FI90663B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten makrolidiyhdisteiden valmistamiseksi - Google Patents

Description

1 90663

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten makrolidiyhdis-teiden valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää uusien antibioot-5 tisten makrolidiyhdisteiden valmistamiseksi.

GB-patenttijulkaisussa 2 166 436 esitetään uuden Streptomyces-lajin fermentointituotteista eristettävissä olevien S541-antibioottien tuottaminen.

Nyt on löydetty uusi antibioottista aktiivisuutta 10 omaava yhdisteryhmä, joka voidaan valmistaa modifioimalla S451-antibiootteja. Tämän yhdisteryhmän muodostavat makro-lidiyhdisteet, joilla on kaava (I) NOR2 CH „ I 3 H jix j?Jj ^ CH, n w o 3 •15 , a '‘k,, ^ · 20 ""R1

•H 1 H

10 \ °^c/° 9|| (I) ΊΙ phJ^h

25 O_L

CH3

H i 3 OR

jossa 30 R1 on metyyli, etyyli tai isopropyyli; R2 on vety, alempi alkyyli tai allyyli, ja ryhmä =NOR2 on E-konfiguraatiossa; ja OR3 on hydroksyyliryhmä tai ryhmä -OR4, -OCOR4 tai -0C02R4, joissa R4 on alempi alkyyli, tai ryhmä -OCONR8R9, jossa R8 35 ja R9 ovat kumpikin itsenäisesti vety tai alempi alkyyli, 2 90663

Kaavan I mukaisen yhdisteen sisältämä alkyyliryhmä R2 voi olla haarautumaton tai haarautunut.

Edullisissa kaavan I mukaisissa yhdisteissä R1 on isopropyy1iryhmä.

5 OR3-ryhmä on edullisesti metoksikarbonyylioksi-, tai erityisesti asetoksi-, metoksi- tai hydroksiryhmä. Yleensä kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa OR3 on hydroksiryhmä, ovat erityisen edullisia.

Tärkeitä keksinnön mukaisesti valmistettuja yhdis-10 teitä ovat ne kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa R1 on isopropyyliryhmä, R2 on metyyliryhmä ja OR3 on hydroksi-, asetoksi- tai metoksikarbonyylioksiryhmä.

Tärkeä keksinnön mukaisesti valmistettu yhdiste on kaavan I mukainen yhdiste, jossa R1 on metyyliryhmä, R2 on 15 metyyliryhmä ja OR3 on metoksiryhmä.

Toinen tärkeä keksinnön mukaisesti valmistettu yhdiste on kaavan I mukainen yhdiste, jossa R1 on etyyliryhmä, R2 on metyyliryhmä ja OR3 on hydroksyyliryhmä.

Erityisen tärkeä on kaavan I mukainen yhdiste, jos-20 sa R1 on isopropyyliryhmä, R2 on metyyliryhmä ja OR3 on hyd-roksyyliryhmä.

Tämän keksinnön kohteena on menetelmä edellä määriteltyjen kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi, ja tälle menetelmälle on tunnusomaista, että 25 (A) yhdiste, jolla on kaava (II) 3 90

O

A CH

CH., 3 A^o/T CH3 5 1 J H f] CH3'"‘K a

H H

Ac-"'0 I OH |>H (II) 10 0 CH3 OR3 15 jossa R1 ja OR3 ovat edellä määritellyt, saatetaan reagoimaan reagenssin H2NOR2 tai sen suolan kanssa, jossa R2 on edellä määritelty, tai (B) kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, 20 jossa OR3 on hydroksyyliryhmä, pelkistetään yhdiste, jolla on kaava (III) NOR2 A. CH7

f3 H A

0"-Lo c"3 ch3'"'K AI ^ R1 H 1

30 A aA

; AA 11111 °-4a -3 H o 4 90663 jossa R1 ja R2 ovat edellä määritellyt, ja haluttaessa suoritetaan yksi tai useampi seuraavista reaktioista: (i) hydrolysoidaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa 5 OR3 on ryhmä -OR4, -OCOR4, -0C02R4 tai -OCONR8R9, vastaavan kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa OR3 on hydroksyyliryhmä, (ii) kaavan I mukainen yhdiste, jossa R2 on alempi alkyyli tai allyyli ja OR3 on hydroksyyliryhmä, eetteröi- 10 dään tai asyloidaan vastaavan kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa OR3 on ryhmä -OR4, -OCOR4, -0C02R4 tai -OCONR8R9, ja (iii) kaavan I mukainen yhdiste, jossa R2 on vety ja OR3 on ryhmä -OR4, -OCOR4, -0C02R4 tai -OCONR8R9, saatetaan 15 reagoimaan eetteröivän yhdisteen R2Y kanssa, jossa R2 on alempi alkyyli tai allyyli ja Y on poistuva ryhmä, vastaavan kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa R2 on alempi alkyyli tai allyyli.

Menetelmävaihtoehdossa A oksiiminmuodostusreaktio 20 voidaan suorittaa vesipitoisessa tai vedettömässä reaktio-väliaineessa, edullisesti lämpötilassa -20 - +100 °C, esim. -10 - +50 °C:ssa. On edullista käyttää H2NOR2-rea-genssia suolanaan, esimerkiksi happoadditiosuolana, kuten vetykloridina. Kun käytetään tällaista suolaa, reaktio 25 voidaan suorittaa happoa sitovan aineen läsnä ollessa.

Käyttökelpoisia liuottimia ovat vesi ja veden kanssa sekoittuvat liuottimet, kuten alkoholit (esim. metanoli tai etanoli), amidit (esim. Ν,Ν-dimetyyliformamidi, Ν,Ν-dimetyyliasetamidi tai heksametyylifosforamidi), eet-30 terit (esim. sykliset eetterit, kuten tetrahydrofuraani tai dioksaani tai asykliset eetterit, kuten dimetoksietaa-ni tai dietyylieetteri), nitriilit (esim. asetonitriili), sulfonit (esim. sulfolaani), hiilivedyt, kuten halogenoi-dut hiilivedyt (esim. metyleenikloridi) ja esterit, kuten 35 etyyliasetaatti sekä kahden tai useamman näistä sisältävät seokset.

5 90663 Käytettäessä vesipitoisia olosuhteita reaktio voidaan edullisesti puskuroida pH-arvoon 2-9 sopivalla hapolla, emäksellä tai puskurilla.

Sopivia happoja ovat mineraalihapot, kuten kloori-5 vetyhappo tai rikkihappo, ja karboksyylihapot, kuten etik- kahappo. Sopivia emäksiä ovat alkalimetallikarbonaatit ja bikarbonaatit, kuten natriumbikarbonaatti, hydroksidit, kuten natriumhydroksidi, sekä alkalimetallikarboksylaatit, kuten natriumasetaatti. Sopiva puskuri on natriumasetaat-10 ti/etikkahappo.

Kaavan II mukaiset yhdisteet ovat joko GB-patentti-julkaisussa 2 176 182 esitettyjä tunnettuja yhdisteitä tai ne voidaan valmistaa siinä esitetyistä tunnetuista yhdisteistä käyttäen tavanomaisia menetelmiä.

15 Pelkistys menetelmävaihtoehdossa B voidaan suorit taa pelkistimellä, joka stereoselektiivisesti pelkistää 5-ketoryhmän. Sopivia pelkistimiä ovat boorihydridit, kuten aikai imetälliboorihydridit (esim. natriumboorihydri-di) , ja litiumalkoksialumiinihydridit, kuten litiumtri-20 butoksialumiinihydridi.

Boorihydridipelkistintä käytettäessä reaktio tapahtuu liuottimen, kuten alkanolin, esim. isopropyylialkoho-lin tai isobutyylialkoholin läsnä ollessa, edullisesti lämpötilassa, joka vaihtelee välillä -30 - +80 °C, esim. 25 0 °C:ssa. Litiumalkoksialumiinihydridiä käytettäessä reak tio tapahtuu liuottimen, kuten eetterin, esim. tetrahydro-furaanin tai dioksaanin, läsnä ollessa, edullisesti lämpötilassa, joka vaihtelee välillä -78 - 0 °c.

Kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa OR3 on ryhmä 3 0 -OR4, —OCOR4, —0C02R4 tai -OCONR*R9, voidaan muuttaa vastaa viksi kaavan I mukaisiksi yhdisteiksi, joissa OR3 on hyd-roksyyliryhmä, hydrolysoimalla sinänsä tunnetulla tavalla. Täten esimerkiksi asyyliryhmä, kuten asetyyliryhmä, voidaan poistaa emäksisellä hydrolyysillä, esim. käyttäen 35 natrium- tai kaliumhydroksidia alkoholiliuoksessa, tai 6 90663 happamalla hydrolyysillä, esim. käyttäen väkevää rikkihappoa metanolissa.

Kaavan I mukaisessa yhdisteessä, jossa R2 on alempi alkyyli tai allyyli ja OR3 on hydroksyyliryhmä, tämä hyd-5 roksyyliryhmä voidaan substituoida asylointi- tai eette-röintireaktioilla. Nämä reaktiot voidaan suorittaa käyttäen tavanomaisia menetelmiä, kuten seuraavassa on esitetty.

