FI90663C - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten makrolidiyhdisteiden valmistamiseksi - Google Patents

Description

1 90663

Menetelma terapeuttisesti kayttokelpoisten makrolidiyhdis-teiden valmistamiseksi Tåmå keksinto koskee menetelmaå uusien antibioot-5 tisten makrolidiyhdisteiden valmistamiseksi.

GB-patenttijulkaisussa 2 166 436 esitetaan uuden Streptomyces-lajin fermentointituotteista eristettåvissa olevien S541-antibioottien tuottaminen.

Nyt on loydetty uusi antibioottista aktiivisuutta 10 omaava yhdisteryhmå, joka voidaan valmistaa modifioimalla S451-antibiootteja. Taman yhdisteryhmMn muodostavat makro-lidiyhdisteet, joilla on kaava (I) NOR2 CH „ /l^,,.-CH3 I 3 H jix j?Jj ^ CH, •15 , α H ^ 20 ""R1

• H 1 H

10 \ °^c/° 9|| (I) ΊΙ phJ^h

25 O_L

CH3

H i 3 OR

jossa 30 R1 on metyyli, etyyli tai isopropyyli; R2 on vety, alempi alkyyli tai allyyli, ja ryhmå =NOR2 on E-konfiguraatiossa; ja OR3 on hydroksyyliryhmå tai ryhma -OR4, -OCOR4 tai -0C02R4, joissa R4 on alempi alkyyli, tax ryhma -OCONR8R9, jossa R8 35 ja R9 ovat kumpikin itsenaisesti vety tai alempi alkyyli, 2 90663

Kaavan I mukaisen yhdisteen sisaltama alkyyliryhma R2 voi olla haarautumaton tai haarautunut.

Edullisissa kaavan I mukaisissa yhdisteisså R1 on isopropyy1iryhma.

5 OR3-ryhma on edullisesti metoksikarbonyylioksi-, tai erityisesti asetoksi-, metoksi- tai hydroksiryhma. Yleensa kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa OR3 on hydroksiryhma, ovat erityisen edullisia.

Tarkeitå keksinnbn mukaisesti valmistettuja yhdis-10 teita ovat ne kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa R1 on isopropyyliryhma, R2 on metyyliryhma ja OR3 on hydroksi-, asetoksi- tai metoksikarbonyylioksiryhma.

Tarkea keksinnon mukaisesti valmistettu yhdiste on kaavan I mukainen yhdiste, jossa R1 on metyyliryhma, R2 on 15 metyyliryhma ja OR3 on metoksiryhma.

Toinen tårkeS keksinnon mukaisesti valmistettu yhdiste on kaavan I mukainen yhdiste, jossa R1 on etyyliryhma, R2 on metyyliryhma ja OR3 on hydroksyyliryhma.

Erityisen tårkeå on kaavan I mukainen yhdiste, jos-20 sa R1 on isopropyyliryhma, R2 on metyyliryhma ja OR3 on hyd-roksyyliryhma.

Taman keksinnon kohteena on menetelma edella maari-teltyjen kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi, ja talle menetelmalle on tunnusomaista, etta 25 (A) yhdiste, jolla on kaava (II)

3 9 C r J

o

A CH

CH, 3 A^o/T CH3 5 L J H \\ CH3'"'K a

H H

Ae-"'0 I OH LaH (II) 10 0 CH3 OR3 15 jossa R1 ja OR3 ovat edella mååritellyt, saatetaan reagoi-maan reagenssin H2NOR2 tai sen suolan kanssa, jossa R2 on edella maaritelty, tai (B) kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, 20 jossa OR3 on hydroksyyliryhmå, pelkistetaån yhdiste, jolla on kaava (III) NOR2 CH7 f3 „ ry 0-~.0 ch3 CH3'"'K S\h ^ r1 H 1

30 A aA

AAh uii) o— H o 4 90663 jossa R1 ja R2 ovat edellå maaritellyt, ja haluttaessa suoritetaan yksi tai useampi seuraavista reaktioista: (i) hydrolysoidaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa 5 OR3 on ryhmå -OR4, -OCOR4, -0C02R4 tai -OCONR8R9, vastaavan kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa OR3 on hydroksyyliryhma, (ii) kaavan I mukainen yhdiste, jossa R2 on alempi alkyyli tai allyyli ja OR3 on hydroksyyliryhma, eetteroi- 10 dåån tai asyloidaan vastaavan kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa OR3 on ryhma -OR4, -OCOR4, -0C02R4 tai -OCONR8R9, ja (iii) kaavan I mukainen yhdiste, jossa R2 on vety ja OR3 on ryhma -OR4, -OCOR4, -0C02R4 tai -OCONR8R9, saatetaan 15 reagoimaan eetteroivån yhdisteen R2Y kanssa, jossa R2 on alempi alkyyli tai allyyli ja Y on poistuva ryhma, vastaavan kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa R2 on alempi alkyyli tai allyyli.

Menetelmavaihtoehdossa A oksiiminmuodostusreaktio 20 voidaan suorittaa vesipitoisessa tai vedettomassa reaktio-valiaineessa, edullisesti lampotilassa -20 - +100 °C, esim. -10 - +50 °C:ssa. On edullista kayttåå H2NOR2-rea-genssia suolanaan, esimerkiksi happoadditiosuolana, kuten vetykloridina. Kun kaytetaån tallaista suolaa, reaktio 25 voidaan suorittaa happoa sitovan aineen låsnå ollessa.

Kayttokelpoisia liuottimia ovat vesi ja veden kanssa sekoittuvat liuottimet, kuten alkoholit (esim. metanoli tai etanoli), amidit (esim. Ν,Ν-dimetyyliformamidi, Ν,Ν-dimetyyliasetamidi tai heksametyylifosforamidi), eet-30 terit (esim. sykliset eetterit, kuten tetrahydrofuraani tai dioksaani tai asykliset eetterit, kuten dimetoksietaa-ni tai dietyylieetteri), nitriilit (esim. asetonitriili), sulfonit (esim. sulfolaani), hiilivedyt, kuten halogenoi-dut hiilivedyt (esim. metyleenikloridi) ja esterit, kuten 35 etyyliasetaatti seka kahden tai useamman naistå sisaltavat seokset.

5 90663 Kåytettåesså vesipitoisia olosuhteita reaktio voi-daan edullisesti puskuroida pH-arvoon 2-9 sopivalla ha-polla, emaksellå tai puskurilla.

Sopivia happoja ovat mineraalihapot, kuten kloori-5 vetyhappo tai rikkihappo, ja karboksyylihapot, kuten etik- kahappo. Sopivia emaksia ovat alkalimetallikarbonaatit ja bikarbonaatit, kuten natriumbikarbonaatti, hydroksidit, kuten natriumhydroksidi, seka alkalimetallikarboksylaatit, kuten natriumasetaatti. Sopiva puskuri on natriumasetaat-10 ti/etikkahappo.

Kaavan II mukaiset yhdisteet ovat joko GB-patentti-julkaisussa 2 176 182 esitettyjå tunnettuja yhdisteita tai ne voidaan valmistaa siinå esitetyista tunnetuista yhdis-teista kayttaen tavanomaisia menetelmiå.

15 Pelkistys menetelmavaihtoehdossa B voidaan suorit- taa pelkistimellå, joka stereoselektiivisesti pelkistaå 5-ketoryhman. Sopivia pelkistimiå ovat boorihydridit, kuten alkalimetalliboorihydridit (esim. natriumboorihydri-di) , ja litiumalkoksialumiinihydridit, kuten litiumtri-20 butoksialumiinihydridi.

BoorihydridipelkistintS kaytettaessa reaktio tapah-tuu liuottimen, kuten alkanolin, esim. isopropyylialkoho-lin tai isobutyylialkoholin låsnå ollessa, edullisesti låmpotilassa, joka vaihtelee vålillå -30 - +80 °C, esim. 25 0 °C:ssa. Litiumalkoksialumiinihydridiå kaytettaessa reak tio tapahtuu liuottimen, kuten eetterin, esim. tetrahydro-furaanin tai dioksaanin, låsnå ollessa, edullisesti låmpotilassa, joka vaihtelee vålillå -78 - 0 °c.

Kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa OR3 on ryhmå 3 0 -OR4, -OCOR4, —0C02R4 tai -OCONR*R9, voidaan muuttaa vastaa- viksi kaavan I mukaisiksi yhdisteiksi, joissa OR3 on hyd-roksyyliryhmå, hydrolysoima11a sinånså tunnetulla tavalla. Tåten esimerkiksi asyyliryhmå, kuten asetyyliryhmå, voidaan poistaa emåksisellå hydrolyysillå, esim. kåyttåen 35 natrium- tai kaliumhydroksidia alkoholiliuoksessa, tai 6 90663 happamalla hydrolyysillå, esim. kåyttåen våkevåå rikkihap-poa metanolissa.

Kaavan I mukaisessa yhdisteesså, jossa R2 on alempi alkyyli tai allyyli ja OR3 on hydroksyyliryhmå, tåmå hyd-5 roksyyliryhmå voidaan substituoida asylointi- tai eette-rointireaktioilla. Nama reaktiot voidaan suorittaa kåyttåen tavanomaisia menetelmiå, kuten seuraavassa on esitet-ty.

