CN1300305C - 腺苷产生菌以及发酵生产腺苷的方法 - Google Patents

Abstract

提供了一种腺苷产生菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JSIM-1025，还提供一种生产高产量腺苷的发酵方法，利用包括1.8%的最适浓度酵母膏的最佳培养基组分，最适PH6.5和40%的最适溶氧控制范围的发酵条件，在37℃下发酵60小时后的产苷能稳定在23克/升以上。

Description

腺苷产生菌以及发酵生产腺苷的方法

技术领域

本发明涉及新的微生物菌株，以及利用该菌株生产其代谢产物的发酵方法。具体地说，本发明涉及一种高产量腺苷产生菌，还涉及一种生产腺苷的发酵方法，利用最佳培养基组分，最适PH和溶氧控制范围的生产腺苷的最优发酵工艺条件，获得了高产量的腺苷。

背景技术

腺苷又称腺嘌呤核苷^[2]，是人体循环系统疾病的药物。因为腺苷有促进冠扩张及心肌代谢的机能，扩张血管，增加冠血量的药理作用因此可以用于冠状血管障碍、狭心症、动脉硬化症及高血压症等疾病的治疗。此外，腺苷及其衍生物可以作为抑制血液凝固药物使用，用腺苷来保藏血液效果特好。

腺苷是合成三磷酸腺苷(ATP)的主要原料，ATP已被广泛应用于治疗心不全、脑动脉硬化及肌肉萎缩等症。国内腺苷生产方法主要从酵母中提取RNA后，降解获得。RNA降解得到的4种核苷中除腺苷外，其它三种核苷在国内需求量很小，开发应用还需要等待一段时间，销售价格很便宜。如果为了生产ATP而从降解RNA获取腺苷原料，导致腺苷生产成本非常昂贵，由此而限制了国内ATP的生产量。我国每年所需ATP大部分依赖进口，ATP每年进口量约50吨左右，每吨价格约160万元，耗费大量外汇。

发明内容

本发明一方面提供了一种腺苷产生菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JSIM-1025，它的遗传标记为：黄嘌呤、组氨酸、硫胺素三重营养缺陷型(简写为Xan-、His-、Thi-)，鸟苷酸还原酶、腺苷酸脱氨酶缺失(GMP red^-、Deam^-)，8-杂鸟嘌呤抗性，其代谢途径见附图1。该菌株已于2005年1月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1304。

本发明另一方面提供了一种生产高产量腺苷的发酵方法，将前述菌株在最佳培养基组分，最适PH的发酵培养基中，以最适溶氧控制范围条件下进行通气搅拌培养，获得了高产量的腺苷。

所述发酵方法的温度为34-38℃，通风量为1∶0.3-0.6，发酵周期为50-72小时，优选为64～66小时。

所述方法使用的发酵培养基中酵母膏浓度为1.0-2.0％，优选酵母膏的浓度为1.8％。

所述方法使用的发酵培养基中豆饼水解液浓度为1.5％。

所述发酵过程控制培养基的pH在5.8-7.2，最适pH为6.5。

所述发酵方法中通气搅拌培养的溶氧范围控制在30~50％，优选溶氧范围为40％。

发明详述

一、高产量腺苷产生菌的制备

以本实验室选育的肌苷产生菌JSIM-1019作为出发菌株，用物理、化学诱变剂对亲株进行诱变处理，所述的诱变剂为紫外线、甲基磺乙酯、亚硝基胍对肌苷产生进行诱变育种，紫外线照射时间为0.5-3min，甲基磺乙酯的浓度为0.5％-2％，处理时间为15-45min，亚硝基胍浓度为300μg/ml-500μg/ml，处理时间30-50min，处理方法为连续或相间，得到一系列突变子，然后再对突变子遗传性能进行累加性选育，获得了一批黄嘌呤营养缺陷型突变株。将黄嘌呤营养缺陷型突变株接种在种子培养基中，34℃培养18小时，然后以10％接种量接种到发酵培养基中，36℃培养72小时后，选择在发酵培养基中积累腺苷最多的突变子，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JSIM-1025。

二、高产量腺苷的发酵生产

(1)摇瓶种子培养方法

将生长良好的斜面培养物接种至种子培养基中，接种量为5-10％，在温度30-36℃下，摇床转速为110r/min，培养8-18小时。

(2)摇瓶发酵培养

将生长良好的种子液接种到摇瓶发酵培养基中，在温度30-37℃，摇床转速为110r/min，培养50-72小时。

(3)30M³罐发酵培养

发酵培养基装量21M³，120℃灭菌10分钟，接种量10％，34-38℃，控制30～50％溶氧范围，优选溶氧为40％，通气搅拌培养，通风量1∶0.3-0.6，发酵周期为50-72小时，优选为64～66小时，发酵过程中控制培养基的pH在5.8-7.2，优选pH为6.5。

三.发酵液产物定性鉴定和定量测定

①纸层析溶剂系统定性鉴定

纸层析溶剂系统

I正丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶1

II正丙醇∶NH4OH∶水＝20∶12∶3

III饱和硫酸铵∶异丙醇∶IN醋酸钠＝40∶1∶9

②电泳定性定量鉴定

电泳缓冲液系统

I0.05M柠檬酸缓冲液(pH 3.5)