Täten esimerkiksi asylointi voidaan suorittaa käyt-10 täen asyloivaa ainetta, kuten kaavan R4COOH mukaista happoa tai sen reaktiivista johdannaista, kuten happohaloge-nidia (esim. happokloridia), -anhydridiä tai aktivoitua esteriä tai hapon R4OCOOH reaktiivista johdannaista.

Asyloinnit, joissa käytetään happohalogenideja tai 15 -anhydridejä, voidaan halutessa suorittaa happoa sitovan aineen läsnä ollessa, kuten tertiaarisen amiinin (esim. trietyyliamiinin, dimetyylianiliinin tai pyridiinin), epäorgaanisten emästen (esim. kalsiumkarbonaatin tai natriumbikarbonaatin) läsnä ollessa tai oksiraanien, kuten alem-20 pien 1,2-alkyleenioksidien (esim. etyleenioksidin tai pro-pyleenioksidin) läsnä ollessa, jotka sitovat asylointi-reaktiossa vapautuneen vetyhalogenidin.

Asyloinnit, joissa käytetään happoja, suoritetaan edullisesti kondensoivan aineen, esimerkiksi karbodi-imi-25 din kuten N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidin tai N-etyyli-N' - Y-dimetyyliaminopropyylikarbodi-imidin, karbonyyliyh-disteen, kuten karbonyylidi-imidatsolin, tai isoksatsoli-umsuolan kuten N-etyyli-5-fenyyli-isoksatsoliumperkloraa-tin läsnä ollessa.

30 Aktivoitu esteri voidaan edullisesti muodostaa in situ käyttäen esimerkiksi 1-hydroksibentsotriatsolia edellä esitetyn kondensoivan aineen läsnä ollessa. Vaihtoehtoisesti aktivoitu esteri voidaan muodostaa etukäteen.

Asylointireaktio voidaan suorittaa vesipitoisessa ; 35 tai vedettömässä reaktioväliaineessa, edullisesti lämpötilassa -20 - +100 °C, esim. -10 - +50 °C:ssa.

7 90663

Eetterinmuodostus voidaan suorittaa käyttäen kaavan R4Y mukaista reagenssia (jossa R4 on edellä määritelty ja Y on poistuva ryhmä, kuten kloori-, bromi- tai jodiatomi tai hydrokarbyylisulfonyylioksiryhmä, kuten mesyylioksi tai 5 tosyylioksi tai halogeenialkanoyylioksiryhmä, kuten di- klooriasetoksi). Reaktio voidaan suorittaa muodostamalla magnesiumalkoksidi käyttäen Grignard-reagenssia, kuten metyylimagnesiumhalogenidia, esim. metyylimagnesiumjodi-dia, tai käyttäen trialkyylisilyylimetyylimagnesiumhaloge-10 nidia, kuten trimetyylisilyylimetyylimagnesiumkloridia, minkä jälkeen käsitellään reagenssilla R4Y.

Vaihtoehtoisesti reaktio voidaan suorittaa hopea-suolan, kuten hopeaoksidin, hopeaperkloraatin, hopeakarbo-naatin tai hopeasalisylaatin tai näiden seosten läsnä oils lessa, ja tämä systeemi voi olla erityisen sopiva kun eetterinmuodostus suoritetaan käyttäen alkyylihalogenidia (esim. metyylijodidia).

Eetterinmuodostus voidaan edullisesti suorittaa liuottimessa, kuten esimerkiksi eetterissä, esim. dietyy-20 lieetterissä.

Kaavan I mukaisen yhdisteen hydroksyyliryhmän OR3 asylointi ryhmäksi OCONRÄR9 voidaan suorittaa sopivalla karbamoyloivalla aineella. Sopivia karbamyloivia aineita sellaisten yhdisteiden valmistamiseksi, joissa toinen ra-25 dikaaleista R8 ja R9 on vetyatomi ja toinen on alempi al-kyyliryhmä, ovat kaavan Rl0NCO mukaiset isosyanaatit (jossa R10 on alempi alkyyliryhmä). Karbamylointireaktio voidaan edullisesti suorittaa käyttäen mukana liuotinta, joka voi olla hiilivety (esim. aromaattinen hiilivety, kuten bent-30 seeni tai tolueeni), halogenoitu hiilivety (esim. dikloo- rimetaani), amidi (esim. formamidi tai dimetyyliformami-di) , esteri (esim. etyyliasetaatti) , eetteri (esim. syklinen eetteri, kuten tetrahydrofuraani tai dioksaani), ketoni (esim. asetoni), sulfoksidi (esim. dimetyylisulfoksidi) 35 tai näiden seos. Reaktio voidaan edullisesti suorittaa 8 90663 lämpötilassa, joka vaihtelee -80 °C:sta reaktioseoksen kiehumispisteeseen, esimerkiksi 100 °C:seen, edullisesti -20 - +30 °C:ssa.

Karbamoylointi voidaan suorittaa emäksen läsnä ol-5 lessa, esim. tertiaarisen orgaanisen emäksen, kuten tri-(alempi alkyyli)amiinin (esim. trietyyliamiinin) läsnä ollessa.

Toinen käyttökelpoinen karbamoylointiaine on syaa-nihappo, joka edullisesti valmistetaan in situ, esimerkik-10 si alkalimetallisyanaatista, kuten natriumsyanaatista, jolloin reaktio helpottuu hapon läsnä ollessa, esim. vahvan orgaanisen hapon, kuten trifluorietikkahapon läsnä ollessa. Syaanihappo vastaa tehokkaasti yllä mainittuja isosyanaattiyhdisteitä, joissa R10 on vety, ja muuttaa sik-15 si kaavan II mukaiset yhdisteet suoraan karbamoyylioksi-analogeiksi (so. kaavan I mukaisiksi yhdisteiksi, joissa OR3 on ryhmä 0C0NH2) .

Vaihtoehtoisesti karbamoylointi voidaan suorittaa reaktiolla fosgeenin tai karbonyylidi-imidatsolin ja sen 20 jälkeen ammoniakin tai sopivan substituoidun amiinin kanssa joko vesipitoisessa tai vedettömässä reaktioväliainees-sa.

Kaavan I mukainen yhdiste, jossa OR3 on substituoitu hydroksyyliryhmä ja R2 on vety, voidaan eetteröidä yhdis-25 teeksi, jossa R2 on alempi alkyyli tai allyyli.

Eetteröintireaktio voidaan suorittaa esimerkiksi muodostamalla magnesiumalkoksidi käyttäen Grignard-rea-genssia, kuten metyylimagnesiumhalogenidia, esim. metyyli-magnesium jodidia, minkä jälkeen käsitellään reagenssilla 3 0 R2Y. Vaihtoehtoisesti reaktio voidaan suorittaa hopeasuolan läsnä ollessa, kuten hopeaoksidin, hopeaperkloraatin, ho-peakarbonaatin tai hopeasalisylaatin tai näiden seoksen läsnä ollessa, tai emäksen kuten kaliumkarbonaatin tai natriumhydroksidin läsnä ollessa. Eetteröinti voidaan 35 edullisesti suorittaa orgaanisessa liuottimessa, kuten 9 90663 eetterissä, esim. dietyylieetterissä, tetrahydrofuraanissa tai dioksaanissa, tai amidissa, esim. dimetyyliformamidis-sa tai heksametyylifosforitriamidissa tai tällaisten liuottimien seoksessa huoneenlämmössä. Näissä olosuhteissa 5 oksiminoryhmän konfiguraatio pysyy pääosiltaan muuttumattomana eetteröintireaktiossa.

Menetelmävaihtoehdossa B käytettäviä kaavan III mukaisia lähtöaineita voidaan valmistaa 5,23-diketonista, jolla on kaava (IV) 10 o CH3 h “m S? 'H, 15 n, 'v I 0HJK.H (IV) IT^ 0 20 käsittelemällä sitä ekvivalenttimäärällä yhdistettä H2NOR2 (jossa R2 on edellä määritelty) käyttäen edellä kaavan I mukaisten aineiden valmistuksen yhteydessä esitettyjä ok-siiminmuodostusolosuhteita.

25 Kaavan IV mukaisia yhdisteitä voidaan valmistaa ha pettamalla yhdisteitä, joilla on kaava (V)

OH

ch3 JL *ch3 JLJ H Γι' L^T Τ'»4τ“3 tH'3"»ll I\ N,. m N. " o 35 10 90663

Reaktio voidaan suorittaa hapettimella, joka muuttaa sekundaarisen hydroksyyliryhmän oksoryhmäksi, jolloin saadaan kaavan IV mukainen yhdiste.

Sopivia hapettimia ovat kinonit veden läsnä olles-5 sa, esim. 2,4-dikloori-5,6-disyaani-l,4-bentsokinoni tai 2,3,5,6-tetrakloori-l,4-bentsokinoni; kromi(VI)hapetin, esim. natrium- tai pyridiniumdikromaatti tai kromitrioksi-di pyridiinissä, edullisesti faasinsiirtokatalysaattorin läsnä ollessa; mangaani(IV)hapetin, esim. mangaanidioksidi 10 dikloorimetaanissa; N-halogeenisukkinimidi, esim. N-kloo- risukkinimidi tai N-bromisukkinimidi; dialkyylisulfoksidi, esim. dimetyylisulfoksidi, aktivoivan aineen, kuten N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidin tai asyylihalogenidin, esim. oksalyylikloridin läsnä ollessa; tai pyridiini-rikkitriok-15 sidikompleksi.