Tåten esimerkiksi asylointi voidaan suorittaa kåyt-10 tåen asyloivaa ainetta, kuten kaavan R4COOH mukaista hap-poa tai sen reaktiivista johdannaista, kuten happohaloge-nidia (esim. happokloridia), -anhydridiå tai aktivoitua esteriå tai hapon R4OCOOH reaktiivista johdannaista.

Asyloinnit, joissa kaytetåan happohalogenideja tai 15 -anhydrideja, voidaan halutessa suorittaa happoa sitovan aineen låsna ollessa, kuten tertiaarisen amiinin (esim. trietyyliamiinin, dimetyylianiliinin tai pyridiinin), epå-orgaanisten emåsten (esim. kalsiumkarbonaatin tai natrium-bikarbonaatin) låsnå ollessa tai oksiraanien, kuten alem-20 pien 1,2-alkyleenioksidien (esim. etyleenioksidin tai pro-pyleenioksidin) låsnå ollessa, jotka sitovat asylointi-reaktiossa vapautuneen vetyhalogenidin.

Asyloinnit, joissa kåytetåån happoja, suoritetaan edullisesti kondensoivan aineen, esimerkiksi karbodi-imi-25 din kuten N,Ν'-disykloheksyylikarbodi-imidin tai N-etyyli-N7 - Y-dimetyyliaminopropyylikarbodi-imidin, karbonyyliyh-disteen, kuten karbonyylidi-imidatsolin, tai isoksatsoli-umsuolan kuten N-etyyli-5-fenyyli-isoksatsoliumperkloraa-tin låsnå ollessa.

30 Aktivoitu esteri voidaan edullisesti muodostaa in situ kåyttåen esimerkiksi 1-hydroksibentsotriatsolia edel-lå esitetyn kondensoivan aineen låsnå ollessa. Vaihtoeh-toisesti aktivoitu esteri voidaan muodostaa etukåteen.

Asylointireaktio voidaan suorittaa vesipitoisessa ; 35 tai vedettomåsså reaktiovåliaineessa, edullisesti låmp6-tilassa -20 - +100 °C, esim. -10 - +50 °C:ssa.

’ 90663

Eetterinmuodostus voidaan suorittaa kayttaen kaavan R4Y mukaista reagenssia (jossa R4 on edella måaritelty ja Y on poistuva ryhma, kuten kloori-, bromi- tai jodiatomi tai hydrokarbyylisulfonyylioksiryhmå, kuten mesyylioksi tai 5 tosyylioksi tai halogeenialkanoyylioksiryhma, kuten di- klooriasetoksi). Reaktio voidaan suorittaa muodostamalla magnesiumalkoksidi kayttaen Grignard-reagenssia, kuten metyylimagnesiumhalogenidia, esim. metyylimagnesiumjodi-dia, tai kayttaen trialkyylisilyylimetyylimagnesiumhaloge-10 nidia, kuten trimetyylisilyylimetyylimagnesiumkloridia, minkå jalkeen kåsitellaan reagenssilla R4Y.

Vaihtoehtoisesti reaktio voidaan suorittaa hopea-suolan, kuten hopeaoksidin, hopeaperkloraatin, hopeakarbo-naatin tai hopeasalisylaatin tai naiden seosten lasna ol-15 lessa, ja tåma systeemi voi olla erityisen sopiva kun eetterinmuodostus suoritetaan kayttaen alkyylihalogenidia (esim. metyylijodidia).

Eetterinmuodostus voidaan edullisesti suorittaa liuottimessa, kuten esimerkiksi eetterissa, esim. dietyy-20 lieetterisså.

Kaavan I mukaisen yhdisteen hydroksyyliryhman OR3 asylointi ryhmaksi OCONR8R9 voidaan suorittaa sopivalla karbamoyloivalla aineella. Sopivia karbamyloivia aineita sellaisten yhdisteiden valmistamiseksi, joissa toinen ra-25 dikaaleista R8 ja R9 on vetyatomi ja toinen on alempi al-kyyliryhma, ovat kaavan Rl0NCO mukaiset isosyanaatit (jossa R10 on alempi alkyyliryhmå). Karbamylointireaktio voidaan edullisesti suorittaa kayttaen mukana liuotinta, joka voi olla hiilivety (esim. aromaattinen hiilivety, kuten bent-30 seeni tai tolueeni), halogenoitu hiilivety (esim. dikloo- rimetaani), amidi (esim. formamidi tai dimetyyliformami-di) , esteri (esim. etyyliasetaatti) , eetteri (esim. sykli-nen eetteri, kuten tetrahydrofuraani tai dioksaani), keto-ni (esim. asetoni), sulfoksidi (esim. dimetyylisulfoksidi) 35 tai naiden seos. Reaktio voidaan edullisesti suorittaa 8 90663 låmpotilassa, joka vaihtelee -80 °C:sta reaktioseoksen kiehumispisteeseen, esimerkiksi 100 °C:seen, edullisesti -20 - +30 °C:ssa.

Karbamoylointi voidaan suorittaa emåksen låsnå ol-5 lessa, esim. tertiaarisen orgaanisen emåksen, kuten tri-(alempi alkyyli)amiinin (esim. trietyyliamiinin) låsnå ollessa.

Toinen kåyttokelpoinen karbamoylointiaine on syaa-nihappo, joka edullisesti valmistetaan in situ, esimerkik-10 si alkalimetallisyanaatista, kuten natriumsyanaatista, jolloin reaktio helpottuu hapon låsnå ollessa, esim. vah-van orgaanisen hapon, kuten trifluorietikkahapon låsnå ollessa. Syaanihappo vastaa tehokkaasti yllå mainittuja isosyanaattiyhdisteitå, joissa R10 on vety, ja muuttaa sik-15 si kaavan II mukaiset yhdisteet suoraan karbamoyylioksi-analogeiksi (so. kaavan I mukaisiksi yhdisteiksi, joissa OR3 on ryhmå 0C0NH2) .

Vaihtoehtoisesti karbamoylointi voidaan suorittaa reaktiolla fosgeenin tai karbonyylidi-imidatsolin ja sen 20 jålkeen ammoniakin tai sopivan substituoidun amiinin kans-sa joko vesipitoisessa tai vedettomåsså reaktiovåliainees-sa.

Kaavan I mukainen yhdiste, jossa OR3 on substituoitu hydroksyyliryhmå ja R2 on vety, voidaan eetteroidå yhdis-25 teeksi, jossa R2 on alempi alkyyli tai allyyli.

Eetterointireaktio voidaan suorittaa esimerkiksi muodostamalla magnesiumalkoksidi kåyttåen Grignard-rea-genssia, kuten metyylimagnesiumhalogenidia, esim. metyyli-magnesiumjodidia, minkå jålkeen kåsitellåån reagenssilla 3 0 R2Y. Vaihtoehtoisesti reaktio voidaan suorittaa hopeasuolan låsnå ollessa, kuten hopeaoksidin, hopeaperkloraatin, ho-peakarbonaatin tai hopeasalisylaatin tai nåiden seoksen låsnå ollessa, tai emåksen kuten kaliumkarbonaatin tai natriumhydroksidin låsnå ollessa. Eetterointi voidaan 35 edullisesti suorittaa orgaanisessa liuottimessa, kuten 9 90663 eetterisså, esim. dietyylieetterisså, tetrahydrofuraanissa tai dioksaanissa, tax amidissa, esim. dimetyyliformamidis-sa tai heksametyylifosforitriamidissa tai tallaisten liu-ottimien seoksessa huoneenlåmmosså. Naissa olosuhteissa 5 oksiminoryhman konfiguraatio pysyy pååosiltaan muuttumat-tomana eetterointireaktiossa.

Menetelmåvaihtoehdossa B kSytettavia kaavan III mukaisia IMhtoaineita voidaan valmistaa 5,23-diketonista, jolla on kaava (IV) 10 0 CH3 h 15 Λ I 0HJK.H (IV) ” nr'1*’ o 20 kasittelemållå sita ekvivalenttimaaralla yhdistetta H2NOR2 (jossa R2 on edella maaritelty) kayttåen edella kaavan I mukaisten aineiden valmistuksen yhteydessa esitettyja ok-siiminmuodostusolosuhteita.

25 Kaavan IV mukaisia yhdisteita voidaan valmistaa ha- pettamalla yhdisteita, joilla on kaava (V)

OH

CHt JL ^ch3 JLJ H Γι' C^T sY™3 ch3"h|i yC V <v> o 35 “ 10 90 6 ζ 3

Reaktio voidaan suorittaa hapettimella, joka muut-taa sekundaarisen hydroksyyliryhman oksoryhmåksi, jolloin saadaan kaavan IV mukainen yhdiste.

Sopivia hapettimia ovat kinonit veden lasna olles-5 sa, esim. 2,4-dikloori-5,6-disyaani-l,4-bentsokinoni tai 2,3,5,6-tetrakloori-l,4-bentsokinoni; kromi(VI)hapetin, esim. natrium- tai pyridiniumdikromaatti tai kromitrioksi-di pyridiinissa, edullisesti faasinsiirtokatalysaattorin lasna ollessa; mangaani(IV)hapetin, esim. mangaanidioksidi 10 dikloorimetaanissa; N-halogeenisukkinimidi, esim. N-kloo-risukkinimidi tai N-bromisukkinimidi; dialkyylisulfoksidi, esim. dimetyylisulfoksidi, aktivoivan aineen, kuten N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidin tai asyylihalogenidin, esim. oksalyylikloridin lasna ollessa; tai pyridiini-rikkitriok-15 sidikompleksi.

