 보고가 있어 치약 등에도 사용되고 있다.

지금까지 자일리톨은 목재, 볏집이나 수수속 등을 가수분해되어 나온 자일로스를 환원하는 화학적 방법으로 생산하여 왔으나, 화학적 방법은 자일로스 또는 자일리톨과 반섬유소 부분에서 생기는 다른 고분자당의 가수분해물들과의 분리와 정제가 어렵고 그 수율도 50~60% 정도로 낮다. 또한 알칼리를 이용한 고온 고압의 반응이므로 위험성과 폐기물 문제가 존재하는 단점이 있다. 이러한 단점을 해결하기 위하여 미생물에 의한 자일리톨의 생산방법에 대한 많은 연구가 주로 효모인 캔디다(Candida)속을 중심으로 진행되고 있다.

포도당의 경우 자일로스보다 저렴하기 때문에 포도당을 이용하여 자일리톨을 생산하려는 많은 시도가 있었다. 그러나, 자일리톨을 생산하는 효모의 경우 자일로스와 포도당의 대사경로가 각각 분리되어 있기 때문에 포도당으로부터 자일리톨을 생성하는 것은 불가능하고, 실제로 오니쉬(Onishi) 등이 (Appl.Microbiol., 18, 1031(1969)) 128 종류의 효모를 이용하여 포도당으로부터 자일리톨의 생산을 시도하여 보았으나 실패하였다. 그러므로 포도당을 이용하여 자일리톨을 생산하기 위해서는 포도당을 자일로스 배지에 첨가하여 균체중식은 포도당으로부터 얻고 자일리톨은 자일로스로부터 얻는 방법을 사용한다면 자일리톨의 생산성 및 수율이 증가할 것이다.

따라서, 본 발명자들은 이미 자일로스 제조회사의 슬러지(sludge)에서부터 자일리톨의 생산 수율과 생산성이 높은 캔디다 트롭피칼리스 KFCC-10960호를 분리하여 1997년 3월 21일 천연으로부터 분리한 신균주 캔디다 트롭피칼리스에 의한 자일리톨의 제조방법이라는 발명의 명칭으로 특허출원 하였고, 이 균주를 이용하여 자일로스 배지에 포도당을 특정 농도 이하로 첨가하면 자일리톨의 생산성 및 수율이 증가함을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 천연슬러지에서 분리된 신균주 캔디다 트롭피칼리스(Candida tropicalis)(기탁번호 KFCC-10960호)를 이용하여 자일로스 5~12%, 포도당 0.2~1.5%, 효모추출물 0.2~2.0%, 이인산칼륨 0.2~2.0% 및 황산마그네슘 0.01~0.2%를 함유하는 발효 배지에서 신균주를 배양하여 고수율, 고생산성으로 자일리톨을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이때 발효배지내의 포도당의 농도는 5~10 g/L로 유지시킴이 적당하였고, 포도당은 연속적 또는 간헐적으로 첨가하여 배지내 포도당의 농도를 유지시킴이 바람직하다.

이때 본 발명의 신균주 캔디다 트롭피칼리스의 종배양은 포도당 18~22 g/L, 펩톤 4~6 g/L, 효모추출물 2.5~3.5g/L 및 맥아추출물 2.5~3.5 g/L가 함유된 YM 배지에서 균체농도가 3~4 g/L로 성장할때 까지 진탕배양한다.

또한 종배양된 균주를 포도당 25~35 g/L, 효모 추출물 8~12 g/L, 이인산칼륨 4~6 g/L 및 황산마그네슘 0.15~0.25 g/L가 함유된 배지에서 배양함으로서 본 발명의 신균주의 균체 농축을 위한 전단계 배양을 본 발명의 발효 배양 전에 실시하는 것이 바람직하다.

이하 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

성장배지로는 포도당 18~22g/L, 펩톤 4~6 g/L, 효모 추출물 2.5~3.5 g/L, 맥아 추출물 2.5~3.5 g/L로 구성된 YM 배지를 사용하였고, 발효배지는 탄소원으로 포도당 및 자일로스를 사용하였고 질소원으로는 효모 추출물, 무기염으로는 이인산칼륨, 황산마그네슘으로 구성된 배지를 사용하였다.

각 성분의 양은 자일리톨의 생산성을 높이기 위하여 변화시킬 수 있다. 발효조에서 사용한 배지로 자일로스는 유가식으로 총 첨가된 농도는 300 g/L이고, 효모 추출물은 10 g/L, 이인산칼륨 5 g/L, 황산마그네슘 0.2 g/L로 구성된 최적배지이었다.