Reaktio voidaan edullisesti suorittaa sopivassa liuottimessa, joka voi olla ketoni, esim. asetoni, eetteri, esim. dietyylieetteri, dioksaani tai tetrahydrofuraa-ni, hiilivety, esim. heksaani, halogeenihiilivety, esim. 20 kloroformi tai metyleenikloridi, tai esteri, esim. etyyliasetaatti, tai substituoitu amidi, esim. dimetyyliformami-di. Voidaan myös käyttää tällaisten liuottimien yhdistelmiä sellaisenaan tai veden kanssa. Liuottimen valinta riippuu rektiossa käytetyn hapettimen tyypistä.

25 Reaktio voidaan suorittaa lämpötilassa -80 +50 °C.

Kaavan V mukaisia yhdisteitä voidaan valmistaa esimerkiksi viljelemällä Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 -kantaa (tallennettu syyskuun 10. 1984 talletuslai-30 toksen National Collections of Industrial and Marine Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Englanti, pysyvään kokoelmaan) tai sen mutanttia ja eristämällä yhdiste täten saadusta fermentointiliemestä.

Streptomyces-organismia voidaan viljellä tavanomai-35 silla menetelmillä, so. lisäämällä assimiloitavissa olevia li 90 66 3 hiili-, typpi- ja mineraalisuolalähteitä. Assimiloitavissa olevat hiili-, typpi- ja mineraalisuolalähteet voivat olla peräisin joko yksinkertaisista tai kompleksista ravinteista, kuten esimerkiksi GB-patenttijulkaisussa 2 166 436 on 5 esitetty. Näitä sisältäviä sopivia ravintoalustoja kuvataan jäljempänä kohdassa Valmiste 1. Streptomyces-organis-min viljely suoritetaan yleensä lämpötilassa 20 - 50 °C, edullisesti 25 - 40 °C:ssa ja suoritetaan edullisesti ilmastaen ja liikutellen, esim. ravistellen tai sekoittaen. 10 Ravintoalusta voidaan ensiksi inokuloida pienellä määrällä itiöityä mikro-organismisuspensiota, mutta kasvun viivästymisen välttämiseksi voidaan valmistaa vegetatiivinen organismiymppi inokuloimalla pieni määrä viljelyalustaa organismin itiömuodolla ja saatu vegetatiivinen ymppi voi-15 daan siirtää fermentointialustaan tai edullisemmin siirtää yhteen tai useampaan kasvatusvaiheeseen, jossa lisäkasvu tapahtuu ennen kuin organismi siirretään varsinaiseen fer-mentointialustaan. Fermentointi suoritetaan yleensä pH-alueella 5,5 - 8,5.

20 Fermentointia voidaan suorittaa 2-10 vuorokautta, esim. noin viisi vuorokautta.

Kaavan V mukaiset yhdisteet voidaan eristää täten saadusta koko fermentointiliemestä tavanomaisilla eristys-ja erotusmenetelmillä. Voidaan käyttää erilaisia frakti-25 ointimenetelmiä, esimerkiksi adsorptio-eluutiota, saos-tamista, jakokiteyttämistä ja liuotinuuttoa, joita voidaan yhdistää eri tavoilla. Liuotinuutto ja kromatografia on todettu sopivimmiksi yhdisteen eristämis- ja erottamista-voiksi. Sopiva menetelmä kaavan V mukaisten yhdisteiden 30 valmistamiseksi näitä menetelmiä käyttäen on esitetty jäljempänä kohdassa Valmiste 1.

Seuraavassa esitetyssä kaavan V mukaisen yhdisteen valmistusta kuvaavassa kohdassa Valmiste 1 sekä jäljempänä esitetyissä esimerkeissä lämpötilat on annettu celsiusas-35 teinä, EtOH tarkoittaa etanolia ja yhdisteet on nimetty 12 90 663 tunnettujen "Tekijöiden", tekijöiden A, B, C ja D johdannaisina. Tekijä A on seuraavassa annetun kaavan VI mukainen yhdiste, jossa R1 on isopropyyli ja R3 on vety; tekijä B on kaavan VI mukainen yhdiste, jossa R1 on metyyli ja R3 5 on metyyli; tekijä C on kaavan VI mukainen yhdiste, jossa R1 on metyyli ja R3 on vety; ja tekijä D on kaavan VI mukainen yhdiste, jossa R1 on etyyli ja R3 on vety.

10 OH

CHi X 0'CH3 4v"CH3 „ Ss M ^ 15 Sl iPjyH (VI) H i J Ok3 20

Valmiste 1

5-keto-tekijä A

Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 itiöitä inokuloitiin seuraavista aineista valmistetuille agar-25 levyille: gi1

Hiivauute (Oxoid L21) 0,5

Mallasuute (Oxoid L39) 30,0

Mykologinen peptoni (Oxoid L40) 5,0 30 Agar nro 3 (Oxoid L13) 15,0

Tislattu vesi, ad 1 litra pH noin 5,4 ja inkuboitiin 28 °C:ssa 10 vuorokautta.

Valmiit levyt peitettiin tämän jälkeen 6 ml :11a 35 10-%:ista glyseroliliuosta ja raaputettiin steriilillä 13 90663 apuvälineellä itiöiden ja sienirihraaston irrottamiseksi. Saadusta itiösuspensiosta siirrettiin 0,4 ml:n määriä ste-riileihin polypropyleenipilleihin, jotka tämän jälkeen kuumasaumattiin ja säilytettiin nestetypen höyryssä, kun-5 nes ne käytettiin.

Kahteen erlenmeyerpulloon valmistettiin kumpaankin 50 ml kasvatusalustaa, jonka koostumus oli seuraava: gi"1 D-glukoosia 15,0 10 Glyserolia 15,0

Soijapeptonia 15,0

NaCl 3,0

CaC03 1,0

Tislattua vettä ad 1 litra 15 (Alustan säätämätön pH oli 6,7, joka säädettiin pH-arvoon 7,0 natriumhydroksidin vesiliuoksella ennen au-toklavointia. Alustan pH-arvo oli 7,3 autoklavoinnin jälkeen). Molemmat pullot inokuloitiin 0,2 ml:11a itiösuspen-20 siota, joka otettiin pillistä.

Pulloja inkuboitiin 28 °C:ssa kolme vuorokautta ra-vistelijalla, joka pyöri 250 rpm 50 mm:n kokoisissa ympyröissä.

Kummankin pullon sisältö käytettiin 70 l:n fermen-25 torin inokulointiin, joka sisälsi 40 1 samaa alustaa, johon oli lisätty polypropyleeniä 2000 (0,06 tilavuus-%).

Polypropyleeniä 2000 lisättiin tarvittaessa fermentoinnin aikana vaahdonmuodostuksen hallitsemiseksi. Fermentointi suoritettiin 28 °C:ssa, ravistellen ja ilmastaen riittä-30 västi liuenneen hapen määrän pitämiseksi suurempana kuin kuin 30 % kyllästyspitoisuudesta. 24 tunnin fermentoinnin jälkeen siirrettiin 9 1 liemestä 700 l:n fermentoriin, joka sisälsi 450 1 koostumukseltaan seuraavaa alustaa: 90663 gi1 D-glukoosia 2,8

Mallasdekstriiniä (MD30E) 27,8

Arkasoy 50 13,9 5 Melassia 1,7 K2HP04 0,14

CaC03 1,39

Silikonia 525 (Dow Corning) 0,06 % (t/t) pH säädettiin arvoon 6,5 ennen sterilointia.

10 Fermentointi suoritettiin 28 °C:ssa sekoittaen ja ilmastaen. Polypropyleeniä 200 lisättiin vaahdonestäjäksi tarvittaessa ja pH pidettiin arvossa 7,2 lisäämällä H2S04:a, kunnes tuote otettiin talteen. Fermentointikasvus-to kerättiin viiden vuorokauden jälkeen.

15 Fermentointiliemi (450 1) kirkastettiin Westfalia KA 25 -sentrifugissa ja supernatanttijäännös korvattiin vedellä (20 1). Talteenotettuja soluja (25,5 kg) sekoitettiin yhden tunnin ajan Silverson BX -mallisessa mikserissä tarpeellisessa määrässä metanolia, jotta saatiin kokonais-20 tilavuudeksi 75 1. Suspensio suodatettiin ja kiinteää jäännöstä uutettiin uudelleen metanolilla (35 1) ja suodatettiin. Yhdistetty suodos (87 1) laimennettiin vedellä (40 1) ja uutettiin 60 - 80 °C:n petrolieetterillä (30 1). 30 minuutin jälkeen faasit erotettiin Westfalia MEM 1256 -25 sentrifugissa ja alempi metanolifaasi uutettiin uudelleen 60 - 80 °C:n petrolieetterillä (30 1) veden lisäyksen (40 1) jälkeen. Erotuksen jälkeen alempi faasi uutettiin taas 60 - 80 °C:n petrolieetterillä (30 1). Yhdistetyt petroli-eetterifaasit (85 1) väkevöitiin kolme kertaa Pfaudler 30 8.8-12V-27 "wiped-film"-haihduttimella (höyrynpaine 0,1 baaria, höyrystymislämpötila 20 °C, höyryn lämpötila 127 °C) . Väkevöity liuos (9 1) kuivattiin natriumsulfaa-tilla (2 kg) ja väkevöitiin lisäksi alipaineessa 40 °C:ssa kiertohaihduttimessa.