Reaktio voidaan edullisesti suorittaa sopivassa liuottimessa, joka voi olla ketoni, esim. asetoni, eette-ri, esim. dietyylieetteri, dioksaani tai tetrahydrofuraa-ni, hiilivety, esim. heksaani, halogeenihiilivety, esim. 20 kloroformi tai metyleenikloridi, tai esteri, esim. etyyli-asetaatti, tai substituoitu amidi, esim. dimetyyliformami-di. Voidaan myos kayttaå tållaisten liuottimien yhdistel-mia sellaisenaan tai veden kanssa. Liuottimen valinta riippuu rektiossa kaytetyn hapettimen tyypista.

25 Reaktio voidaan suorittaa lampotilassa -80 +50 °C.

Kaavan V mukaisia yhdisteita voidaan valmistaa esi-merkiksi viljelemalla Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 -kantaa (tallennettu syyskuun 10. 1984 talletuslai-30 toksen National Collections of Industrial and Marine Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Englanti, pysy-vaån kokoelmaan) tai sen mutanttia ja eristamalla yhdiste taten saadusta fermentointiliemesta.

Streptomyces-organismia voidaan viljellå tavanomai-35 silla menetelmillå, so. lisaamållå assimiloitavissa olevia li 90 66 3 hiili-, typpi- ja mineraalisuolalåhteitå. Assimiloitavissa olevat hiili-, typpi- ja mineraalisuolalåhteet voivat olla peråisin joko yksinkertaisista tai kompleksista ravinteis-ta, kuten esimerkiksi GB-patenttijulkaisussa 2 166 436 on 5 esitetty. Naita sisåltåviå sopivia ravintoalustoja kuva-taan jaljempanå kohdassa Valmiste 1. Streptomyces-organis-min viljely suoritetaan yleensa låmpotilassa 20 - 50 °C, edullisesti 25 - 40 °C:ssa ja suoritetaan edullisesti il-mastaen ja liikutellen, esim. ravistellen tai sekoittaen. 10 Ravintoalusta voidaan ensiksi inokuloida pienellå maårållå itioitya mikro-organismisuspensiota, mutta kasvun viivas-tymisen vålttåmiseksi voidaan valmistaa vegetatiivinen organismiymppi inokuloimalla pieni maåra viljelyalustaa organismin itiomuodolla ja saatu vegetatiivinen ymppi voi-15 daan siirtaa fermentointialustaan tai edullisemmin siirtaå yhteen tai useampaan kasvatusvaiheeseen, jossa lisåkasvu tapahtuu ennen kuin organismi siirretaån varsinaiseen fer-mentointialustaan. Fermentointi suoritetaan yleensa pH-alueella 5,5 - 8,5.

20 Fermentointia voidaan suorittaa 2-10 vuorokautta, esim. noin viisi vuorokautta.

Kaavan V mukaiset yhdisteet voidaan eriståa taten saadusta koko fermentointiliemesta tavanomaisilla eristys-ja erotusmenetelmilla. Voidaan kayttåå erilaisia frakti-25 ointimenetelmia, esimerkiksi adsorptio-eluutiota, saos-tamista, jakokiteyttamista ja liuotinuuttoa, joita voidaan yhdistaa eri tavoilla. Liuotinuutto ja kromatografia on todettu sopivimmiksi yhdisteen eristamis- ja erottamista-voiksi. Sopiva menetelma kaavan V mukaisten yhdisteiden 30 valmistamiseksi naita menetelmia kayttaen on esitetty jaljempanå kohdassa Valmiste 1.

Seuraavassa esitetysså kaavan V mukaisen yhdisteen valmistusta kuvaavassa kohdassa Valmiste 1 sekå jaljempanå esitetyisså esimerkeisså låmpotilat on annettu celsiusas-35 teina, EtOH tarkoittaa etanolia ja yhdisteet on nimetty 12 90 663 tunnettujen "Tekijoiden" , tekijoiden A, B, C ja D johdan-naisina. Tekija A on seuraavassa annetun kaavan VI mukai-nen yhdiste, jossa R1 on isopropyyli ja R3 on vety; tekija B on kaavan VI mukainen yhdiste, jossa R1 on metyyli ja R3 5 on metyyli; tekija C on kaavan VI mukainen yhdiste, jossa R1 on metyyli ja R3 on vety; ja tekija D on kaavan VI mukainen yhdiste, jossa R1 on etyyli ja R3 on vety.

10 OH

CHi X 0'CH3 '"’ Ml „ 15 Si

IjMyll (VI) H i J OR3 20

Valmiste 1

5-keto-tekija A

Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 itioitå inokuloitiin seuraavista aineista valmistetuille agar-25 levyille: gi'

Hiivauute (Oxoid L21) 0,5

Mallasuute (Oxoid L39) 30,0

Mykologinen peptoni (Oxoid L40) 5,0 30 Agar nro 3 (Oxoid L13) 15,0

Tislattu vesi, ad 1 litra pH noin 5,4 ja inkuboitiin 28 °C:ssa 10 vuorokautta.

Valmiit levyt peitettiin tamån jålkeen 6 ml :11a 35 10-%:ista glyseroliliuosta ja raaputettiin steriilillå 13 90663 apuvSlineelia itiiiiden ja sienirihraaston irrottamiseksi. Saadusta itiOsuspensiosta siirrettiin 0,4 ml:n maaria ste-riileihin polypropyleenipilleihin, jotka taman jaikeen kuumasaumattiin ja sailytettiin nestetypen hOyryssa, kun-5 nes ne kaytettiin.

Kahteen erlenmeyerpulloon valmistettiin kumpaankin 50 ml kasvatusalustaa, jonka koostumus oil seuraava: gi"1 D-glukoosia 15,0 10 Glyserolia 15,0

Soijapeptonia 15,0

NaCl 3,0

CaC03 1,0

Tislattua vetta ad 1 litra 15 (Alustan saatamatOn pH oli 6,7, joka saadettiin pH-arvoon 7,0 natriumhydroksidin vesiliuoksella ennen au-toklavointia. Alustan pH-arvo oli 7,3 autoklavoinnin jaikeen). Molemmat pullot inokuloitiin 0,2 ml:11a iticisuspen-20 siota, joka otettiin pillista.

Pulloja inkuboitiin 28 °C:ssa kolme vuorokautta ra-vistelijalla, joka pyOri 250 rpm 50 mm:n kokoisissa ym-pyrOissa.

Kummankin pullon sisaitO kaytettiin 70 l:n fermen-25 torin inokulointiin, joka sisaisi 40 1 samaa alustaa, jo- hon oli lisatty polypropyleenia 2000 (0,06 tilavuus-%).

Polypropyleenia 2000 lisåttiin tarvittaessa fermentoinnin aikana vaahdonmuodostuksen hallitsemiseksi. Fermentointi suoritettiin 28 °C:ssa, ravistellen ja ilmastaen riitta-30 vasti liuenneen hapen maaran pitamiseksi suurempana kuin kuin 30 % kyliastyspitoisuudesta. 24 tunnin fermentoinnin jaikeen siirrettiin 9 1 liemesta 700 l:n fermentoriin, joka sisaisi 450 1 koostumukseltaan seuraavaa alustaa: 14 90663 gi' D-glukoosia 2,8

Mallasdekstriiniå (MD30E) 27,8

Arkasoy 50 13,9 5 Melassia 1,7 K2HP04 0,14

CaC03 1,39

Silikonia 525 (Dow Corning) 0,06 % (t/t) pH såådettiin arvoon 6,5 ennen sterilointia.

10 Fermentointi suoritettiin 28 °C:ssa sekoittaen ja ilmastaen. Polypropyleenia 200 lisåttiin vaahdoneståjaksi tarvittaessa ja pH pidettiin arvossa 7,2 lisååmålla H2S04:a, kunnes tuote otettiin talteen. Fermentointikasvus-to keråttiin viiden vuorokauden jalkeen.

15 Fermentointiliemi (450 1) kirkastettiin Westfalia KA 25 -sentrifugissa ja supernatanttijåannos korvattiin vedella (20 1). Talteenotettuja soluja (25,5 kg) sekoitet-tiin yhden tunnin ajan Silverson BX -mallisessa mikserisså tarpeellisessa maarasså metanolia, jotta saatiin kokonais-20 tilavuudeksi 75 l. Suspensio suodatettiin ja kiinteåa jåannostå uutettiin uudelleen metanolilla (35 1) ja suodatettiin. Yhdistetty suodos (87 1) laimennettiin vedella (40 1) ja uutettiin 60 - 80 °C:n petrolieetterillå (30 1). 30 minuutin jalkeen faasit erotettiin Westfalia MEM 1256 -25 sentrifugissa ja alempi metanolifaasi uutettiin uudelleen 60 - 80 °C:n petrolieetterillå (30 1) veden lisayksen (40 1) jålkeen. Erotuksen jalkeen alempi faasi uutettiin taas 60 - 80 °C:n petrolieetterillå (30 1). Yhdistetyt petroli-eetterifaasit (85 1) vakevoitiin kolme kertaa Pfaudler 30 8.8-12V-27 "wiped-film"-haihduttimella (hoyrynpaine 0,1 baaria, hoyrystymislampdtila 20 °C, hoyryn lampotila 127 °C) . Vakevoity liuos (9 1) kuivattiin natriumsulfaa-tilla (2 kg) ja vakevoitiin lisaksi alipaineessa 40 °C:ssa kiertohaihduttimessa.