II10％醋酸

样品点正极，电压500v，时间2小时。

②腺苷定量测定

培养液在沸水浴中加热10分钟，4000rpm离心5分钟，点样，点样量5μl，10％醋酸缓冲液500伏电泳2小时，在紫外层析灯下出现紫外荧光斑点，用5ml 0.1N HCl浸出后，然后用紫外分光光度计在260nm处测定洗脱液的O.D值，计算出腺苷含量。

上述发酵周期测得腺苷产量稳定在23(g/l)以上。

有益效果

本发明获得了一株黄嘌呤、硫胺素、组氨酸三重缺陷型，鸟苷酸还原酶、腺苷酸脱氨酶缺失及8-氮鸟嘌呤抗性的高产量腺苷产生菌，本发明还获得了发酵生产腺苷的最优发酵条件，利用本发明的高产菌株，以及本发明选择的最适酵母膏的浓度，最适PH，最适溶氧量，在37℃下发酵60小时后的产苷量稳定在23克/升。

附图说明

附图1腺苷产生菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JSIM-1025的代谢途径。

具体实施方式

实施例1    腺苷的摇瓶发酵生产

1、斜面菌种培养

斜面培养基的制备：

土豆汁              1000毫升

酪蛋白水解液        0.1

鸟嘌呤              25γ/ml

PH                  7.0

将JSIM-1025菌种接种到上述斜面培养基上，在温度30-34℃培养24-28小时。

2、摇瓶种子培养

种子培养基(％)的制备：

葡萄糖              1

酵母膏              0.5

蛋白胨                    0.5

牛肉膏                    0.5

氯化钠                    0.2

PH                        7.2

接一环生长良好的斜面培养物装至有30毫升种子培养基的500ml三角瓶中培养，摇瓶转速为110r/min，温度33-34℃，培养14-18小时。

3、摇瓶发酵培养

发酵培养基(％)：

葡萄糖                    10

酵母膏                    1.8

豆饼水解液                1.5ml/100ml

K₂HPO₄                  0.3

MgSO₄                    0.1

MnSO₄                    0.001

FeSO₄                    0.001

KCl                       0.2

CaCO₃                    3

NH₄SO₄                 1.5

PH                        6.5

将生长良好的种子液2毫升接种至装有20毫升发酵培养基的500ml三角瓶中培养，接种量10％，摇床转速为110r/min，温度36-37℃，培养72小时。

实施例2    30M³罐腺苷发酵生产

1.茄子瓶斜面培养

培养基配方与实施例1斜面培养相同。

2.3M²罐种子培养

培养基配方与实施例1种子摇瓶培养相同。

3M²罐装液2.1M²。灭菌后接入茄子瓶斜面菌种5瓶，通风量1∶0.2-0.5，培养时间8-10小时，温度33-34℃。

3.30M³罐腺苷发酵

将上述发酵培养基装量21M³，120℃灭菌10分钟，接种量10％，37℃，在40％的溶氧范围通气搅拌培养，通风量1∶0.3-0.6，培养过程中pH控制在6.5左右，培养至64-66小时。

发酵过程中定时取样测定残余葡萄糖含量，发酵液OD以及腺苷含量。

实施例3    腺苷提取

将上述发酵结束获得的发酵液加热到90℃，过膜去菌体，60℃浓缩后4℃冷冻24-36小时。3000rpm离心得到粗品。活性炭脱色得到成品。纯度98％以上。母液再处理，总收率80％以上。在实施例2中培养至64小时，腺苷产量23.50(g/l)。

Claims (4)

1.一种生产腺苷的新菌株，其特征是以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)肌苷产生菌为亲株，采用化学、物理诱变剂处理细胞，使亲株核酸代谢关键酶缺失或形成，遗传标记的回复获得新的遗传标记，完成了新的突变株，该突变株不再积累肌苷而积累大量腺苷，新的遗传标记为：黄嘌呤、组氨酸、硫胺素三重缺陷型(缩写为Xan^-、His^-、Thi^-)，鸟苷酸还原酶、腺苷酸脱氨酶缺失(GMPred^-、Deam^-)，8-氮鸟嘌呤抗性(8-AG^r)，新菌株的保藏号为CGMCC No.1304。

2.一种发酵生产腺苷的方法，包括将权利要求1所述的菌株在含有浓度为1.0-2.0％的酵母膏的培养基中通气搅拌培养，控制此发酵过程中培养基的pH在5.8-7.2，通气量为1∶0.3-0.6，溶氧范围控制30～50％；

所述发酵培养基(％)是：

葡萄糖                            10

酵母膏                            1.8

豆饼水解液                        1.5ml/100ml

K₂HPO₄                          0.3

MgSO₄                            0.1

MnSO₄                            0.001

FeSO₄                            0.001

KCl                               0.2

CaCO₃                            3

NH₄SO₄                          1.5

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于发酵过程控制培养基的pH为6.5。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述溶氧范围为40％。

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