15 90663 Öljymäinen jäännös (130 g) liuotettiin kloroformiin tilavuuteen 190 ml ja tämä kaadettiin kloroformilla pakattuun Merck 7734 silika 60 -pylvääseen (200 x 4 cm). Pylväs pestiin kloroformilla (500 mL) ja eluoitiin klorofor-5 mi/etyyliasetaattiseoksella (3:1) ja noin 40 ml:n fraktiot kerättiin 1400 ml:n esipäästön jälkeen.

Fraktiot 32 - 46 yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin öljy (21,2 g). Fraktiot 47 - 93 yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin öljy (20,1 g), joka 10 liuotettiin lopulliseen tilavuuteen 50 ml kloroformi/etyy-liasetaattiseokseen (3:1) ja kaadettiin kloroformi/etyyli-asetaatiseoksen avulla (3:1) pakattuun Merck 7734 silika 60 -pylvääseen (200 x 4 cm) ja kerättiin noin 40 ml:n fraktiot 1400 ml:n esipäästön jälkeen. Fraktiot 22 - 36 15 yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin öljy (3,1 g) , joka lisättiin ensimmäisen pylvään fraktioista 32 - 46 saatuun öljyyn. Yhdistetyt öljyt liuotettiin kiehuvaan metanoliin (4 ml) , joka tämän jälkeen lisättiin kuumaan propan-2-oliin (20 ml) ja annettiin kiteytyä.

20 Kiteytymisen jälkeen neste haihdutettiin, jolloin saatiin öljy, joka liuotettiin samaan tilavuuteen metylee-nikloridia ja kaadettiin metyleenikloridilla pakattuun Merck Kieselgel 60 (70 - 230 mesh ASTM, tuote nro 7734) pylvääseen (30 x 2,2 cm). Pylväs pestiin metyleeniklori-25 dilla (2 x pylväsvolyymi) ja eluoitiin kloroformietyyli-asetaatilla (3:1) (2 x pylväsvolyymi). Eluaatin haihdutus antoi öljyn, joka liuotettiin metanoliin ja sille suoritettiin preparatiivinen Spherisorb S5 ODS-2 HPLC (250 x 20 mm, Phase Sep. Ltd.). Näyteannokset (5 ml) pumpattiin ko-30 lonniin yhden minuutin aikana ja kolonni eluoitiin aseto-nitriili/vesiseoksellä (7:3) seuraavissa olosuhteissa: 16 90 663

Aika (min) Virtaus (ml/min) 0,00 0,00 ) Injektioaika 1,00 0,00 1,10 30,00 5 39,90 30,00 40.00 35,00 75.00 35,00 HPLC-kolonnista eluoitu materiaali tutkittiin UV-spektrofotoskopian avulla 238 nm:ssä.

10 Haihdutettiin yhdistetyt fraktiot, joiden piikit eluoituivat 33,4 minuutin kohdalla, jolloin saatiin otsikon yhdiste (34 mg) kiinteänä aineena.

E.I.-massaspektroskopia antoi molekulaarisen ionin 610:ssä ja tunnusomaiset fragmentit seuraavissa arvoissa: 15 592 574 556 422 259 20 241

Kaavan I mukaisilla yhdisteilllä on antibioottista aktiivisuutta esim. matolääkkeinä, esimerkiksi sukkulamatoja vastaan, ja erityisesti anti-endoparasiittista ja 25 anti-ektoparasiittista aktiivisuutta.

Ektoparasiitit ja endoparasiitit infektoivat ihmisiä ja useita eläimiä ja ne ovat erityisen yleisiä kotieläimillä, kuten sioilla, lampailla, nautaeläimillä, vuohilla ja siipikarjalla (esim. kanoilla ja kalkkunoilla), 30 hevosilla, kaneilla, riistalinnuilla, häkkilinnuilla sekä kotieläimillä, kuten koirilla, kissoilla, marsuilla, an-tilooppirotilla ja hamstereilla. Karjan parasiitti-infektiot, jotka johtavat anemiaan, aliravitsemukseen ja painon alenemiseen, ovat tärkeä syy taloudelliseen tappioon ympä-35 ri maailman.

17 90663

Esimerkkejä näistä eläimiä ja/tai ihmisiä infek-toivista endoparasiittilajeista ovat Ancylostoma, Ascari-dia, Ascaris, Aspicular, Brugia, Bunostomum, Capillaria, Chabertia, Cooperia, Cyathostomes, Dictyocaulus, Dirofi-5 laria, Dracunculus, Enterobius, Gastrophilus, Haemonchus, Heterakis, Hyostrongylus, Loa, Metastrongylus, Necator, Nematodirus, Nematospiroides, Nippostrongylus, Oesophagos-tomum, Onchocerca, Ostertagia, Oxyuris, Parafilaria, Pa-rascaris, Probstmayria, Strongylus, Strongyloides, Sypha-10 cia, Thelazia, Toxascaris, Toxocara, Trichonema, Trichost-rongylus, Trichinella, Trichuris, Triodontophorus, Un-cinaria ja Wuchereria.

Esimerkkejä eläimiä ja/tai ihmisiä infektoivista ektoparasiiteista ovat artropodi-ektoparasiitit kuten pu-15 revat hyönteiset, lihakärpänen, kirput, täit, punkit (mites) , imevät hyönteiset, punkit (ticks) ja muut kaksisiipiset tuholaiset.

Esimerkkejä tällaisista eläimiä ja/tai ihmisiä infektoivista ektoparasiittilajeista ovat Ambylomma, anophe-20 les, Boophilus, Chorioptes, Culexpipiens, Culliphore, De-modex, Damalinia, Dermatobia, Haematobia, Haematopinus, Haemophysalis, Hyaloma, Hypoderma, Ixodes, Linognathus, Lucilia, Melophagus, Oestrus, Otobius, Otodectes, Psorer-gates, Psoroptes, Rhipicephalus, Sarcoptes, Solenopotes, 25 Stomoxys ja Tabanus.

Kaavan I mukaiset yhdisteet on todettu tehokkaiksi sekä in vitro että in vivo useita endoparasiitteja ja ek-toparasiitteja vastaan. Kaavan I mukaisten yhdisteiden antibioottinen aktiivisuus voidaan osoittaa esimerkiksi 30 niiden aktiivisuudella vapaasti eläviä sukkulamatoja vas taan, esim. Caenorhabditis elegans ja Nematospiroides du-bius -lajeja vastaan.

Kaavan (I) mukainen yhdiste, jossa R1 on isopropyy-liryhmä, R2 on metyyliryhmä ja OR3 on hydroksyyliryhmä, 35 on aktiivinen laajaa endo- ja ektoparasiittiryhmää vasta- 18 9066 3 an. Tämän yhdisteen on esimerkiksi todettu olevan aktiivinen in vivo parasiittisia sukkulamatoja vastaan, kuten lajeja Ascaris, Cooperia curticei, Cooperia oncophora, Cyathostomes, Dictyocaulus viviparus, Dirofilaria immitis, 5 Gastrophilus, Haemonchus contortus, Nematodirus battus, Nematodirus helvetianus, Nematodirus spathiger, Nematospi-roides dubius, Nippostrongylus braziliensis, Oesophaosto-mum, Onchocera gutturosa, Ostertagia circumcincta, Oster-tagia ostertagi, Oxyuris equi, Parascaris equorum, Probst-10 mäyriä, Strongylus edentatus, Strongylus vulgaris, Toxoca-ra canis, Trichostrongylus axei, Trichostrongylus vitri-nus, Triodontophorus ja Uncinaria stenocephala sekä parasiittisia toukkia, syyhypunkkeja (mange mites), punkkeja (ticks) ja täitä vastaan, kuten Ambylomma hebraeum, Anoph-15 eles stevensi, boophilus dicolarartus, Boophilus micro-plus, Chorioptes ovis, Culexpipiens molestus, damalinia bovis, Dermatobia, Haematopinus, Hypoderma, Linognathus vituli, Lucilia sericata, Psoroptes ovis, Thipicephalus appendiculatus ja Sarcoptes vastaan.

20 Keksinnön mukaisesti valmistettuja kaavan (I) mu kaisia yhdisteitä voidaan siksi käyttää antibiootteina. Erityisesti niitä voidaan käyttää hoidettaessa eläimiä ja ihmisiä, joilla on endoparasiittisia, ektoparasiittisia ja/tai sieni-infektioita.

25 Kaavan I mukaiset yhdisteet voidaan formuloida an nettaviksi millä tahansa sopivalla eläinlääketieteessä tai lääketieteessä käytettävällä tavalla farmaseuttisina. Tällaisia koostumuksia voidaan valmistaa tavanomaisella tavalla käyttäen yhtä tai useampaa kantaja-ainetta tai täy-30 teainetta. Tällaisiin koostumuksiin kuuvluvat myös ne, jotka on formuloitu erityisesti käytettäväksi parenteraa-lisesti (myös maitorauhaseen annettavaksi), oraalisesti, rektaalisesti, paikallisesti, pötsiin siirrännäisinä, of-talmisesti, nasaalisesti tai genito-urinaalisesti.