15 90663

Oljymåinen jåånnos (130 g) liuotettiin kloroformiin tilavuuteen 190 ml ja tMma kaadettiin kloroformilla pakat-tuun Merck 7734 silika 60 -pylvååseen (200 x 4 cm). Pylvas pestiin kloroformilla (500 mL) ja eluoitiin klorofor-5 mi/etyyliasetaattiseoksella (3:1) ja noin 40 ml:n fraktiot keråttiin 1400 ml:n esipåaston jalkeen.

Fraktiot 32 - 46 yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin oljy (21,2 g). Fraktiot 47 - 93 yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin oljy (20,1 g), joka 10 liuotettiin lopulliseen tilavuuteen 50 ml kloroformi/etyy-liasetaattiseokseen (3:1) ja kaadettiin kloroformi/etyyli-asetaatiseoksen avulla (3:1) pakattuun Merck 7734 silika 60 -pylvaaseen (200 x 4 cm) ja keråttiin noin 40 ml:n fraktiot 1400 ml:n esipaaston jalkeen. Fraktiot 22 - 36 15 yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin oljy (3,1 g) , joka lisåttiin ensimmaisen pylvåan fraktioista 32 - 46 saatuun oljyyn. Yhdistetyt oljyt liuotettiin kiehuvaan metanoliin (4 ml) , joka taman jalkeen lisåttiin kuumaan propan-2-oliin (20 ml) ja annettiin kiteytyå.

20 Kiteytymisen jalkeen neste haihdutettiin, jolloin saatiin oljy, joka liuotettiin samaan tilavuuteen metylee-nikloridia ja kaadettiin metyleenikloridilla pakattuun Merck Kieselgel 60 (70 - 230 mesh ASTM, tuote nro 7734) pylvaaseen (30 x 2,2 cm). PylvMs pestiin metyleeniklori-25 dilla (2 x pylvåsvolyymi) ja eluoitiin kloroformietyyli-asetaatilla (3:1) (2 x pylvåsvolyymi). Eluaatin haihdutus antoi oljyn, joka liuotettiin metanoliin ja siile suori-tettiin preparatiivinen Spherisorb S5 ODS-2 HPLC (250 x 20 mm, Phase Sep. Ltd.). Nåyteannokset (5 ml) pumpattiin ko-30 lonniin yhden minuutin aikana ja kolonni eluoitiin aseto-nitriili/vesiseoksellå (7:3) seuraavissa olosuhteissa: 16 90 663

Aika (min) Virtaus (ml/min) 0,00 0,00 ) Injektioaika 1,00 0,00 1,10 30,00 5 39,90 30,00 40.00 35,00 75.00 35,00 HPLC-kolonnista eluoitu materiaali tutkittiin UV-spektrofotoskopian avulla 238 nm:ssa.

10 Haihdutettiin yhdistetyt fraktiot, joiden piikit eluoituivat 33,4 minuutin kohdalla, jolloin saatiin otsi-kon yhdiste (34 mg) kiinteåna aineena.

E.I.-massaspektroskopia antoi molekulaarisen ionin 610:ssa ja tunnusomaiset fragmentit seuraavissa arvoissa: 15 592 574 556 422 259 20 241

Kaavan I mukaisilla yhdisteillla on antibioottista aktiivisuutta esim. matolSakkeinå, esimerkiksi sukkulama-toja vastaan, ja erityisesti anti-endoparasiittista ja 25 anti-ektoparasiittista aktiivisuutta.

Ektoparasiitit ja endoparasiitit infektoivat ihmi-sia ja useita elaimia ja ne ovat erityisen yleisia koti-elåimilla, kuten sioilla, lampailla, nautaelåimilla, vuo-hilla ja siipikarjalla (esim. kanoilla ja kalkkunoilla), 30 hevosilla, kaneilla, riistalinnuilla, hakkilinnuilla seka kotielaimilla, kuten koirilla, kissoilla, marsuilla, an-tilooppirotilla ja hamstereilla. Karjan parasiitti-infek-tiot, jotka johtavat anemiaan, aliravitsemukseen ja painon alenemiseen, ovat tarkea syy taloudelliseen tappioon ympa-35 ri maailman.

17 90663

Esimerkkeja naistå elaimia ja/tai ihmisia infek-toivista endoparasiittilajeista ovat Ancylostoma, Ascari-dia, Ascaris, Aspicular, Brugia, Bunostomum, Capillaria, Chabertia, Cooperia, Cyathostomes, Dictyocaulus, Dirofi-5 laria, Dracunculus, Enterobius, Gastrophilus, Haemonchus, Heterakis, Hyostrongylus, Loa, Metastrongylus, Necator, Nematodirus, Nematospiroides, Nippostrongylus, Oesophagos-tomum, Onchocerca, Ostertagia, Oxyuris, Parafilaria, Pa-rascaris, Probstmayria, Strongylus, Strongyloides, Sypha-10 cia, Thelazia, Toxascaris, Toxocara, Trichonema, Trichost-rongylus, Trichinella, Trichuris, Triodontophorus, Un-cinaria ja Wuchereria.

Esimerkkeja elaimia ja/tai ihmisia infektoivista ektoparasiiteista ovat artropodi-ektoparasiitit kuten pu-15 revat hyonteiset, lihakarpanen, kirput, tåit, punkit (mites) , imevat hydnteiset, punkit (ticks) ja muut kaksisii-piset tuholaiset.

Esimerkkeja tållaisista elaimia ja/tai ihmisia infektoivista ektoparasiittilajeista ovat Ambylomma, anophe-20 les, Boophilus, Chorioptes, Culexpipiens, Culliphore, De-modex, Damalinia, Dermatobia, Haematobia, Haematopinus, Haemophysalis, Hyaloma, Hypoderma, Ixodes, Linognathus, Lucilia, Melophagus, Oestrus, Otobius, Otodectes, Psorer-gates, Psoroptes, Rhipicephalus, Sarcoptes, Solenopotes, 25 Stomoxys ja Tabanus.

Kaavan I mukaiset yhdisteet on todettu tehokkaiksi seka in vitro etta in vivo useita endoparasiitteja ja ek-toparasiitteja vastaan. Kaavan I mukaisten yhdisteiden antibioottinen aktiivisuus voidaan osoittaa esimerkiksi 30 niiden aktiivisuudella vapaasti elaviå sukkulamatoja vas taan, esim. Caenorhabditis elegans ja Nematospiroides du-bius -lajeja vastaan.

Kaavan (I) mukainen yhdiste, jossa R1 on isopropyy-liryhma, R2 on metyyliryhma ja OR3 on hydroksyyliryhmå, 35 on aktiivinen laajaa endo- ja ektoparasiittiryhmåå vasta- 18 9066 3 an. Taman yhdisteen on esimerkiksi todettu olevan aktiivi-nen in vivo parasiittisia sukkulamatoja vastaan, kuten lajeja Ascaris, Cooperia curticei, Cooperia oncophora, Cyathostomes, Dictyocaulus viviparus, Dirofilaria immitis, 5 Gastrophilus, Haemonchus contortus, Nematodirus battus, Nematodirus helvetianus, Nematodirus spathiger, Nematospi-roides dubius, Nippostrongylus braziliensis, Oesophaosto-mum, Onchocera gutturosa, Ostertagia circumcincta, Oster-tagia ostertagi, Oxyuris equi, Parascaris equorum, Probst-10 mayria, Strongylus edentatus, Strongylus vulgaris, Toxoca-ra canis, Trichostrongylus axei, Trichostrongylus vitri-nus, Triodontophorus ja Uncinaria stenocephala seka parasiittisia toukkia, syyhypunkkeja (mange mites), punkkeja (ticks) ja tåitå vastaan, kuten Ambylomma hebraeum, Anoph-15 eles stevensi, boophilus dicolarartus, Boophilus microplus, Chorioptes ovis, Culexpipiens molestus, damalinia bovis, Dermatobia, Haematopinus, Hypoderma, Linognathus vituli, Lucilia sericata, Psoroptes ovis, Thipicephalus appendiculatus ja Sarcoptes vastaan.

20 Keksinnon mukaisesti valmistettuja kaavan (I) mu- kaisia yhdisteitå voidaan siksi kåyttaa antibiootteina. Erityisesti niita voidaan kåyttaa hoidettaessa elåimiå ja ihmisia, joilla on endoparasiittisia, ektoparasiittisia ja/tai sieni-infektioita.

25 Kaavan I mukaiset yhdisteet voidaan formuloida an- nettaviksi millå tahansa sopivalla elåinlååketieteesså tai lååketieteesså kåytettåvållå tavalla farmaseuttisina. Tål-laisia koostumuksia voidaan valmistaa tavanomaisella tavalla kåyttåen yhtå tai useampaa kantaja-ainetta tai tåy-30 teainetta. Tållaisiin koostumuksiin kuuvluvat myos ne, jotka on formuloitu erityisesti kåytettåvåksi parenteraa-lisesti (myos maitorauhaseen annettavaksi), oraalisesti, rektaalisesti, paikallisesti, potsiin siirrånnåisinå, of-talmisesti, nasaalisesti tai genito-urinaalisesti.