종배양은 냉동 보관된 균주를 YM 배지 50mL 들어있는 250 mL의 플라스크에 접종하여 진탕 배양기에서 230~250 rpm, 28~32

로 균체농도가 3~4 g/L(약 10시간)로 성장할 때까지 수행하였다. 플라스크 배양에서는 배지에 5%에 해당되는 종배양액을 발효배지가 50 mL가 들어있는 250 mL의 플라스크에 접종하여 진탕 배양기에서 210~230 rpm, 27~33

로 하여 37~41시간동안 배양하였다.

발효조 배양에서는 발효초기에 200 g의 자일로스가 함유된 배지부피가 3 L인 5 L 발효조(한국발효기(주))를 사용하였다. 발효과정 중에 교반속도는 240~260 rpm으로 조절하였고 통기량은 1.0 vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정동안 4.5~5.5로 조절하였고 배양온도는 27~33

이었다.

포도당, 자일로스와 자일리톨의 농도는 Sugar-Pak

칼럼(Millipore, USA)이 장착된 HPLC(Shimadzu C-R6A, Japan)의 Refractive Index Detector(Shimadzu RID-6A, Japan)를 이용하여 측정하였다. 이때, 용매는 물을 사용하였고, 온도는 70

이고, 유속은 0.6 mL/분 이였다. 균체농도는 탁도계를 이용하여 600 nm에서 현탁도를 측정하여 미리 측정한 표준곡선을 이용하여 건조중량으로 전환하였다. 용존산소 농도는 Ingold사(Swiss, polarographic type)의 용존산소 전극을 사용하여 측정하였다.

이하 본 발명을 실시예에 따라 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

(실시예 1)

종배양 : 자일로스 제조회사의 슬러지(sludge)로부터 분리한 균주 캔디다 트롭피칼리스 KFCC-10960호를 YM 배지 50 mL가 들어있는 250 mL 플라스크에 접종하여 240rpm 30로 10시간 배양하였다.

본배양 : 종 배양액을 발효배지 50 mL가 함유된 250 mL 플라스크에 접종한 후, 진탕 배양기로 220 rpm에서 30

로 30시간까지 배양하였고, 배지의 pH는 발효 초기에 5.0으로 조절한 후 조절하지 않았다. 이때 배지성분은 포도당 0~30 g/L, 자일로스 100 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 황산암모늄 5 g/L, 이인산칼륨 5 g/L이었다. 포도당의 첨가 농도에 따른 자일리톨의 생산을 살펴본 결과를 표 1에 타나내었다.

(실시예 2)

종 배양은 실시예 1과 같고, 균체 농축을 위한 전단계 배양에서는 포도당 배지(포도당 30 g/L, 효모 추출물 10 g/L, 이인산칼륨 5 g/L, 황산마그네슘 0.2 g/L)가 3 L들어있는 5 L 발효조 2대를 사용하여 14시간동안 배양하였다. 이때 배양 pH와 온도는 각각 4.5와 30

로 하여 배양하였다. 용존산소 농도를 20% 이상 유지하기 위하여 교반속도를 300 rpm에서 800 rpm으로 서서히 증가시켰다. 이 배양액을 6,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 농축된 균체를 5 L 발효조에 접종하였다. 이때, 발효배지(자일로스 100 g/L 그 외의 성분은 전단계 배양과 동일)는 2 L, 교반속도는 350 rpm, pH는 4.5 온도는 30

이었다. 시간에 따른 균체농도, 자일로스 농도 및 자일리톨 농도는 표 2와 같다. 배양결과 캔디다 트롭피칼리스 KFCC-10960호에 의한 자일로스로부터 자일리톨의 생산수율은 88% 이었고 평균용적 생산성은 14.5 g-자일리톨/L-h를 얻었다. 이러한 결과는 자일로스 대신 포도당에서 성장시킨 균체를 농축하면 균체농도와 비례적으로 자일리톨의 생산성을 증가시킬 수 있다는 것을 의미한다.

(실시예 3)

자일로스의 농도를 300 g/L로 증가시켜 발효조에서 포도당이 첨가된 자일로스의 유가식 배양을 수행하였다. 이때 유가식 배양을 수행한 이유는 캔디다 트롭피칼리스의 경우 100 g/L 이상의 자일로스에서는 자일리톨 생산 속도가 저하되었기 때문이었다. 배양은 발효초기에 200 g의 자일로스가 함유된 배지부피가 2 L인 5 L 발효조(한국발효기(주))를 사용하였다. 발효과정 중에 175 g의 자일로스가 함유된 250 mL의 용액을 4번(19h, 25h, 30h, 35.5h) 추가하여 최종배양액의 부피를 3 L(총 첨가된 자일로스의 농도는 300 g/L에 해당)가 되는 유가식 배양을 하였다. 포도당을 초기에 15 g을 첨가한 후 발효시간 8.5시간에서부터 5 g/h로 15시간 동안 첨가하여 총 90 g(총 첨가된 포도당의 농도는 30 g/L에 해당)을 첨가하였다. 용존산소는 교반속도를 300~800 rpm으로 조절하여 배양초기에는 20%이사 유지시키고 균체농도가 약 15 g/L되는 시점에서 교반속도를 350 rpm으로 변화시켜 용존산소를 제한하였다. pH는 발효 전 과정 동안 4.5로 조절하였고 배양온도는 30