19 90663

Kaavan I mukaiset yhdisteet voidaan formuloida käytettäväksi eläinlääketieteellisesti tai lääketieteellisesti ruiskeena ja ne voivat olla yksikköannosmuodossa, ampulleissa tai muussa yksikköannoksen sisältävässä säiliös-5 sä tai moniannossäiliössä, joihin tarvittaessa on lisätty säilöntäainetta. Ruiskeena annettavat koostumukset voivat olla suspensioina, liuoksina tai emulsioina vedettömissä tai vesipitoisissa väliaineissa ja ne voivat sisältää formulointi aineita kuten suspendoivia, stabiloivia, emulgoi-10 via, liuottavia ja/tai dispergoivia aineita. Vaihtoehtoisesti aktiivinen aineosa voi olla steriilinä jauheena, joka saatetaan antomuotoon sopivalla väliaineella, esim. steriilillä pyrogeenivapaalla vedellä, ennen käyttöä. Öl-jymäisiä väliaineita ovat polyhydriset alkoholit ja niiden 15 esterit, kuten glyseroliesterit, rasvahapot, kasviöljyt, kuten arakisöljy, puuvillansiemenöljy tai fraktioitu koo-kosöljy, mineraaliöljyt, kuten juokseva paraffiini, iso-propyylimyristaatti ja etyylioleaatti sekä muut vastaavat yhdisteet. Muita väliaineita, kuten glyseroliformaalia, 20 propyleeniglykolia, polyetyleeniglykoleja, etanolia tai glykofuroolla sisältäviä väliaineita voidaan myös käyttää. Tavanomaisia ei-ionisia, kationisia tai anionisia pinta-aktiivisia aineita voidaan käyttää koostumuksessa yksin tai yhdistelminä.

25 Eläinlääketieteellistä käyttöä varten koostumukset voidaan formuloida myös maitorauhaseen annettaviksi joko pitkään vaikuttaviin tai nopeasti vapautuviin pohjiin, ja ne voivat olla steriilejä liuoksia tai suspensioita vesi-tai öljypohjaisissa väliaineissa ja sisältävät mahdolli-30 sesti sakeuttavia tai suspendoivia aineita, kuten pehmeää tai kovaa paraffiinia, mehiläisvahaa, 12-hydroksistearii-nia, hydrattua risiiniöljyä, alumiinistearaatteja tai gly-seryylimonostearaattia. Tavanomaisia ei-ionisia, kationisia tai anionisia pinta-aktiivisia aineita voidaan käyttää 35 koostumuksessa yksin tai yhdistelminä.

20 90663

Kaavan I mukaiset yhdisteet voidaan formuloida eläinlääketieteelliseen tai lääketieteelliseen käyttöön myös oraalista antomuotoa varten sopivan muotoon, esimerkiksi liuoksiksi, siirappeiksi, emulsioiksi tai suspensioiksi 5 tai kuivaksi jauheeksi, joka saatetaan antomuotoon vedellä tai muulla sopivalla väliaineella ennen käyttöä, mahdollisesti käyttäen maku- tai väriaineita. Voidaan käyttää myös kiinteitä koostumuksia, kuten tabletteja, kapseleita, pastilleja, pillereitä, bolus-valmisteita, jauheita, pastoja, 10 rakeita, kuulia tai esiseoksia. Kiinteät ja nestemäiset koostumukset oraalista käyttöä varten voidaan valmistaa käyttäen hyvin tunnettuja menetelmiä. Tällaiset koostumukset voivat sisältää myös yhtä tai useampaa farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa ja täyteainetta kiinteässä tai 15 nestemäisessä muodossa. Esimerkkejä sopivista farmaseutti sesti hyväksyttävistä kantajista käytettäväksi kiinteissä annosmuodoissa ovat sideaineet (esim. esigelatinoitu mais-sitärkkelys, polyvinyylipyrrolidoni tai hydroksipropyyli-metyyliselluloosa); täyteaineet (esim. laktoosi, mikro-20 kiteinen selluloosa tai kalsiumfosfaatti); voiteluaineet (esim. magnesiumstearaatti, talkki tai silika); hajottavat aineet (esim. perunatärkkelys tai natriumtärkkelysglyko-laatti); tai kostuttavat aineet (esim. natriumlauryylisul-faatti). Tabletit voidaan päällystää hyvin tunnettuja me-25 netelmiä käyttäen.

Esimerkkejä sopivista farmaseuttisesti hyväksyttävistä lisäaineista käytettäväksi nestemäisissä annosmuodoissa ovat suspendoivat aineet (esim. sorbitolisiirappi, metyyliselluloosa tai hydratut elintarvikerasvat) emulgoi-30 vat aineet (esim. lesitiini tai akasia) vedettömät väliaineet (esim. manteliöljy, öljyesterit tai etyylialkoholi) ja säilöntäaineet (esim. metyyli- tai propyyli-p-hydroksi-bentsoaatit tai sorbiinihappo); stabiloivia ja liuottavia aineita voidaan myös lisätä.

2i 90663

Oraalisesti käytettävät tahnat voidaan formuloida käyttäen hyvin tunnettuja menetelmiä. Esimerkkejä sopivista farmaseuttisesti hyväksyttävistä lisäaineista käytettäviksi tahnaformulaatioissa ovat suspendoivat tai hyydyttä-5 vät aineet, kuten alumiinidistearaatti tai hydrattu risiiniöljy; dispergoivat aineet, kuten polysorbaatit; vedettömät väliaineet, kuten arakisöljy, öljyesterit, glykolit tai makrogolit; stabiloivat ja liuottavat aineet. Kaavan I mukaisia yhdisteitä voidaan eläinlääketieteessä an-10 taa myös osana eläimen päivittäistä kiinteää tai nestemäistä ravintoa, esim. lisättynä eläimen päivittäiseen ruokaan tai juomaveteen.

Kaavan I mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää eläinlääketieteessä myös oraalisesti pakkolääkitysmuodossa, 15 kuten aktiivisen aineosan liuoksena, suspensiona tai dispersiona, yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan tai täyteaineen kanssa.

Kaavan I mukaiset yhdisteet voidaan myös formuloida esimerkiksi peräpuikoiksi, jotka sisältävät esim. tavan-20 omaisia lääketieteessä tai eläinlääketieteessä käytettäviä peräpuikkopohjia, tai emätinrenkaiksi, jotka sisältävät esim. tavanomaisia emätinrenkaissa käytettäviä pohjia.

Kaavan I mukaiset yhdisteet voidaan formuloida paikallista antoa varten käytettäviksi eläinlääketieteessä 25 tai lääketieteessä, salvana, voiteena, lotionina, shampoo-na, jauheena, sumuttimena, kylpyinä, aerosoleina, tippoina (esim. silmä- tai nenätippoina) tai "puor-on"-liuoksina. Salvat ja voiteet voidaan formuloida esimerkiksi vesipitoiseen tai öljypitoiseen pohjaan, johon lisätään sopivaa 30 sakeuttavaa ja/tai gelatinoivaa ainetta. Silmäsalvat voidaan valmistaa steriilisti käyttäen steriloituja aineosia. "Puor-on"-liuokset voidaan esimerkiksi formuloida käytettäviksi eläinlääketieteelliseen käyttöön orgaanisiin liuottimiin tai vesipohjaisena suspensiona ja ne voivat si-35 sältää aineita, jotka edistävät adsorptiota ihon läpi, 22 90663 sekä formulointiaineita, jotka liuottavat, stabiloivat, säilövät tai muutoin parantavat säilymisominaisuuksia ja/ tai helppokäyttöisyyttä.

Lotionit voidaan formuloida vesi- tai öljypohjai-5 seen pohjaan ja ne sisältävät yleensä myös yhtä tai useampaa emulgoivaa ainetta, stabiloivaa ainetta, dispergoivaa ainetta, suspendoivaa ainetta, sakeuttavaa ainetta tai väriainetta.

Jauheet voidaan muodostaa käyttäen mitä tahansa 10 sopivaa jauhepohjaa. Tipat voidaan formuloida vesipohjaiseen tai ei-vesipohjaiseen pohjaan, joka sisältää myös yhtä tai useampaa dispergoivaa ainetta, stabiloivaa ainetta, liuottavaa ainetta tai suspendoivaa ainetta. Ne voivat myös sisältää säilöntäainetta.

15 Inhaloitavaa antomuotoa varten kaavan I mukaiset yhdisteet voidaan toimittaa eläinlääketieteelliseen tai lääketieteelliseen käyttöön aerosolisumuttimena tai hengi-tyssuihkeena.

Kaavan I mukaisten yhdisteiden päivittäiset koko-20 naisannokset käytettynä lääketieteessä ja eläinlääketie teessä ovat sopivasti suuruusluokkaa 1 - 2 000 μg/\tq ruumiinpainoa, edullisesti 5 - 800 /xg/kg, ja ne voidaan antaa jaettuina annoksina, esim. 1-4 kertaa päivässä. On ymmärrettävä, että annostus vaihtelee iän ja potilaan yleis-25 tilan mukaan sekä käsiteltävän organismin, antomuodon ja kulloinkin käytetyn koostumuksen mukaan. Tietylle potilaalle sopiva annostus voidaan määrittää käyttäen tavanomaista harkintaa, esim. vertaamalla kyseessä olevan yhdisteen aktiivisuutta tunnettuun antibioottiseen ainee-30 seen.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksinnön mukaista menetelmää kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi.