19 90663

Kaavan I mukaiset yhdisteet voidaan formuloida kay-tettåvaksi elåinlååketieteellisesti tai lååketieteellises-ti ruiskeena ja ne voivat olla yksikkoannosmuodossa, am-pulleissa tai muussa yksikkoannoksen sisaltavassa sailios-5 så tai moniannossailiossa, joihin tarvittaessa on lisåtty sailontaainetta. Ruiskeena annettavat koostumukset voivat olla suspensioina, liuoksina tai emulsioina vedettomissa tai vesipitoisissa valiaineissa ja ne voivat sisåltaa for-mulointi aineita kuten suspendoivia, stabiloivia, emulgoi-10 via, liuottavia ja/tai dispergoivia aineita. Vaihtoehtoi-sesti aktiivinen aineosa voi olla steriilina jauheena, joka saatetaan antomuotoon sopivalla valiaineella, esim. steriililla pyrogeenivapaalla vedella, ennen kayttoa. Ol-jymåisia våliaineita ovat polyhydriset alkoholit ja niiden 15 esterit, kuten glyseroliesterit, rasvahapot, kasvioljyt, kuten arakiscSljy, puuvillansiemenoljy tai fraktioitu koo-kosdljy, mineraalioljyt, kuten juokseva paraffiini, iso-propyylimyristaatti ja etyylioleaatti seka muut vastaavat yhdisteet. Muita valiaineita, kuten glyseroliformaalia, 20 propyleeniglykolia, polyetyleeniglykoleja, etanolia tai glykofuroolia sisaltavia valiaineita voidaan myos kåyttaå. Tavanomaisia ei-ionisia, kationisia tai anionisia pinta-aktiivisia aineita voidaan kåyttaa koostumuksessa yksin tai yhdistelmina.

25 Elåinlåaketieteellista kayttoa vårten koostumukset voidaan formuloida myos maitorauhaseen annettaviksi joko pitkåån vaikuttaviin tai nopeasti vapautuviin pohjiin, ja ne voivat olla steriileja liuoksia tai suspensioita vesi-tai oljypohjaisissa valiaineissa ja sisaltavat mahdolli-30 sesti sakeuttavia tai suspendoivia aineita, kuten pehmeåa tai kovaa paraffiinia, mehilaisvahaa, 12-hydroksistearii-nia, hydrattua risiinioljya, alumiinistearaatteja tai gly-seryylimonostearaattia. Tavanomaisia ei-ionisia, kationisia tai anionisia pinta-aktiivisia aineita voidaan kåyttaå 35 koostumuksessa yksin tai yhdistelminå.

20 90663

Kaavan I mukaiset yhdisteet voidaan formuloida ela-inlååketieteelliseen tai laaketieteelliseen kayttoon myos oraalista antomuotoa vårten sopivan muotoon, esimerkiksi liuoksiksi, siirappeiksi, emulsioiksi tai suspensioiksi 5 tai kuivaksi jauheeksi, joka saatetaan antomuotoon vedella tai muulla sopivalla valiaineella ennen kayttoa, mahdolli-sesti kayttaen maku- tai våriaineita. Voidaan kåyttåå myos kiinteitå koostumuksia, kuten tabletteja, kapseleita, pas-tilleja, pillereita, bolus-valmisteita, jauheita, pastoja, 10 rakeita, kuulia tai esiseoksia. Kiinteat ja nestemaiset koostumukset oraalista kayttoa vårten voidaan valmistaa kayttaen hyvin tunnettuja menetelmia. Tallaiset koostumukset voivat sisaltaa myos yhta tai useampaa farmaseuttises-ti hyvaksyttavaå kantajaa ja tayteainetta kiinteåssa tai 15 nestemaisessa muodossa. Esimerkkeja sopivista farmaseutti- sesti hyvåksyttavista kantajista kaytettavaksi kiinteisså annosmuodoissa ovat sideaineet (esim. esigelatinoitu mais-sitarkkelys, polyvinyylipyrrolidoni tai hydroksipropyyli-metyyliselluloosa); tayteaineet (esim. laktoosi, mikro-20 kiteinen selluloosa tai kalsiumfosfaatti); voiteluaineet (esim. magnesiumstearaatti, talkki tai silika); hajottavat aineet (esim. perunatarkkelys tai natriumtarkkelysglyko-laatti); tai kostuttavat aineet (esim. natriumlauryylisul-faatti). Tabletit voidaan paållystaå hyvin tunnettuja me-25 netelmia kayttaen.

Esimerkkeja sopivista farmaseuttisesti hyvåksyttavista lisåaineista kaytettavaksi nestemåisisså annosmuodoissa ovat suspendoivat aineet (esim. sorbitolisiirappi, metyyliselluloosa tai hydratut elintarvikerasvat) emulgoi-30 vat aineet (esim. lesitiini tai akasia) vedettomåt våliai-neet (esim. mantelioljy, oljyesterit tai etyylialkoholi) ja såilontåaineet (esim. metyyli- tai propyyli-p-hydroksi-bentsoaatit tai sorbiinihappo); stabiloivia ja liuottavia aineita voidaan myos lisåtå.

2i 90663

Oraalisesti kåytettåvåt tahnat voidaan formuloida kayttaen hyvin tunnettuja menetelmia. Esimerkkeja sopivis-ta farmaseuttisesti hyvåksyttavista lisaaineista kaytetta-viksi tahnaformulaatioissa ovat suspendoivat tai hyydyttå-5 vat aineet, kuten alumiinidistearaatti tai hydrattu ri-siinioljy; dispergoivat aineet, kuten polysorbaatit; ve-dettdmat valiaineet, kuten arakisoljy, oljyesterit, glyko-lit tai makrogolit; stabiloivat ja liuottavat aineet. Kaa-van I mukaisia yhdisteitå voidaan elainlaaketieteessa an-10 taa myos osana elaimen paivittaista kiinteaa tai neste-maista ravintoa, esim. lisattyna elaimen paivittåiseen ruokaan tai juomaveteen.

Kaavan I mukaisia yhdisteita voidaan kåyttaa elain-laaketieteessa myos oraalisesti pakkolaakitysmuodossa, 15 kuten aktiivisen aineosan liuoksena, suspensiona tai dis-persiona, yhdessa farmaseuttisesti hyvaksyttavan kantajan tai tayteaineen kanssa.

Kaavan I mukaiset yhdisteet voidaan myos formuloida esimerkiksi perapuikoiksi, jotka sisaltavat esim. tavan-20 omaisia laaketieteessa tai elainlaaketieteessa kaytettåvia perapuikkopohjia, tai ematinrenkaiksi, jotka sisaltavat esim. tavanomaisia ematinrenkaissa kaytettaviå pohjia.

Kaavan I mukaiset yhdisteet voidaan formuloida pai-kallista antoa vårten kaytettaviksi elainlaaketieteessa 25 tai laaketieteessa, salvana, voiteena, lotionina, shampoo-na, jauheena, sumuttimena, kylpyina, aerosoleina, tippoina (esim. silma- tai nenatippoina) tai "puor-on"-liuoksina. Salvat ja voiteet voidaan formuloida esimerkiksi vesipi-toiseen tai oljypitoiseen pohjaan, johon lisataan sopivaa 30 sakeuttavaa ja/tai gelatinoivaa ainetta. Silmasalvat voidaan valmistaa steriilisti kayttaen steriloituja aineosia. "Puor-on"-liuokset voidaan esimerkiksi formuloida kaytettaviksi elåinlåaketieteelliseen kayttoon orgaanisiin liu-ottimiin tai vesipohjaisena suspensiona ja ne voivat si-35 saltaa aineita, jotka edistavat adsorptiota ihon lapi, 22 90663 seka formulointiaineita, jotka liuottavat, stabiloivat, sSilovat tai muutoin parantavat sailymisominaisuuksia ja/ tai helppokayttdisyytta.

Lotionit voidaan formuloida vesi- tai oljypohjai-5 seen pohjaan ja ne sisåltåvåt yleensa myos yhta tai useam-paa emulgoivaa ainetta, stabiloivaa ainetta, dispergoivaa ainetta, suspendoivaa ainetta, sakeuttavaa ainetta tai variainetta.

Jauheet voidaan muodostaa kåyttaen mita tahansa 10 sopivaa jauhepohjaa. Tipat voidaan formuloida vesipohjai-seen tai ei-vesipohjaiseen pohjaan, joka sisaltaa myos yh-tS tai useampaa dispergoivaa ainetta, stabiloivaa ainetta, liuottavaa ainetta tai suspendoivaa ainetta. Ne voivat myos sisaltaa sailontåainetta.

15 Inhaloitavaa antomuotoa vårten kaavan I mukaiset yhdisteet voidaan toimittaa elainlaaketieteelliseen tai laaketieteelliseen kayttdon aerosolisumuttimena tai hengi-tyssuihkeena.

Kaavan I mukaisten yhdisteiden paivittaiset koko-20 naisannokset kaytettyna laaketieteessa ja elainlaåketie- teessa ovat sopivasti suuruusluokkaa 1 - 2 000 μg/\tq ruu-miinpainoa, edullisesti 5 - 800 /xg/kg, ja ne voidaan antaa jaettuina annoksina, esim. 1-4 kertaa paivassa. On ym-marrettavå, etta annostus vaihtelee ian ja potilaan yleis-25 tilan mukaan seka kasiteltavån organismin, antomuodon ja kulloinkin kåytetyn koostumuksen mukaan. Tietylle poti-laalle sopiva annostus voidaan måårittaa kayttaen ta-vanomaista harkintaa, esim. vertaamalla kyseesså olevan yhdisteen aktiivisuutta tunnettuun antibioottiseen ainee-30 seen.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksinnon mukaista menetelmaa kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi.