이었고 통기량은 1.0 vvm으로 조절하였다. 시간에 따른 자일리톨의 생산은 표 3에 나타내었다. 이러한 방법으로 300 g/L의 자일로스로부터 41시간만에 261 g/L의 자일리톨을 얻었다. 이러한 결과는 자일로스에 대한 자일리톨의 수율 87%와 자일리톨의 생산성 6.37 g/L-h에 해당되는 것이다.

(비교예 1)

종배양과 균체 농축을 위한 전 단계 배양과 본 배양을 배양시간을 제외한 모든 것을 실시예 2와 같게 하여 캔디다 파랍실로시스 (Candida parapsilosisKFCC-10875호)를 배양하였다. 종배양의 배양시간은 16시간, 균체 농축을 위한 전단계 배양은 20시간, 본 배양은 136시간이 소요되었다. 포도당에서 증식시킨 캔디다 파랍실로시스의 농축균체를 배양결과 자일로스로부터 자일리톨의 생산수율은 72%이었고, 평균 용적 생산성은 0.53 g-자일로스/L-h를 얻었다, 이것은 포도당에서 성장시킨 농축한 캔디다 파랍실로시스의 균체를 사용하는 것은 캔디다 트롭피칼리스 KFCC-10960호와 달리 자일리톨 생산에 아무런 도움이 안된다는 것을 의미한다.

(비교예 2)

실시예 3과 같은 방법으로 포도당을 첨가하지 않고 300 g/L의 자일로스만 첨가하여 43시간만에 240 g/L의 자일리톨을 얻었다. 이러한 결과는 자일로스에 대한 자일리톨의 수율 80%와 자일리톨의 생산성 5.38 g/L-h에 해당되는 것이다.

(비교예 3)

실시예 3과 같은 방법으로 300 g/L의 자일로스 배지에 포도당을 초기에 90 g을 첨가하여(총 첨가된 포도당 농도가 30 g/L에 해당) 45시간만에 162 g/L의 자일리톨을 얻었다. 이러한 결과는 자일로스에 대한 자일리톨의 수율 54%와 자일리톨의 생산성 3.60 g/L-h에 해당되는 것이다. 이러한 결과로부터 초기에 과량의 포도당을 첨가하면은 자일리톨의 생산이 저해된다는 것을 알았다.

본 발명의 효과는 자일리톨 수율과 생산성이 높은 신균주 캔디다 트롭피칼리스 (Candida tropicalis) (KFCC-10960호)를 이용하여 포도당이 함유된 자일로스(xylose)배지로부터 자일리톨을 제조함으로써 종래의 발효방법에 비해 경제적이고 자일로스로부터 선택적으로 간편하게 발효시켜 자일리톨을 생산하게 된 것이다.

Claims

신균주 캔디다 트롭피칼리스(Candida tropicalis)(기탁번호 KFCC-10960호)를 이용하여 자일로스 5~12%, 포도당 0.2~1.5%, 효모추출물 0.2~2.0%, 이인산칼륨 0.2~2.0% 및 황산마그네슘 0.01~0.2%를 함유하는 발효 배지에서 신균주를 배양시킴을 특징으로 하는 고수율, 고생산성의 자일리톨의 제조방법.
제1항에 있어서, 발효배지내의 포도당을 연속적 또는 간헐적으로 첨가하여 배지내 포도당의 농도를 5~10 g/L로 유지시킴을 특징으로 하는 자일리톨의 제조방법.
제1항에 있어서, 신균주 캔디다 트롭피칼리스의 종배양은 포도당 18~22 g/L, 펩톤 4~6 g/L, 효모추출물 2.5~3.5g/L 및 맥아추출물 2.5~3.5 g/L가 함유된 YM 배지에서 균체농도가 3~4 g/L로 성장할때 까지 진탕배양시킴을 특징으로 하는 자일리톨의 제조방법.
제1항에 있어서, 종배양된 균주를 포도당 25~35 g/L, 효모 추출물 8~12 g/L, 이인산칼륨 4~6 g/L 및 황산마그네슘 0.15~0.25 g/L가 함유된 배지에서 신균주의 균체 농축을 위한 배양을 발효 배양 전에 실시함을 특징으로 하는 자일리톨의 제조방법.