Esimerkki 1

25[E]-metoksi-imino-tekijä A 35 (a) 5,23-diketo-tekijä A

23 90663 Jääkylmä väkevästä rikkihaposta (1,2 ml) ja nat-riumdikromaatista (120 mg) ja vedestä (2 ml) valmistettu liuos lisättiin 15 minuutin aikana jääkylmään 5-ketoteki-jää A (200 mg) ja tetrabutyyliammoniumvetysulfaattia 5 (15 mg) etyyliasetaatissa (4 ml) sisältävään liuokseen se koittaen voimakkaasti. Yhden tunnin jälkeen seos laimennettiin etyyliasetaatilla ja orgaaninen faasi pestiin kyllästetyllä natriumbikarbonaatin vesiliuoksella. Kuivattu orgaaninen faasi haihdutettiin ja kumimainen jäännös puh-10 distettiin kromatografialla Merck Kieselgel 60 230 - 400 mesh -pylväässä (100 ml). Eluoitiin 10-%:isella etyyliasetaatilla dikloorimetaanissa ja saatiin otsikon yhdiste vaaleankeltaisena vaahtona (86 mg) δ (CDC13) käsittävää piikit 6,57 (m, 1H); 2,50 (s, 2H) ja 1,89 (m 3H).

15 (b) 5-keto-23[E]-metoksi-imino-tekijä Ä

Liuotettiin 5,23-diketo-tekijä A (4,75 mg), metok-syyliamiinihydrokloridia (60 mg) ja vedetöntä natriumase-taattia (135 mg) metanoliin. Pidettiin 1,5 tuntia huoneenlämmössä, minkä jälkeen liuos pidettiin -18 °C:ssa 16 tun-20 tia, laimennettiin etyyliasetaatilla ja pestiin peräkkäin 1 N kloorivetyhapolla, vedellä ja väkevällä suolaliuoksella. Kuivattu orgaaninen faasi haihdutettiin ja keltainen vaahto puhdistettiin kromatografialla Merck Kieselgel 60, 230 - 400 mesh (120 ml) -pylväässä. Pylvään eluutio hek-25 saani/etyyliasetaattiseoksella (4:1) antoi otsikon yhdisteen keltaisena vaahtona (255 mg).

[a]*1 +80° (c 1,20, CHC13), max (EtOH) 241 nm ( 27 500), max (CHBr3) 3530, 3460 (OH) 1708 (C=0), 1676 (C=C-C=0), 986 (C-0), δ (CDC13) käsittää 6,58 (s, 1H); 3,84 (s, 4H); 30 4,80 (s, 1H); 3,58 (m, 1H); 3,30 (dl4, 1H); 1,00 (d6, 3H); 0,96 (d6, 3H); 0,92 (d6, 3H).

(c) 23[E]-metoksi-imino-tekijä A

(i) Lisättiin natriumboorihydridiä (6,5 mg) jääkylmään 5-keto-23[E]-metoksi-imino-tekijän A (83 mg) isopro-35 panoliliuokseen (20 ml). Keltaista seosta sekoitettiin 2" 90665 25 minuuttia jäähauteessa, laimennettiin etyyliasetaatilla ja pestiin peräkkäin 1 N kloorivetyhapolla, vedellä ja väkevällä suolaliuoksella. Kuivattu orgaaninen faasi haihdutettiin ja saatu keltainen kumimainen jäännös puhdistet-5 tiin kromatografiällä Merck Kieselgel 60, 230 - 400 mesh -pylväässä (60 ml) . Pylvään eluutio heksaani/etyyliase-taattiseoksella (2:1) antoi otsikon yhdisteen keltaisena vaahtona (58 mg). Kiteyttämällä heksaanista saatiin otsikon yhdistettä, sp. 203 °C.

10 [cr]u +133 (c 1,12, CHC13) , λ ^ (EtOH) 244 nm (ε 26 200), S (CDClj) käsittää 4,29 (t7, 1H)? 3,84 (s, 3H); 3,29 (dl5, 1H) .

(ii) 5-keto-23[E]-metoksi-imino-tekijä A (50 mg) liuotettuna kuivaan tetrahydrofuraaniin (1 ml) lisättiin 15 jäähdytettyyn (-78 °C) litium-tris-t-butoksialumiinihydri-diä (261 mg) sisältävään kuivaan tetrahydrofuraaniin (3 ml). Pidettiin 0,75 tuntia -78 °C:ssa, minkä jälkeen liuos laimennettiin etyyliasetaatilla (30 ml) ja pestiin peräkkäin 0,5 N kloorivetyhapolla ja vedellä. Kuivattu or-20 gaaninen faasi haihdutettiin ja raakatuote puhdistettiin kromatografiällä Merck Kieselgel 60, 230 - 400 mesh -pylväässä (40 ml), eluoitiin 25 % etyyliasetaattia sisältävällä heksaanilla ja saatiin otsikon tuote valkoisena vaahtona.

25 [α]n +128 (c 0,95, CHC13) , S (CDC13) käsittää 4,29 (t7, 1H); 3,84 (s, 3H); 3,29 (dl5, 1H).

Esimerkki 2 23[E]-metoksi-imino-tekijä A, 5-asetaatti 23-keto-tekijän A 5-asetaatin (3,13 g, esimerkki 18 30 GB-patenttijulkaisussa 2 176 182) metanolilluokseen lisättiin vedetöntä natriumasetaattia (2,8 g) liuotettuna veteen (15 ml) ja sen jälkeen lisättiin metoksiamiinivety-kloridia (3,01 g). Saatua liuosta sekoitettiin 1,5 tuntia 20 °C:ssa, laimennettiin etyyliasetaatilla ja pestiin per- 25 90663 äkkäin 0,5 N kloorivetyhapolla, vedellä ja väkevällä suolaliuoksella. Kuivattu orgaaninen faasi haihdutettiin melkein kuiviin ja valkea vaahto puhdistettiin kromatografi-alla Merck Kieselgel 60, 230 - 400 mesh -pylväässä 5 (600 ml) . Pylvään eluutio heksaani/etyyliasetaattiseoksel- la (4:1) antoi otsikon yhdisteen värittömänä vaahtona (2,14 g). [<*]£' +128° (c 1,35, CHCl·,) Anux (EtOH) 244 nm (ε,ωχ 27 250); Vm„ (CHBr3) 3560, 3480 (OH), 1733 (asetaat- ti) , 1715 (C=0) , 995 (C-O) , S (CDC13) käsittää 5,5 - 5,6 10 (m, 2H); 3,84 (s, 3H); 3,29 (dl5, H); 2,16 (s, 3H).

Esimerkki 3 23[E]-hydroksi-imino-tekijän A 5-asetaatti 23-keto-tekijän A 5-asetaatin reaktio hydroksyyli-amiinihydrokloridin kanssa suoritettiin edellä esimerkissä 15 1 kuvatulla tavalla. Raakatuote puhdistettiin kromatogra- fialla Merck Kieselgel 60, 230 - 400 mesh -pylväässä, elu-oitiin etyyliasetaatti/asetonitriiliseoksella (4:1) ja saatiin otsikon yhdistettä värittömänä vaahtona.

[«lä1 +132° (c 1,01, CHClj), A max (EtOH) 244 nm (eniax 27 800), 20 Vmax (CHBr3) 3565, 3470 (OH) 1732 (asetaatti) , 1712 (OO) , 993 (C-O), <5 (CDC13) käsittää 8,12 (s, 1H) ; 5,5 - 5,6 (m, 2H); 3,42 (dl5, 1H); 2,16 (s, 3H).

Esimerkki 4

23[E]-metoksi-imino-tekijä A

25 Esimerkin 2 tuotteen (1,88 g) metanoliliuos jäähdy tettiin jäähauteessa, lisättiin 1 N natriumhydroksidiliu-osta (5,6 ml) ja liuosta sekoitettiin jäähauteessa 1,5 tuntia. Liuos laimennettiin etyyliasetaatilla ja pestiin peräkkäin 0,5 N kloorivetyhappoliuoksella, vedellä ja vä-30 kevällä suolaliuoksella. Kuivattu orgaaninen faasi haihdutettiin ja saatu vaahto puhdistettiin kromatografiällä Merck Kieselgel 60, 230 - 400 mesh -pylväässä (400 ml) .

Pylväs eluoitiin heksaani/etyyliasetaattiseoksella (2:1) ja saatiin väritön vaahto (1,429 g). Kiteyttäminen heksaa- 26 90663 nista antoi puhdasta otsikon tuotetta, sp. 203 °C.

[3]d +132 (c 1,21, CHClj) , \m (EtOH) 244 nm (f ^ 29 200), (CHBr3) 3540 (OH) , 1708 (C=0) , 992 (C-O) , S (CDC13) käsittää 4,29 (t7, 1H); 3,84 (S, 3H), 3,29 (dl5, 1H) .