Esimerkki 1

25[E]-metoksi-imino-tekijå A 35 (a) 5,23-diketo-tekija A

23 90663 jaåkylmå våkevåsta rikkihaposta (1,2 ml) ja nat-riumdikromaatista (120 mg) ja vedesta (2 ml) valmistettu liuos lisattiin 15 minuutin alkana jaåkylmaan 5-ketoteki-jSå A (200 mg) ja tetrabutyyliammoniumvetysulfaattia 5 (15 mg) etyyliasetaatissa (4 ml) sisaitavaan liuokseen se- koittaen voimakkaasti. Yhden tunnin jaikeen seos laimen-nettiin etyyllasetaatilla ja orgaaninen faasi pestiin kyl-lastetylia natriumbikarbonaatin vesiliuoksella. Kuivattu orgaaninen faasi haihdutettiin ja kumimainen jaannOs puh-10 distettiin kromatografialla Merck Kieselgel 60 230 - 400 mesh -pylvaassa (100 ml). Eluoitiin 10-%:isella etyyliase-taatilla dikloorimetaanissa ja saatiin otsikon yhdiste vaaleankeltaisena vaahtona (86 mg) δ (CDC13) kasittavaa piikit 6,57 (m, IH); 2,50 (s, 2H) ja 1,89 (m 3H).

15 (b) 5-keto-23[E]-metoksi-imino-tekija A

Liuotettiin 5,23-diketo-tekija A (4,75 mg), metok-syyliamiinihydrokloridia (60 mg) ja vedetOnta natriumase-taattia (135 mg) metanoliin. Pidettiin 1,5 tuntia huoneen-lammfissa, minka jaikeen liuos pidettiin -18 °C:ssa 16 tun-20 tia, laimennettiin etyyliasetaatilla ja pestiin peråkkain 1 N kloorivetyhapolla, vedelia ja vakevalia suolaliuoksel-la. Kuivattu orgaaninen faasi haihdutettiin ja keltainen vaahto puhdistettiin kromatografialla Merck Kieselgel 60, 230 - 400 mesh (120 ml) -pylvaassa. Pylvaan eluutio hek-25 saani/etyyliasetaattiseoksella (4:1) antoi otsikon yhdis-teen keltaisena vaahtona (255 mg).

[a]*1 +80° (c 1,20, CHC13), max (EtOH) 241 nm ( 27 500), max (CHBr3) 3530, 3460 (OH) 1708 (C=0), 1676 (C=C-C=0), 986 (C-0), δ (CDC13) kasittaa 6,58 (s, IH); 3,84 (s, 4H); 30 4,80 (s, IH); 3,58 (m, IH); 3,30 (dl4, IH); 1,00 (d6, 3H); 0,96 (d6, 3H); 0,92 (d6, 3H).

(c) 23[E]-metoksi-imino-tekijå A

(i) Lisattiin natriumboorihydridia (6,5 mg) jaakyl-maan 5-keto-23[E]-metoksi-imino-tekijan A (83 mg) isopro-35 panoliliuokseen (20 ml). Keltaista seosta sekoitettiin 2" 90663 25 minuuttia jaåhauteessa, laimennettiin etyyliasetaatilla ja pestiin perakkåin 1 N kloorivetyhapolla, vedella ja vå-kevalla suolaliuoksella. Kuivattu orgaaninen faasi haih-dutettiin ja saatu keltainen kumimainen jåånnos puhdistet-5 tiin kromatografialla Merck Kieselgel 60, 230 - 400 mesh -pylvMSsså (60 ml) . Pylvaan eluutio heksaani/etyyliase-taattiseoksella (2:1) antoi otsikon yhdisteen keltaisena vaahtona (58 mg). Kiteyttåmållå heksaanista saatiin otsikon yhdistettå, sp. 203 °C.

10 [cr]u +133 (c 1,12, CHC13) , λ ^ (EtOH) 244 nm (ε 26 200), S (CDClj) kasittaå 4,29 (t7, IH); 3,84 (s, 3H); 3,29 (dl5, IH) .

(ii) 5-keto-23[E]-metoksi-imino-tekija A (50 mg) liuotettuna kuivaan tetrahydrofuraaniin (1 ml) lisåttiin 15 jååhdytettyyn (-78 °C) litium-tris-t-butoksialumiinihydri-dia (261 mg) sisaltavaan kuivaan tetrahydrofuraaniin (3 ml). Pidettiin 0,75 tuntia -78 °C:ssa, minkå jålkeen liuos laimennettiin etyyliasetaatilla (30 ml) ja pestiin perakkain 0,5 N kloorivetyhapolla ja vedella. Kuivattu or-20 gaaninen faasi haihdutettiin ja raakatuote puhdistettiin kromatografialla Merck Kieselgel 60, 230 - 400 mesh -pyl-vaassa (40 ml) , eluoitiin 25 % etyyliasetaattia sisåltå-valla heksaanilla ja saatiin otsikon tuote valkoisena vaahtona.

25 [α]ο +128 (c 0,95, CHC13) , S (CDC13) kasittaa 4,29 (t7, IH); 3,84 (s, 3H); 3,29 (dl5, IH).

Esimerkki 2 23[E]-metoksi-imino-tekija A, 5-asetaatti 23-keto-tekijan A 5-asetaatin (3,13 g, esimerkki 18 30 GB-patenttijulkaisussa 2 176 182) metanoliliuokseen lisat-tiin vedetonta natriumasetaattia (2,8 g) liuotettuna ve-teen (15 ml) ja sen jalkeen lisåttiin metoksiamiinivety-kloridia (3,01 g). Saatua liuosta sekoitettiin 1,5 tuntia 20 °C:ssa, laimennettiin etyyliasetaatilla ja pestiin per- 25 90663 åkkåin 0,5 N kloorivetyhapolla, vedella ja vakevålla suo-laliuoksella. Kuivattu orgaaninen faasi haihdutettiin mel-kein kuiviin ja valkea vaahto puhdistettiin kromatografi-alla Merck Kieselgel 60, 230 - 400 mesh -pylvaassa 5 (600 ml) . Pylvaan eluutio heksaani/etyyliasetaattiseoksel- la (4:1) antoi otsikon yhdisteen vårittomånå vaahtona (2,14 g). [a]o +128° (c 1,35, CHCl·,) Anux (EtOH) 244 nm (ε,ωχ 27 250); Vm„ (CHBr3) 3560, 3480 (OH), 1733 (asetaat- ti) , 1715 (OO), 995 (C-O) , S (CDC13) kåsittåå 5,5 - 5,6 10 (m, 2H); 3,84 (s, 3H); 3,29 (dl5, H); 2,16 (s, 3H).

Esimerkki 3 23[E]-hydroksi-imino-tekijan A 5-asetaatti 23-keto-tekijan A 5-asetaatin reaktio hydroksyyli-amiinihydrokloridin kanssa suoritettiin edella esimerkisså 15 1 kuvatulla tavalla. Raakatuote puhdistettiin kromatogra- fialla Merck Kieselgel 60, 230 - 400 mesh -pylvaassa, elu-oitiin etyyliasetaatti/asetonitriiliseoksella (4:1) ja saatiin otsikon yhdistetta vårittomånå vaahtona.

[«lå1 +132° (c 1,01, CHClj), λ m„x (EtOH) 244 nm (eniax 27 800), 20 Vmax (CHBr3) 3565, 3470 (OH) 1732 (asetaatti) , 1712 (OO) , 993 (C-O), <5 (CDC13) kasittaa 8,12 (s, IH); 5,5 - 5,6 (m, 2H); 3,42 (dl5, IH); 2,16 (s, 3H).

Esimerkki 4

23[E]-metoksi-imino-tekija A

25 Esimerkin 2 tuotteen (1,88 g) metanoliliuos jååhdy- tettiin jåahauteessa, lisattiin 1 N natriumhydroksidiliu-osta (5,6 ml) ja liuosta sekoitettiin jåahauteessa 1,5 tuntia. Liuos laimennettiin etyyliasetaatilla ja pestiin peråkkain 0,5 N kloorivetyhappoliuoksella, vedella ja vå-30 kevållå suolaliuoksella. Kuivattu orgaaninen faasi haihdutettiin ja saatu vaahto puhdistettiin kromatografia11a Merck Kieselgel 60, 230 - 400 mesh -pylvaassa (400 ml) .

Pylvås eluoitiin heksaani/etyyliasetaattiseoksella (2:1) ja saatiin våriton vaahto (1,429 g). Kiteyttåminen heksaa- 26 90663 nista antoi puhdasta otsikon tuotetta, sp. 203 °C.

[3]d +132 (c 1,21, CHClj) , (EtOH) 244 nm (f ^ 29 200), v,,,, (CHBr3) 3540 (OH) , 1708 (C=0) , 992 (C-O) , S (CDC13) kasittaa 4,29 (t7, 1H); 3,84 (S, 3H), 3,29 (dl5, 1H) .

5 Esimerkki 5 23[E]-hydroksi-imino-tekija Ά

Esimerkin 3 tuote hydrolysoitiin edellå esimerkissa 3 esitetyn menetelmån mukaisesti ja saatiin tuote, joka puhdistettiin kromatografia11a Merck Kieselgel 60, 230 400 10 mesh -pylvaassa (400 ml) eluoimalla heksaani/etyyliase- taattiseoksella (1:1), jolloin saatiin otsikon yhdistetta varittomana vaahtona.

[ch]d +140 (c 1,24, CHClj) (EtOH) 244 nm (t ltux 26 700), V1IUX (CHBr3) 3565, 3490 (OH), 1710 (C=0) , 994 (C-0), S 15 (CDC13) kasittaa 8,11 (s, 1H); 4,29 (t7, 1H); 3,41 (dl5, 1H) .

Esimerkki 6

23[E]-etoksi-imino-tekija A

Vedetdnta natriumasetaattia (140 mg) liuotettuna 20 veteen (3 ml) lisattiin liuokseen, jossa oli 23-keto-teki-jaa A (200 mg, esimerkki 23 GB-patenttijulkaisussa 2 176 182) ja etoksiamiinivetykloridia (126 mg) metanolissa (20 ml). Kahden tunnin jalkeen 20 °C:ssa liuos laimennettiin eetterilla (40 ml) ja pestiin vedella. Kuivattu orgaaninen 25 faasi haihdutettiin ja saatu valkea vaahto puhdistettiin kromatografialla Merck Kieselgel 60, 230 - 400 mesh -pylvaassa (90 ml). Pylvaån eluutio heksaani/etyyliasetaatti-seoksella (2:1) antoi otsikon yhdistetta varittomana vaahtona (189 mg).

30 [COJ1 +125 (c 1,00, CHClj) λ (EtOH) 244 nm 28 200), vm„ (CHBr3) 3540, 3480 (OH), 1705 (C=0) , 990 (C-0), 6 (CDC1,) kasittaa 4,30 (t7, 1H) ; 4,10 (q7, 2H) ; 3,31 (dl5, 1H); 1,24 (t7, 3H).

27 90663

Esimerkkien 7, 8 ja 9 yhdisteet valmistettiin sa-malla tavalla lahtoaineina 23-keto-tekijå A ja sopiva alk-oksiamiini.

Esimerkki 7 5 23[E]-allyyli-oksi-imiini-tekijå Ά [a]y +124° (c 1,17, CHClj) λ™, (EtOH) 244 nra ( ε 28 400), (CHBr3) 3550, 3490 (OH), 1708 (0=0) , 990 (c-O) , δ (CDClj) kasittaa 5,98 (m, 1H) ; 5,28 (dd 17,2, 1H) : 5,15 (dd 9,2, 1H); 4,5-4,7 (m, 2H); 4,29 (t7, 1H); 3,36 10 (dl4, 1H) valmistettiin allyylioksiamiinihydrokloridista.

Esimerkki 8

23[E]-isopropyylioksi-imino-tekija A

[<*]£' +116° (c 0,97, CHClj) λ (EtOH) 244 nm (ε* 25 000), (CHBr3) 3550, 3490 (OH), 1708 (0=0) , 15 992 (C-O), <S (CDClj) kasittaa 4,2-4,4 (m, 2H) ; 3,30 (dl4, 1H) ; 1,21 (d7, 3H) ; 1,20 (d7, 3H) valmistettiin isopropyy-lioksiamiinihydrokloridista.

Esimerkki 9

23[E]-butoksi-imino-tekija A

20 [α]β +115° (c 1,10, CHC13) λ ^ (EtOH) 244 nm (εηωΧ 31 800), (CHBr3) 3540, 3460 (OH), 1708 (C=0) , 992 (C-O), δ (CDC13) kasittaa 4,28 (t6, 1H) ; 4,03 (m, 2H) ; 3,96 (d6, 1H); 3,31 (dl4, 1H); 0,9 - 1,1 (m, 15H) valmistettiin n-butoksiamiinihydrokloridista.

25 Esimerkki 10 23[E]-metoksi-imino-tekija A,5-asetaatti (i) Lisattiin sekoittaen 3 M metyylimagnesiumjodi-diliuosta eetterissa (0,16 ml) esimerkin 3 tuotteen (120 mg) liuokseen kuivassa heksametyylifosforitriamidissa (5 30 ml) typpiatmosfåarissa. Lisattiin jodimetaania (0,09 ml) ja tunnin kuluttua seos laimennettiin etyyliasetaatilla (30 ml) ja pestiin perakkain 2 N kloorivetyhapolla ja ve-della. Kuivattu orgaaninen faasi haihdutettiin ja keltai-nen kumimainen jaannos puhdistettiin kromatografialla 28 90663

Merck Kieselqel 60, 230 - 400 mesh -pylvåassa (80 ml) . Pylvas eluoitiin heksaani/etyyliasetaattiseoksella (2:1) ja saatiin otsikon yhdistetta valkoisena vaahtona.

(e]D +123° (c 1,25, CHC13) λ max (EtOH) 245 nm (emax 30 300) 5 NMR oli kuten ylla esimerkissa 2.

(ii) Esimerkin 3 tuotetta (0,082 g) liuotettiin dietyylieetteriin (10 ml), joka sisalsi hopeaoksidia (0,4 g) , joka oli juuri valmistettu hopeanitraatista ja 2 M natriumhydroksidin vesiliuoksesta. Seosta sekoitettiin 10 huoneen lammossa kaksi tuntia, minka jalkeen se suodatet-tiin ja liuotin haihdutettiin, jolloin saatiin raakatuot-teena keltainen kumiraainen jåånnos. Tåmå jåånnos puhdis-tettiin preparatiivisella ohutkerroskromatografialla (Merck 5717) eluoimalla dikloorimetaani/asetoniseoksella 15 (25:1). Påavyohyke uutettiin asetonilla ja haihdutettiin, jolloin saatiin otsikon tuotetta (0,059 g). NMR on esitet-ty ylla esimerkissa 2.

Esimerkki 11 23[E]-metoksi-imino-tekijan A 5-metyylikarbamaatti 20 Metyyli-isosyanaattia (0,13 ml, 125 mg) ja trietyy- liamiinia (2 tippaa) lisattiin 23[E]-metoksi-iminotekijåå A (350 mg) sisåltavåan kuivaan dimetyyliformamidiin (0,75 ml). Pullo suljettiin ja kuumennettiin 5,5 tuntia 80 °C:ssa sekoittaen. Reaktioseos kaadettiin veteen 25 (50 ml) ja saatu seos suodatettiin piimaan låpi. Suodos- kakku pestiin vedellå (150 ml) ja uutettiin tåmån jalkeen dikloorimetaanilla (75 ml). Uute kuivattiin (MgS04) ja vå-kevoitiin, jolloin saatiin keltainen vaahto, joka puhdis-tettiin keskipainekromatografialla silikapylvååsså (125 g, 30 Merck Kieselgel 60, 230 - 400 mesh). Eluoitiin heksaani/-etyyliasetaattiseoksella (1:1) ja saatiin otsikon tuotetta valkoisena vaahtona (206 mg).

29 90663 [o]d +99 (c 0,55, CH2C12) (EtOH) 244,4 nm (ε mix 28 710), vmax (CHBr3) 3530 (OH), 3455 (NH) , 1720 (esteri) , 1720 + 1510 (karbamaatti) ja 993 cm'1 (C-O) , S (CDCl3) kasittaa 1,78 (s, 3H) ; 2,86 (d, 5 Hz, 3H) ; 3,29 (d, 14 Hz, IH); 5 3,83 (s, 3H); 4,80 (q, 5 Hz, IH) ja 5,50 (m, 2H).

Esimerkki 12 23[E]-metoksi-imino-tekija A,5-metyylikarbonaatti

Liuokseen, jossa oli 23[E]-metoksi-imino-tekijåå A (150 mg), dikloorimetaania (15 ml) ja pyridiiniå (0,3 ml), 10 lisattiin 0 °C:ssa sekoittaen metyyliklooriformaattia (0,7 ml 1,0 M liuos dikloorimetaanissa). Reaktioseos jå-tettiin 0-3 °C:seen 20 minuutiksi sekoittaen, minka jal-keen se lisattiin dikloorimetaaniin (70 ml) ja pestiin 2 N kloorivetyhapolla (50 ml) ja vedella (50 ml) . Orgaaninen 15 faasi kuivattiin (MgS04) ja liuotin poistettiin, jolloin saatiin vaahto, joka puhdistettiin keskipainekromatogra-fialla silikapylvåasså (40 g, Merck Kieselgel 60, 230 400 mesh). Eluoitiin dikloorimetaani/etyyliasetaattiseoksella (30:1), jolloin saatiin otsikon tuotetta valkoisena vaah-20 tona (127 mg).

[Ot]d +145° (c 0,41, CH2C12) , λ „„ (EtOH) 244,4 nm ( 32 210), (CHBr3) 3460 + 3540 (OH) 1742 (karbonaatti) , 1710 (esteri) ja 992 cm'1 (C-O) , δ (CDC13) kåsittåå 1,82 (s, 3H); 3,29 (d, 14 Hz, IH); 3,82 (s, 3H); 25 3,29 (d, 14 Hz, IH); 3,82 (s, 3H) ; 3,83 (S, 3H); 5,2 - 5,4 (m, 3H); 5,56 (s, IH).