5 Esimerkki 5 23[E]-hydroksi-imino-tekijä Ά

Esimerkin 3 tuote hydrolysoitiin edellä esimerkissä 3 esitetyn menetelmän mukaisesti ja saatiin tuote, joka puhdistettiin kromatografiällä Merck Kieselgel 60, 230 400 10 mesh -pylväässä (400 ml) eluoimalla heksaani/etyyliase- taattiseoksella (1:1), jolloin saatiin otsikon yhdistettä värittömänä vaahtona.

[ch]d +140 (c 1,24, CHClj) X^ (EtOH) 244 nm (t ltux 26 700), V1IUX (CHBr3) 3565, 3490 (OH), 1710 (C=0) , 994 (C-O), S 15 (CDC13) käsittää 8,11 (S, 1H); 4,29 (t7, 1H); 3,41 (dl5, 1H) .

Esimerkki 6

23[E]-etoksi-imino-tekijä A

Vedetöntä natriumasetaattia (140 mg) liuotettuna 20 veteen (3 ml) lisättiin liuokseen, jossa oli 23-keto-teki-jää A (200 mg, esimerkki 23 GB-patenttijulkaisussa 2 176 182) ja etoksiamiinivetykloridia (126 mg) metanolissa (20 ml). Kahden tunnin jälkeen 20 °C:ssa liuos laimennettiin eetterillä (40 ml) ja pestiin vedellä. Kuivattu orgaaninen 25 faasi haihdutettiin ja saatu valkea vaahto puhdistettiin kromatografiällä Merck Kieselgel 60, 230 - 400 mesh -pylväässä (90 ml). Pylvään eluutio heksaani/etyyliasetaatti-seoksella (2:1) antoi otsikon yhdistettä värittömänä vaahtona (189 mg).

30 [elä1 +125 (c 1,00, CHClj) (EtOH) 244 nm 28 200), vm„ (CHBr3) 3540, 3480 (OH), 1705 (C=0) , 990 (C-O), S (CDC1,) käsittää 4,30 (t7, 1H) ; 4,10 (q7, 2H) ; 3,31 (dl5, 1H); 1,24 (t7, 3H).

27 90663

Esimerkkien 7, 8 ja 9 yhdisteet valmistettiin samalla tavalla lähtöaineina 23-keto-tekijä A ja sopiva alk-oksiamiini.

Esimerkki 7 5 23[E]-allyyli-oksi-imiini-tekijä Ά [a]y +124° (c 1,17, CHClj) λ™, (EtOH) 244 nm ( ε 28 400), (CHBr3) 3550, 3490 (OH), 1708 (0=0) , 990 (c-O) , δ (CDClj) käsittää 5,98 (m, 1H) ; 5,28 (dd 17,2, 1H) : 5,15 (dd 9,2, 1H); 4,5-4,7 (m, 2H); 4,29 (t7, 1H); 3,36 10 (dl4, 1H) valmistettiin allyylioksiamiinihydrokloridista.

Esimerkki 8

23[E]-isopropyylioksi-imino-tekijä A

[<*]£' +116° (c 0,97, CHClj) λ (EtOH) 244 nm (ε* 25 000), (CHBr3) 3550, 3490 (OH), 1708 (0=0) , 15 992 (C-O), <S (CDClj) käsittää 4,2-4,4 (m, 2H) ; 3,30 (dl4, 1H) ; 1,21 (d7, 3H) ; 1,20 (d7, 3H) valmistettiin isopropyy-lioksiamiinihydrokloridistä.

Esimerkki 9

23[E]-butoksi-imino-tekijä A

20 [α]β +115° (c 1,10, CHC13) λ ^ (EtOH) 244 nm (εηωΧ 31 800), (CHBr3) 3540, 3460 (OH), 1708 (C=0) , 992 (C-O), δ (CDC13) käsittää 4,28 (t6, 1H) ; 4,03 (m, 2H) ; 3,96 (d6, 1H); 3,31 (dl4, 1H); 0,9 - 1,1 (m, 15H) valmistettiin n-butoksiamiinihydrokloridista.

25 Esimerkki 10 23[E]-metoksi-imino-tekijä A,5-asetaatti (i) Lisättiin sekoittaen 3 M metyylimagnesiumjodi-diliuosta eetterissä (0,16 ml) esimerkin 3 tuotteen (120 mg) liuokseen kuivassa heksametyylifosforitriamidissa (5 30 ml) typpiatmosfäärissä. Lisättiin jodimetaania (0,09 ml) ja tunnin kuluttua seos laimennettiin etyyliasetaatilla (30 ml) ja pestiin peräkkäin 2 N kloorivetyhapolla ja vedellä. Kuivattu orgaaninen faasi haihdutettiin ja keltainen kumimainen jäännös puhdistettiin kromatografiällä 28 90663

Merck Kieselqel 60, 230 - 400 mesh -pylväässä (80 ml) . Pylväs eluoitiin heksaani/etyyliasetaattiseoksella (2:1) ja saatiin otsikon yhdistettä valkoisena vaahtona.

[α]ο +123° (c 1,25, CHC13) λ max (EtOH) 245 nm (emax 30 300) 5 NMR oli kuten yllä esimerkissä 2.

(ii) Esimerkin 3 tuotetta (0,082 g) liuotettiin dietyylieetteriin (10 ml), joka sisälsi hopeaoksidia (0,4 g) , joka oli juuri valmistettu hopeanitraatista ja 2 M natriumhydroksidin vesiliuoksesta. Seosta sekoitettiin 10 huoneen lämmössä kaksi tuntia, minkä jälkeen se suodatettiin ja liuotin haihdutettiin, jolloin saatiin raakatuot-teena keltainen kumiraainen jäännös. Tämä jäännös puhdistettiin preparatiivisella ohutkerroskromatografiällä (Merck 5717) eluoimalla dikloorimetaani/asetoniseoksella 15 (25:1). Päävyöhyke uutettiin asetonilla ja haihdutettiin, jolloin saatiin otsikon tuotetta (0,059 g). NMR on esitetty yllä esimerkissä 2.

Esimerkki 11 23[E]-metoksi-imino-tekijän A 5-metyylikarbamaatti 20 Metyyli-isosyanaattia (0,13 ml, 125 mg) ja trietyy- liamiinia (2 tippaa) lisättiin 23[E]-metoksi-iminotekijää A (350 mg) sisältävään kuivaan dimetyyliformamidiin (0,75 ml). Pullo suljettiin ja kuumennettiin 5,5 tuntia 80 °C:ssa sekoittaen. Reaktioseos kaadettiin veteen 25 (50 ml) ja saatu seos suodatettiin piimään läpi. Suodos- kakku pestiin vedellä (150 ml) ja uutettiin tämän jälkeen dikloorimetaanilla (75 ml). Uute kuivattiin (MgS04) ja vä-kevöitiin, jolloin saatiin keltainen vaahto, joka puhdistettiin keskipainekromatografiällä silikapylväässä (125 g, 30 Merck Kieselgel 60, 230 - 400 mesh). Eluoitiin heksaani/-etyyliasetaattiseoksella (1:1) ja saatiin otsikon tuotetta valkoisena vaahtona (206 mg).

29 90663 [o]d +99 (c 0,55, CH2C12) (EtOH) 244,4 nm (ε mix 28 710), vmax (CHBr3) 3530 (OH), 3455 (NH) , 1720 (esteri), 1720 + 1510 (karbamaatti) ja 993 cm'1 (C-O) , S (CDCl3) käsittää 1,78 (s, 3H) ; 2,86 (d, 5 Hz, 3H) ; 3,29 (d, 14 Hz, 1H) ; 5 3,83 (s, 3H); 4,80 (q, 5 Hz, 1H) ja 5,50 (m, 2H).

Esimerkki 12 23[E]-metoksi-imino-tekijä A,5-metyylikarbonaatti

Liuokseen, jossa oli 23[E]-metoksi-imino-tekijää A (150 mg), dikloorimetaania (15 ml) ja pyridiiniä (0,3 ml), 10 lisättiin 0 °C:ssa sekoittaen metyyliklooriformaattia (0,7 ml 1,0 M liuos dikloorimetaanissa). Reaktioseos jätettiin 0-3 °C:seen 20 minuutiksi sekoittaen, minkä jälkeen se lisättiin dikloorimetaaniin (70 ml) ja pestiin 2 N kloorivetyhapolla (50 ml) ja vedellä (50 ml) . Orgaaninen 15 faasi kuivattiin (MgS04) ja liuotin poistettiin, jolloin saatiin vaahto, joka puhdistettiin keskipainekromatogra-fialla silikapylväässä (40 g, Merck Kieselgel 60, 230 400 mesh). Eluoitiin dikloorimetaani/etyyliasetaattiseoksella (30:1), jolloin saatiin otsikon tuotetta valkoisena vaah-20 tona (127 mg).

[a]d +145° (c 0,41, CH2C12) , λ „„ (EtOH) 244,4 nm ( 32 210), (CHBr3) 3460 + 3540 (OH) 1742 (karbonaatti) , 1710 (esteri) ja 992 cm'1 (C-O) , δ (CDC13) käsittää 1,82 (s, 3H); 3,29 (d, 14 Hz, 1H); 3,82 (s, 3H); 25 3,29 (d, 14 Hz, 1H); 3,82 (s, 3H) ; 3,83 (S, 3H); 5,2 - 5,4 (m, 3H); 5,56 (s, 1H).