Esimerkki 13 23[E]-metoksi-imino-tekija D,5-asetaatti 23-keto-tekijå D,5-asetaattia (251 mg, esimerkki 30 119 GB-patenttijulkaisussa 2 176 182), natriumasetaattia (250 mg) ja metoksiamiinivetykloridia (250 mg) sisaltavaa metanoliliuosta (40 ml) pidettiin 20 °C:ssa 24 tuntia, vå-kevditiin noin 10 ml:ksi, laimennettiin etyyliasetaatilla (50 ml) ja pestiin perakkain 0,5 N kloorivetyhapolla ja 30 90663 vedella. Kuivattu orgaaninen faasi haihdutettiin, jolloin saatiin keltainen vaahto, joka puhdistettiin kromatogra-fialla Merck Kieselgel 60, 230 - 400 mesh -pylvaasså (120 ml) . Pylvåån eluutio heksaanilla antoi otsikon yhdis-5 tetta vaaleankeltaisena vaahtona (144 mg); (EtOH) 244 nm (ε 26 400) , v max (CHBr3) (cm1) 3500 (OH), 1732 (OAc) , 1710 (C=0) , 5 (CDC13) kåsittåå 5,54 (m, 2H) ; 4,92 (m, IH); 3,84 (s, 3H); 3,32 (m, IH); 3,30 (dl4, IH); 2,17 (s, 3H); 1,91 (dl4, IH); 1,76 (s, 3H); 1,63 (s, 3H); 10 1,51 (s, 3H) ; 1,01 (t7, 3H); 0,99 (d6, 3H) ; 0,92 (d6, 3H) .

Esimerkkl 14

23[E]-metoksi-imino-tekija D

Esimerkin 13 tuotetta (140 mg) ja 1 N natrium-hydroksidia (0,6 ml) sisSltåvåå metanoliliuosta (8 ml) 15 sekoitettiin jaahauteella 1,5 tuntia. Liuos laimennettiin etyylisetaatilla (30 ml) ja pestiin perakkain IN kloori-vetyhapolla ja vedellM. Kuivattu orgaaninen faasi haihdutettiin, jolloin saatiin keltainen vaahto, joka puhdistettiin kromatografialla Merck Kieselgel 60, 230 - 400 20 mesh -pylvåassa (50 ml). Pylvaan eluutio heksaani/etyyli-asetaattiseoksella (2:1) antoi otsikon yhdistetta valkeana vaahtona (105 mg).

[α]ρ +96° (c 1,38, CHClj) , λ ^ (EtOH) 244 nm

(ε26 700), (CHBr3) (cm1) 3550, 3500 (OH), 1710 (C=0) , S

25 (CHC13) kasittaa 4,93 (m, IH); 4,30 (t6, IH); 3,95 (d6, IH); 3,84 (s, 3H); 3,30 (dl4, IH); 3,27 (m, IH); 1,88 (s, 3H) ; 1,64 (s, 3H) ; 1,52 (s, 3H); 1,01 (t7, 3H) ; 1,00 (d6, 3H); 0,92 (d6, 3H)

Esimerkkl 15

30 23[E]-metoksi-imino-tekija B

23-keto-tekijaa B (1 g, esimerkkl 19 GB-patentti-julkaisussa 2 176 182), natriumasetaattia (400 mg) ja me-toksiamiinivetykloridia (400 mg) sisaltavaå liuosta sekoitettiin 20 °C:ssa 20 tuntia, vakevditiin noin 10 ml:ksi.

3i 90663 laimennettiin etyyliasetaatilla ja pestiin vedella. Orgaa-ninen faasi pestiin peråkkåin 0,5 N kloorivetyhapolla ja vedella, kuivattu orgaaninen faasi haihdutettiin ja raa-katuote puhdistettiin kromatografialla Merck Kiselgel 60, 5 230 - 400 mesh -pylvaSsså (200 ml). Pylvaan eluutio etyy- liasetaatti/dikloorimetaaniseoksella (1:9) antoi otsikon yhdistetta valkoisena vaahtona (500 mg).

[0]¾1 +120° (c, 1,09, CHClj) , λ ^ (EtOH) 244 nm (£30 100), Vm>x (CHBr3) (cm1) 3540, 3460 (OH), 1708 (C=0) , δ 10 (CDC13) kasittaa 5,46 (q6, IH); 4,03 (d5, IH); 3,97 (d5, IH); 3,82 (s, 3H) ; 3,50 (s, 3H) ; 3,32 (m, IH); 3,29 (dl4, IH); 1,82 (s, 3H); 1,68 (d6, 3H); 1,00 (d6, 3H); 0,92 (d6, 3H) .

Esimerkki 16

15 23[E]-metoksi-imino-telcija C

Vedetontå natriumasetaattia (0,54 g) ja metoksi-amiinivetykloridia (0,58 g) lisattiin 23-keto-tekijåå C (1,97 g, esimerkki 12 GB-patenttijulkaisussa 2 176 182) ja vettå (5 ml) sisaltavaån metanol i liuokseen (30 ml) ja 20 seosta sekoitettiin 30 minuuttia huoneen lammossa. Lisattiin etyyliasetaattia (30 ml) ja 0,5 M kloorivetyhappoa (30 ml) ja vesifaasia uutettiin uudelleen etyyliasetaatilla (15 ml). Yhdistetyt orgaaniset faasit pestiin perakkain 0,5 M kloorivetyhapolla, 5-%:isella kyllastetyllå natrium-25 bikarbonaattiliuoksella ja 10-%:isella kyllastetylla nat-riumkloridiliuoksella, minka jålkeen liuos våkevoitiin va-kuumissa keltaiseksi vaahdoksi, joka puhdistettiin kromatograf ialla Merck 9385 -silikageelillå, jolloin pylvas aluksi kehitettiin dikloorimetaanilla ja sen jalkeen elu-30 oitiin dikloorimetaanilla, joka sisalsi pienen måårån etyyliasetaattia (enintåan 10 %), jolloin saatiin otsikon yhdistetta (1,0 g).

32 90663 [α]η +64 (c 1,00, CH30H) , ιΗ ΝΜΚ (CDC13) kåsittåa seuraavat signaalit 4,95 (m, 1H); 4,29 (t, 1H, 7 Hz); 3,96 (d, 1H, 7 Hz); 3,85 (s, 3H, = NOCH3) ; 3,66 (d, 1H, 10 Hz); 1,51 (s, 3H) ; 1,42 (t, 1H, 12 Hz); IR (CHBr3) 3620 - 3340 cm1 5 (-OH), 1711 cm1 (C=0).

Claims (2)

33 90663

1 OH °4^CH3 OR3 34 90663 jossa R1 ja OR3 ovat edellå mååritellyt, saatetaan reagoi-maan reagenssin H2NOR2 tai sen suolan kanssa, jossa R2 on edellå mååritelty, tai (B) kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, 5 jossa OR3 on hydroksyyliryhmå, pelkistetåån yhdiste, jolla on kaava (III) NOR2 CH CH s' 3 10 0J Jx X J C,iT XC„ ^ H1 H o (III)

15. Th I OH

0 Kr cH 3

20 H 0 jossa R1 ja R2 ovat edella mååritellyt, ja haluttaessa suoritetaan yksi tai useampi seuraavista reaktioista: 25 (i) hydrolysoidaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa OR3 on ryhma -OR4, -OCOR4, -0C02R4 tai -OCONRV, vastaavan kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa OR3 on hydroksyyliryhmå, (ii) kaavan I mukainen yhdiste, jossa R2 on alempi 30 alkyyli tai allyyli ja OR3 on hydroksyyliryhmå, eetteroi- dåån tai asyloidaan vastaavan kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa OR3 on ryhmå -OR4, -OCOR4, -0C02R4 tai -OCONR*R9, ja (iii) kaavan I mukainen yhdiste, jossa R2 on vety ja 35 90663 OR3 on ryhma -OR4, -OCOR4, -0C02R4 tai -OCONR*R9, saatetaan reagoimaan eetteroivån yhdisteen R2Y kanssa, jossa R2 on alempi alkyyli tai allyyli ja Y on poistuva ryhma, vastaa-van kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa R2 5 on alempi alkyyli tai allyyli.

1. Menetelma terapeuttisesti kåyttdkelpoisten mak-rolidiyhdisteiden valmistamiseksi, joilla on kaava (I)

5 NOR2 JL .xCH3 ch3 h ^ il" X. ^ch-, »\ ' η . r° iV ,Λ Li \ η I CH3 I^'h R (1) H10v °^cr° \ I ?h]> 15 ifl o_L* V"-. uCH3 Η I 3 jossa OR R1 on metyyli, etyyli tai isopropyyli;

20 R2 on vety, alempi alkyyli tai allyyli, ja ryhma =NOR2 on E-konfiguraatiossa; ja OR3 on hydroksyyliryhma tai ryhma -OR4, -OCOR4 tai -0C02R4, joissa R4 on alempi alkyyli, tai ryhma -OCONR*R9, jossa RK ja R9 ovat kumpikin itsenaisesti vety tai alempi alkyyli, 25 tunnettu siitå, ettå (A) yhdiste, jolla on kaava (II) O CH3 CH3 I H 1 30 CH3""K H X V %C·-0 (II)

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, t unnet t u siita, etta R1 on isopropyyli, R2 on metyyli ja R3 on hydroksyyliryhma. 36 90663