Esimerkki 13 23[E]-metoksi-imino-tekijä D,5-asetaatti 23-keto-tekijä D,5-asetaattia (251 mg, esimerkki 30 119 GB-patenttijulkaisussa 2 176 182), natriumasetaattia (250 mg) ja metoksiamiinivetykloridia (250 mg) sisältävää metanoliliuosta (40 ml) pidettiin 20 °C:ssa 24 tuntia, vä-kevöitiin noin 10 ml:ksi, laimennettiin etyyliasetaatilla (50 ml) ja pestiin peräkkäin 0,5 N kloorivetyhapolla ja 30 90663 vedellä. Kuivattu orgaaninen faasi haihdutettiin, jolloin saatiin keltainen vaahto, joka puhdistettiin kromatogra-fialla Merck Kieselgel 60, 230 - 400 mesh -pylväässä (120 ml) . Pylvään eluutio heksaanilla antoi otsikon yhdis-5 tettä vaaleankeltaisena vaahtona (144 mg); (EtOH) 244 nm (ε 26 400) , v max (CHBr3) (cm1) 3500 (OH), 1732 (OAc) , 1710 (C=0) , 5 (CDC13) käsittää 5,54 (m, 2H) ; 4,92 (m, 1H); 3,84 (s, 3H); 3,32 (m, 1H); 3,30 (dl4, 1H) ; 2,17 (s, 3H); 1,91 (dl4, 1H); 1,76 (s, 3H); 1,63 (s, 3H); 10 1,51 (s, 3H) ; 1,01 (t7, 3H); 0,99 (d6, 3H) ; 0,92 (d6, 3H) .

Esimerkki 14

23[E]-metoksi-imino-tekijä D

Esimerkin 13 tuotetta (140 mg) ja 1 N natrium-hydroksidia (0,6 ml) sisältävää metanoliliuosta (8 ml) 15 sekoitettiin jäähauteella 1,5 tuntia. Liuos laimennettiin etyylisetaatilla (30 ml) ja pestiin peräkkäin IN kloori-vetyhapolla ja vedellä. Kuivattu orgaaninen faasi haihdutettiin, jolloin saatiin keltainen vaahto, joka puhdistettiin kromatografiällä Merck Kieselgel 60, 230 - 400 20 mesh -pylväässä (50 ml). Pylvään eluutio heksaani/etyyli-asetaattiseoksella (2:1) antoi otsikon yhdistettä valkeana vaahtona (105 mg).

[α]ρ +96° (c 1,38, CHClj) , λ ^ (EtOH) 244 nm

(ε26 700), (CHBr3) (cm1) 3550, 3500 (OH), 1710 (C=0) , S

25 (CHC13) käsittää 4,93 (m, 1H) ; 4,30 (t6, 1H) ; 3,95 (d6, 1H); 3,84 (s, 3H); 3,30 (dl4, 1H); 3,27 (m, 1H); 1,88 (s, 3H) ; 1,64 (s, 3H) ; 1,52 (s, 3H); 1,01 (t7, 3H) ; 1,00 (d6, 3H); 0,92 (d6, 3H)

Esimerkki 15

30 23[E]-metoksi-imino-tekijä B

23-keto-tekijää B (1 g, esimerkki 19 GB-patentti-julkaisussa 2 176 182), natriumasetaattia (400 mg) ja me-toksiamiinivetykloridia (400 mg) sisältävää liuosta sekoitettiin 20 °C:ssa 20 tuntia, väkevöitiin noin 10 ml:ksi.

3i 90663 laimennettiin etyyliasetaatilla ja pestiin vedellä. Orgaaninen faasi pestiin peräkkäin 0,5 N kloorivetyhapolla ja vedellä, kuivattu orgaaninen faasi haihdutettiin ja raa-katuote puhdistettiin kromatografiällä Merck Kiselgel 60, 5 230 - 400 mesh -pylväässä (200 ml). Pylvään eluutio etyy- liasetaatti/dikloorimetaaniseoksella (1:9) antoi otsikon yhdistettä valkoisena vaahtona (500 mg).

[e]J +120° (c, 1,09, CHClj) , (EtOH) 244 nm (£30 100), Vm>x (CHBr3) (cm1) 3540, 3460 (OH), 1708 (C=0) , δ 10 (CDC13) käsittää 5,46 (q6, 1H) ; 4,03 (d5, 1H) ; 3,97 (d5, 1H); 3,82 (s, 3H); 3,50 (s, 3H); 3,32 (m, 1H); 3,29 (dl4, 1H); 1,82 (s, 3H); 1,68 (d6, 3H); 1,00 (d6, 3H); 0,92 (d6, 3H) .

Esimerkki 16

15 23[E]-metoksi-imino-tekijä C

Vedetöntä natriumasetaattia (0,54 g) ja metoksi-amiinivetykloridia (0,58 g) lisättiin 23-keto-tekijää C (1,97 g, esimerkki 12 GB-patenttijulkaisussa 2 176 182) ja vettä (5 ml) sisältävään metanol il luokseen (30 ml) ja 20 seosta sekoitettiin 30 minuuttia huoneen lämmössä. Lisättiin etyyliasetaattia (30 ml) ja 0,5 M kloorivetyhappoa (30 ml) ja vesifaasia uutettiin uudelleen etyyliasetaatilla (15 ml). Yhdistetyt orgaaniset faasit pestiin peräkkäin 0,5 M kloorivetyhapolla, 5-%:isella kyllästetyllä natrium-25 bikarbonaattiliuoksella ja 10-%:isella kyllästetyllä nat-riumkloridiliuoksella, minkä jälkeen liuos väkevöitiin va-kuumissa keltaiseksi vaahdoksi, joka puhdistettiin kromatograf iällä Merck 9385 -silikageelillä, jolloin pylväs aluksi kehitettiin dikloorimetaanilla ja sen jälkeen elu-30 oitiin dikloorimetaanilla, joka sisälsi pienen määrän etyyliasetaattia (enintään 10 %), jolloin saatiin otsikon yhdistettä (1,0 g).

32 90663 [α]η +64 (c 1,00, CH30H) , ιΗ ΝΜΚ (CDC13) käsittää seuraavat signaalit 4,95 (m, 1H); 4,29 (t, 1H, 7 Hz); 3,96 (d, 1H, 7 Hz); 3,85 (s, 3H, = NOCH3) ; 3,66 (d, 1H, 10 Hz); 1,51 (s, 3H) ; 1,42 (t, 1H, 12 Hz); IR (CHBr3) 3620 - 3340 cm1 5 (-OH), 1711 cm1 (C=0).

Claims (2)

33 90663

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten mak-rolidiyhdisteiden valmistamiseksi, joilla on kaava (I)

5 NOR2 JL .xCH3 ch3 h ^ il" X. ch, »\ ' η . r° iV ,Λ Li \ h I CH3 1^'h R (1) H10v °^cr° \ I ?h]> 15 ifl o_L* V"-. uCH3 H I 3 jossa OR R1 on metyyli, etyyli tai isopropyyli;

20 R2 on vety, alempi alkyyli tai allyyli, ja ryhmä =NOR2 on E-konfiguraatiossa; ja OR3 on hydroksyyliryhmä tai ryhmä -OR4, -OCOR4 tai -0C02R4, joissa R4 on alempi alkyyli, tai ryhmä -OCONR*R9, jossa RK ja R9 ovat kumpikin itsenäisesti vety tai alempi alkyyli, 25 tunnettu siitä, että (A) yhdiste, jolla on kaava (II) O CH3 CH3 I H 1 30 ch3""K γ;Η hXr‘ \ °^c/° un l OH °4/CH3 OR3 34 90663 jossa R1 ja OR3 ovat edellä määritellyt, saatetaan reagoimaan reagenssin H2NOR2 tai sen suolan kanssa, jossa R2 on edellä määritelty, tai (B) kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, 5 jossa OR3 on hydroksyyliryhmä, pelkistetään yhdiste, jolla on kaava (III) NOR2 CH CH s' 3 10 Γ^ρ, oj I \ j 1Ύ ch3'"·^ tCh ^ R1 H Λ o (III)

15 S, 'T H I OH

0 Kr cH 3 20 H 0 jossa R1 ja R2 ovat edellä määritellyt, ja haluttaessa suoritetaan yksi tai useampi seuraavista reaktioista: 25 (i) hydrolysoidaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa OR3 on ryhmä -OR4, -OCOR4, -0C02R4 tai -OCONRV, vastaavan kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa OR3 on hydroksyyliryhmä, (ii) kaavan I mukainen yhdiste, jossa R2 on alempi 30 alkyyli tai allyyli ja OR3 on hydroksyyliryhmä, eetteröi- dään tai asyloidaan vastaavan kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa OR3 on ryhmä -OR4, -OCOR4, -0C02R4 tai -OCONR*R9, ja (iii) kaavan I mukainen yhdiste, jossa R2 on vety ja 35 90663 OR3 on ryhmä -OR4, -OCOR4, -0C02R4 tai -OCONR*R9, saatetaan reagoimaan eetteröivän yhdisteen R2Y kanssa, jossa R2 on alempi alkyyli tai allyyli ja Y on poistuva ryhmä, vastaavan kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa R2 5 on alempi alkyyli tai allyyli.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R1 on isopropyyli, R2 on metyyli ja R3 on hydroksyyliryhmä. 36 90663